Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Цитокины как молекулы межклеточной сигнализации 13
1.2 Молекулярно-генетический анализ генов цитокиновой системы 14
1.2.1 Семейство интерлейкина 1 14
1.2.2 Семейство фактора некроза опухолей 16
1.2.3 Семейство интерлейкина 6 17
1.2.4 Семейство интерлейкина 10 18
1.3 Роль цитокинов в эмбриональном развитии человека 19
1.4 Наследственные тромбофилии как причина ранних эмбриональных потерь 28
1.4.1 Полиморфные варианты генов свертывающей системы крови 29
1.5 Метаболизм фолата и гомоцистеина и их влияние на реперодук-тивное здоровье человека 33
2 Материал и методы исследования 39
2.1 Материал исследования 39
2.2 Методы исследования 41
2.2.1 Методы выделения нуклеиновых кислот 41
2.2.1.1 Выделение геномной ДНК 41
2.2.1.2 Выделение РНК и проведение реакции обратной транскрипции 42
2.2.2 Анализ степени инфицированности тканей, полученных после спонтанных и медицинских абортов 43
2.2.3 Анализ однонуклеотидных полиморфизмов 44
2.2.3.1. Постановка аллель-специфической ПЦР 44
2.2.3.2. Анализ продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза 45
2.2.4 Анализ экспрессии генов 47
2.3 Методы статистической обработки результатов 49
2.4 Контродь качества проводимых исследований 50
3 Результаты и их обсуждение 51
3.1 Исследование полиморфизма генов цитокинов в тканях материнского и зародышевого происхождения при ранних эмбриональных потерях 51
3.1.1. Исследование частоты регистрации полиморфизма генов цито-кинов в клетках крови женщин с различным характером течения ранних сроков беременности 51
3.1.2. Исследование частоты регистрации полиморфизма генов цито -кинов в клетках децидуальной и хорионической тканей при различном характере течения ранних сроков беременности 61
3.2 Исследование частоты регистрации полиморфизма генов фолат-ного цикла и интегринов в клетках крови женщин и их ассоциация с невынашиванием беременности 80
3.3 Анализ уровня экспрессии генов цитокинов при невынашивании беременности 89
Заключение 118
Выводы 122
Практические рекомендации 123
Список использованных источников
- Семейство фактора некроза опухолей
- Методы выделения нуклеиновых кислот
- Постановка аллель-специфической ПЦР
- Исследование частоты регистрации полиморфизма генов цито -кинов в клетках децидуальной и хорионической тканей при различном характере течения ранних сроков беременности
Семейство фактора некроза опухолей
Цитокины представляют собой большую группу сигнальных белков, которые продуцируются и секретируются клетками имунной системы и регулируют многочисленные биологