Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Структура Y хромосомы человека и ее функции
1.2. Микроделеции Y хромосомы 15
1.3. Частичные делеции AZFc субрегиона 21
1.4. Разнообразие гаплогрупп Y хромосомы среди популяций мира . 25
1.5. Исследование гаплогрупп Y хромосомы и мужское бесплодие 29
1.6. Структура и функция митохондриального генома 33
1.7. Распределение гаплогрупп мт ДНК среди популяций мира 36
1.8. Митохондриальный геном и бесплодие у мужчин 39
Глава II. Материалы и методы 43
II. 1. Материалы исследования 43
П.2. Методы исследования 44
П.2.1. Выделение геномной ДНК 44
И.2.2. Анализ AZF региона длинного плеча Y хромосомы 45
П.2.3. Исследование gr/gi-делеций длинного плеча Y хромосомы . 48
И.2.4. Анализ полиморфизма диаллельных локусов Y-хромосомы . 51
II.2.5. Анализ мутаций в кодирующем регионе мтДНК, ассоциированных с гаплогрупами 58
И.З. Статистическая обработка результатов 62
Глава III. Результаты исследования и обсуждение 63
Ш.1. Анализ микроделеции AZF региона Y хромосомы 63
Ш.2. Исследование частичных делеций AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе 86
Ш.З. Анализ гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза 94
Ш.3.1. Анализ частот гаплогрупп Y хромосомы в группе больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе 95
Ш.3.2. Анализ частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе, несущих частичные делеции AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы. 117
IIL3.3. Анализ частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза, несущих микроделеции AZF региона 120
Ш.4. Анализ частот гаплогрупп мтДНК у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе 123
Заключение 142
Выводы 151
Список литературы 152
- Структура Y хромосомы человека и ее функции
- Разнообразие гаплогрупп Y хромосомы среди популяций мира
- Анализ AZF региона длинного плеча Y хромосомы
- Исследование частичных делеций AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе
Введение к работе
Бесплодием страдает около 15% супружеских пар, при этом, в 45-50% случаев оно связано с «мужским фактором». Приблизительно у 5% мужчин репродуктивного возраста имеются различные отклонения количественных или качественных показателей спермы. Около 1/3 случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, большинство случаев которого может быть обусловлено генетическими факторами, такими как различные нарушения хромосом или мутации в ответственных за сперматогенез генах [Tiepolo L.et al., 1976; Krausz С, et al. 2001].
Тотальное ухудшение качества спермы отразилось в изменении эталонных норм показателей сперматогенеза. Если в 1921 году нормальной считалась концентрация 100 млн. сперматозоидов/мл, пограничной 60 млн./мл, то через 30 лет эта цифра достигла 40 млн./мл, а, согласно Руководству ВОЗ, в 1992 году нижней границей нормальной концентрации сперматозоидов стали считать 20 млн./мл [World Health Organization, 1992]. Поэтому особое значение приобретает выявление факторов мужского бесплодия, диагностика и лечение, особенно, у молодых людей. Причиной генетически обусловленного мужского бесплодия, связанного с нарушением сперматогенеза, в 10-15% случаев являются структурные нарушения Y-хромосомы [Chandley А.С. et al., 1994; Vogt Н. et al., 1996]. Роль Y хромосомы в репродуктивной медицине неоспорима, так как на ней расположен основной детерминирующий пол человека ген SRY (sex-determining region Y) и множество генов, экспрессирующихся при сперматогенезе. Помимо хромосомных аномалий наиболее частой генетической причиной нарушения репродуктивной функции у мужчин являются делении AZF локуса длинного плеча мужской половой хромосомы [Vogt et al., 1996]. AZF - микроделеции являются причиной нарушения сперматогенеза в 10-15% случаев при азооспермии и в 5-10% при олигозооспермии тяжелой степени.
В последние десятилетия стали придавать большое значение роли мутаций митохондриального генома в развитии заболеваний человека, в том числе и в нарушении сперматогенеза.
Хотя есть и значительные достижения в области исследования генетических причин нарушения сперматогенеза, остается много невыясненных вопросов, касающихся гено-фенотипических корреляций, а также неясно, существуют ли популяционные различия в частоте и распространенности мутаций Y хромосомы и мтДНК у мужчин с бесплодием различной этнической и географической принадлежности.
В последние годы в связи с развитием и внедрением в медицину современных молекулярно-генетических и цитогенетических методов удалось установить генетическую природу ряда форм мужского бесплодия. Продолжающиеся исследования генетических причин нарушения сперматогенеза расширяют возможности в понимании этиопатогенеза данного заболевания, а также способствует проведению более глубокого генетического обследования. Выявление причин бесплодия необходимо для определения прогноза и выбора наиболее эффективного метода лечения.
Цель и задачи исследования.
Целью исследования являлось изучение AZF региона Y хромосомы, анализ гаплогрупп митохондриальной ДНК и Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Определить спектр и частоты микроделеций AZF региона Y
хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе
фертильных мужчин.
2. Провести анализ гено-фенотипических корреляций у больных с разной
степенью тяжести нарушения сперматогенеза.
Исследовать частичные делеции AZFc субрегиона gr/gr и Ь2/Ь3 у больных с нарушением сперматогенеза и в группе контроля.
Провести анализ распределения частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе.
Провести анализ распределения частот гаплогрупп мтДНК у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе.
Научная новизна
Впервые проведен анализ спектра и частот микроделеций AZF региона
Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза татарской, русской и
башкирской этнической принадлежности. Впервые выявлена ассоциация
частичной gr/gr делеции AZFc субрегиона с гаплогруппой N Y хромосомы у
мужчин Волго-Уральского региона. Впервые выявлено, что гаплогруппа Rlb3
Y хромосомы является маркером пониженного риска нарушения
сперматогенеза у мужчин башкирской этнической принадлежности. Впервые
выявлена ассоциация гаплогруппы С мтДНК с нарушением сперматогенеза у
башкир. Впервые обнаружено, что гаплогруппа Т мтДНК у лиц башкирской
этнической принадлежности и гаплогруппа V мтДНК у мужчин татарской
этнической группы являются факторами пониженного риска нарушения
сперматогенеза.
Научно-практическая значимость
Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития нарушения сперматогенеза. Исследование микроделеций AZF региона Y хромосомы может быть использовано в практике урологов и андрологов для выявления генетически обусловленного бесплодия. Анализ гаплогрупп Y хромосомы и мтДНК может применятьтся для опеделения лиц с повышенным или пониженным риском развития нрушения сперматогенеза и проведения досимптоматической профилактики заболевания. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту:
Частота и спектр микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза.
Частота и спектр микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с олигозооспермией тяжелой степени, с азооспермией и у больных с другими формами патозооспермии.
Ассоциация gr/gr делеции AZFc субрегиона с N гаплогруппой Y хромосомы у мужчин татарской, русской и башкирской этнической принадлежности
Пониженный риск нарушения сперматогенеза у башкир - носителей гаплогруппы Rlb3Y хромосомы.
Ассоциация гаплогруппы С митохондриальной ДНК с нарушением сперматогенеза у башкир.
Пониженный риск нарушения сперматогенеза у лиц башкирской этнической принадлежности с гаплогруппой Т мтДНК и у мужчин татарской этнической группы с гаплогруппа V мтДНК.
Структура Y хромосомы человека и ее функции
С момента открытия Y хромосомы в 1921 г. перед научным сообществом встала проблема определения ее роли и значения для человека. Множественные тандемные повторы сателлитной ДНК Y хромосомы долгое время рассматривались как «генетическая пустошь», необходимая лишь для детерминации пола. Основным предположением было то, что в ходе эволюции Y хромосома будет уничтожена [Marchall J.A. et al., 2000; Aitken J.R. et al., 2002;]. Эта точка зрения была опровергнута недавно после определения неожиданного разнообразия генов Y хромосомы, множество из которых имеют повсеместную экспрессию. Также была обнаружена система коррекции, сохраняющая гены Y хромосомы, и феномен постепенного накопления вредных мутаций [Repping S. et al., 2002; Skaletsky H. et al., 2003]. Кроме того, потеря или перестройка Y хромосомы ассоциирована с множеством других фенотипов, таких как синдром Шерешевского-Тернера [Zinn A.R. et al., 1998], скелетные аномалии [Rao F. et al., 1997] и развитие редкого типа гонадобластомы [Lau Y.F. et al., 1999].
Y-хромосома - одна из самых маленьких хромосом в геноме человека-имеет размер около 60МЬ, 30 из которых приходятся на эухроматиновые домены, а остальное - на гетерохроматиновый блок в дистальном участке длинного плеча, который может сильно варьировать по размеру у разных индивидов. В связи со структурными особенностями в Y хромосоме выделяют следующие области [Lahn et al., 1997]: - псевдоаутосомные области (PARs); - эухроматиновую область короткого плеча (Ypl 1); - эухроматиновую область проксимальной части длинного плеча (Yql 1); - гетерохроматиновую область дистальной части длинного плеча (Yql2); - область прицентромерного гетерохроматина.
Кроме этого, существует другая классификация, по которой при описании Y хромосомы человека, касающегося ее функциональной характеристики, исследователи выделяют только две области: 1) два псевдоаутосомных региона (PAR 1, PAR 2), гомологичные нуклеотидной последовательности X хромосомы и ответственные за корректную рекомбинацию между двумя половыми хромосомами во время зиготены и пахитены профазы I мейоза;
2) специфично мужской регион Y хромосомы (MSY), ранее именуемый «нерекомбинирующим регионом», в определенных районах которого вместо классической рекомбинации возможна нереципрокная внутрихромосомная рекомбинация между прямыми повторами ДНК. Этот регион составляет 95% всей длины Y хромосомы [Skaletsky et al., 2003].
Гетерохроматиновая область длинного плеча Г-хромосомы является генетически инертной. В ее состав входят три участка: первый - центромерный имеет длину примерно 1 млн. п.н., второй - более обширный, имеет протяженность более 40 миллионов п.н. и находится в дистальной части длинного плеча Y хромосомы. Третий гетерохроматиновый блок содержит всего 400 тысяч пар нуклеотидов, представлен в виде 3000 тандемных повторов длиной 125 п.н., локализован в проксимальной части длинного плеча. В целом, гетерохроматиновые участки содержат как минимум шесть различных типов повторяющихся последовательностей [Lahn et al., 1997; Skaletsky et al., 2003].
После полного секвенирования Y хромосомы в 2003 году в MSY регионе выделили три класса эухроматиновых участков [Skaletsky et al., 2003]:
1) Xransposed регион - это последовательность нуклеотидов, расположенная в средней части длинного плеча Y хромосомы, имеет размер около 3,4 миллиона п.н. и на 99% идентична Xq21. Данная область была образована в результате массивной транспозиции нуклеотидной последовательности X хромосомы на Y хромосому, произошедшей около 3-4 миллионов лет назад, после дивергенции линий шимпанзе и человека. Внутри описываемого региона было идентифицировано всего два гена (TGIF2LY кодирует транскрипционный фактор и PCDH11Y - Protocadherin 11 Y), остальная часть представлена повторами Alu-семейства и LINE1, ретровирусными последовательностям.
2) X-degenerate регион - это участок эухроматина Yq, в состав которого входят однокопийные гены и псевдогены. Идентичность с X хромосомой здесь варьирует от 60% до 96%. Также в этом регионе обнаружены последовательности древних аутосомных хромосом, возраст которых оценивается примерно в 40 миллионов лет. Основной полдетерминирующий ген SRY тоже входит в состав этого региона, его происхождение объясняют транпозицией, произошедшей около 300 миллионов лет назад [Sinclair et al., 1990; Skaletsky et al., 2003; Rozen et al., 2003].
3) Регион ампликонов - это нуклеотидная последовательность, где наблюдается самая высокая плотность генов [Hurles and Jobling, 2003]. В отличие от генов региона X-degenerate, имеющих повсеместную экспрессию, гены и факторы транскрипции, кодируемые ампликонами, экспрессируются исключительно только в тестикулярных тканях. Общая длина участка ампликонов составляет 10,2 млн. п.н.
Разнообразие гаплогрупп Y хромосомы среди популяций мира
Гаплогруппы Y хромосомы определяются путем анализа медленно мутирующих бинарных маркеров MSY региона. До настоящего времени идентифицировано более 500 однонуклеотидных полиморфизмов, включая инсерции и делеции, детально разработано филогенетическое древо Y хромосомы [Y chromosome Consortium, 2002; Jobling М.А. et al., 2003]. Мультиаллельные маркеры, такие как микросателлитные повторяющиеся последовательности Y хромосомы, имеют высокую скорость накопления мутаций (около 2x10"3 на локус за поколение) и используются для определения гаплотипов внутри каждой из гаплогрупп, что дает возможность разобраться во внутреннем разнообразии гаплогрупп Y хромосомы. Кроме того, большое количество микросателлитных локусов хорошо демонстрирует тонкую взаимосвязь между популяциями, что не может быть обнаружено при простом анализе гаплогрупп Y хромосомы.
Согласно классификации, принятой на Консорциуме, собравшем исследователей Y хромосомы со всего мира, в филогенетическом древе Y-хромосомы выделяют 18 основных кластеров, которые обозначаются заглавными буквами латинского алфавита (A-R). Эта классификация включает примерно 250 маркеров, по которым можно выделить примерно 160 конечных кластеров, характеризующихся определенным аллельным состоянием группы последовательных по происхождению бинарных маркеров (рис. 3) [YCC, 2002].
Современное многообразие линий Y-хромосомы сходится к одному предковому варианту, иначе его называют корнем филогенетического древа. Наиболее близкими к корню Y - хромосомного древа оказались гаплогруппы, характерные для жителей Африки [Hammer M.F. et al., 1998]. Первые две гаплогруппы А и В, ответвляющиеся сразу у основания филогенетического дерева, характерны только для жителей Африки [Underhill Р.А. et al., 2000; Semino О. et al., 2002], а остальные 16 распределены по всем континентам [Underhill Р.А. et al., 2001]. Y-хромосомные гаплогруппы, распространенные за пределами Африки, делятся на три основные группы, представляющие собой основные ответвления от единого узла - предковой линии, несущей мутацию Ml68. Первой группой, ответвляющейся из этого узла, является гаплогруппа С, наиболее древняя из числа всех евразийских гаплогрупп. Считается, что транзиция М130, определяющая эту гаплогруппу, впервые возникла у представителей южной Азии [СареШ С. et al., 2001; Underhill Р.А. et al., 2001]. Данная гаплогруппа распространена преимущественно в Юго-Восточной Азии (Китай, Индонезия, Филиппины), Австралазии (аборигены Австралии, жители Новой Гвинеи), островах Тихого океана (маори, французская Полинезия, Самоа), Японии [Lell et al., 1997, 2002; Underhill et al., 2000; Karafet et al., 2001; Степанов, 2002; Zerjal et al., 2003; Zegura et al., 2004]. 2002).
Филогенетическое древо гаплогрупп Y-хромосомы (по YCC Представителей второй группы выделяют на основе мутации YAP, которая в свою очередь подразделяется на гаплогруппу Е, определяемую на основе маркеров М40, М96 и SRY8299 и гаплогруппу D, характеризующуюся транзицией Ml74. Гаплогруппа Е первоначально дифференцировалась в самой Африке, и в настоящее время эта ветвь широко распространена на всем континенте [Cruciani F. et al, 2002, 2004; Lius J.R. et al., 2004]. В большинстве европейских популяций на долю этой гаплогруппы приходится менее 10 % Y хромосом, однако в Южной Европе ее частота достигает почти 30 % [Underhill, 2001; Hammer et al., 2000; Scozzari et al., 2001; Semino et al., 2004; Cirmioglu et al., 2004].
Гаплогруппа D характерна, в основном, для жителей Восточной Азии: Тибета, Японии, Андаманских островов. Вместе с тем, она редко обнаруживается в центральных регионах Азии в силу того, что замещается более поздними переселенцами [Underhill Р.А. et al., 2001; Thangaraj К. et al., 2003].
Третий кластер F включает в себя все остальные гаплогруппы от G до R. Определяется при помощи маркера М89 [YCC, 2002] и является наиболее распространенным на территории Евразии [Underhill P. A. et al., 2003; Kivisild et al., 2003]. Две производные группы данного кластера J и G рассредоточены по всей западной Евразии, но самая высокая частота этих гаплогрупп наблюдается на территории Передней Азии и Кавказа [Semino О. et al., 1996, 2000, 2004; Cinniouglu С. et al., 2004]. Галогруппа I наиболее широко представлена в Европе, что объясняют тем, что мутация Ml70 возникла в пределах этого континента [Semino О. et al., 2000; Passarino G. et al., 2002; Barac L. et al., 2003; Rootsi S. et al., 2004].
Анализ AZF региона длинного плеча Y хромосомы
ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew С.С., 1984]. Кровь набирали в стеклянные пробирки с консервантом. В качестве консерванта использовался глюгицир в соотношении с кровью 1:4.
Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера. Состав сахарозы выглядел следующим образом: 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCb, ЮмМ трис-НС1, рН 7,6. Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 10 минут. Далее, надосадочную жидкость опять сливали, к осадку добавляли 800 мкл буфера буфера Soline ЭДТА, содержащего 25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl. Затем ресуспензировали полученный раствор и переносили его в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки. Туда же прибавляли 40 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (Юмг/мл) и инкубировали образец при 37С в течение 16 часов. После этого последовательно проводили экстракцию ДНК растворами забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, рН 7,8) объемом ЮООмкл, фенола (500мкл) и хлороформа -изоамилового спирта (29:1) объёмом 500 мкл, хлороформа-изоамилового спирта (ЮООмкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин., центрифугированием при 10000 об./мин. в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объёмом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, подсушивали на воздухе, растворяли в деионизированной воде и хранили при -20 С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Для обнаружения микроделеций применяли мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) согласно руководству, предложенному Simoni и соавт. [Simoni et al., 1999]. ПЦР проводили на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» (г. Москва).
В работе были использованы 9 пар праймеров, позволявших исследовать следующие 9 Y-специфичных маркера (STS - sequence tagged site) для AZF-локуса (по Simoni соавт. (1999), оптимизированные Черных и соавт. (2003): 1) для субрегиона AZFa: sY 86, sY 84, sY 615. 2) субрегиона AZFb: sY 127, sY 134. 3) для субрегиона AZFc: sY 254 (DAZ), sY 255 (DAZ).
Кроме того, в качестве "внутреннего" контроля на присутствие в геномной ДНК фрагментов короткого плеча Y -хромосомы использовали два маркера SRY и ZFY - что позволяло выявить наличие даных локусов и определить сответствие фенотипического пола генотипическому. В качестве "внешнего положительного" контроля использовали ДНК фертильного мужчины.
Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 12,5 мкл, которая содержала 2,75 мкл lOxTaq-буфера (67 мМ трис-НС1 (рН 8,8), 16,6 мМ (NROz S04(, 6 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), 0,3 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-Ю пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров.
ПЦР проводили по схеме: начальная денатурация (95С, 2 мин.); 30 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация - 94, 45 сек ; 2) отжиг - 65С, 45 сек; 3) синтез - 72С, 45 сек; после чего проводили инкубацию при 72С в течение 7 минут. Размеры фрагментов определяли путем одновременного электрофореза с ДНК плазмиды pUC19, рестрицированной
Mspl. Последовательности праймеров представлены в таблице 1. Разделение фрагментов ДНК проводили с помощью вертикального электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном из 30% раствора акриламида (соотношение акриламид : N,N -метиленбисакриламид - 29:1). Электрофорез проводили в 1 хТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25%о ксиленцианола и 15% фикола.
После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия в течение 15 мин, визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Geldokulant» (Франция) (рис. 7).
Исследование частичных делеций AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе
AZFc субрегион Y хромосомы является крайне нестабильным участком. В связи с его особенностью для него характерны несколько видов частичных делеций. Наиболее распространенными являются gr/gr, Ь2/Ь3и Ы/ЬЗ делеций. Gr/gr делеция по данным некоторых авторов ассоциирована с мужским бесплодием [Giachini et al., 2005]. При этом виде делеций теряются несколько копий многокопийных генов, экспрессирующихся исключительно в тестикулярных тканях. Отсюда следует предположение о потенциально возможном угнетении репродуктивной функции у мужчин в результате уменьшения дозы генов AZFc субрегиона.
Нами был проведен анализ частичных делеций AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы у 125 больных с нарушением сперматогенеза. Пациентов с обнаруженными микроделециями AZF локуса мы исключили. В результате чего, общая выборка больных с нарушениями сперматогенеза для анализа частичных делеций составила 125 человек. В качестве группы контроля было проанализировано 304 фертильных мужчин башкирской, татарской и русской этнической принадлежности.
Среди проанализированных 429 мужчин мы обнаружили два типа частичных делеций AZFc субрегиона - это gr/gr и Ь2/Ь3делеции. Частота gr/gr в общей изученной группе составила 0,17 (74/429), а частота Ь2/Ь3делеций - 0,007 (3/429). Оба типа частичных делеций были обнаружены и среди больных с нарушением сперматогенеза, и среди фертильных мужчин. Частота gr/gr делеций в группе больных составила 0,19, в группе контроля -0,17, различия не достоверны (р = 0,81). Частота Ь2/Ь3делеций в группе больных была равна 0,02, в контрольной группе - 0,003, различия также не достигают статистически достоверных значений (р =0,41). Таким образом, нами не выявлено различий в распределении частот gr/gr и Ь2/Ь3 делециймежду общими выборками больных и контрольной группы.
Мы провели анализ распределения частот gr/gr и Ь2/Ь3 делеций в группах больных и контроля в зависимости от их этнической принадлежности. Делеция Ь2/Ь3 была выявлена лишь у одного мужчины башкирской этнической принадлежности из группы контроля.
В группе больных татарской этнической принадлежности частота gr/gr делеций составила 0,26, в контрольной группе - 0,16. У больных башкирской этнической принадлежности частота - 0,26, у контроля - 0,1. У пациентов русской этнической группы - 0,21, у контроля - 0,27. Результаты представлены в таблице 15, 16 и на рисунке 17. Для исследуемых групп русской этнической принадлежности оказалась характерной почти одинаковая частота делеций и в контроле и среди больных с нарушением сперматогенеза. У лиц башкирской этнической группы наблюдалось превышение частоты делеций у больных почти в три раза по сравнению с соответствующим контролем. В татарской этнической группе у больных делеций были обнаружены в полтора раза чаще, чем в группе контроля.
Как видно из таблицы 18, частота gr/gr делеций AZFc субрегиона Y хромосомы среди популяций мира в целом невысока и варьирует в основном от 2 до 7% . Для изученных нами трех этнических групп частота делеций оказалась гораздо выше как в группе больных, так и в группе контроля и варьировала от 10 до 27% (табл. 15,16). Кроме того, при анализе распространения gr/gr делеций в популяциях мира обнаруживается некоторая закономерность. Суть ее заключается в следующем, чем выше частота делеций в исследуемой популяции, тем ниже вероятность наличия ассоциаций с бесплодием у мужчин. Иначе говоря, в таких случаях gr/gr делеций рассматриваются как полиморфизм, характерный для исследуемой популяции.
В популяциях Нидерландов, Италии и Испании разными авторами были выявлены ассоциации gr/gr делеций AZF с субрегиона Y хромосомы с нарушением сперматогенеза, но число работ с противоположным результатом тоже велик [Repping et а., 2003; Giachini et al., 2005; de Llanos et al., 2005; Ravel C. et al., 2006; Lyn et al., 2007].
Таким образом, по данным одних авторов в некоторых популяциях мира gr/gr делеций AZF с субрегиона Y хромосомы ассоциированы с мужским бесплодием, а по данным других исследователей данная мутация может быть распространена в популяциях почти равномерно как среди фертильных, так и инфертильных мужчин.
Следующим этапом нашей работы стал анализ gr/gr делеций у больных с различной степенью нарушения сперматогенеза. Полученные данные представлены в таблице 19. Частота делеций в группе больных с азооспермией составила 20%, у больных с олигозооспермией тяжелой степени - 16%. В группе больных с нарушением сперматогенеза и количеством половых клеток 5 млн./мл. не было обнаружено ни gr/gr, ни Ь2/Ь3 делеций. В контрольной группе фертильных мужчин частота gr/gr делеций составила 17%.
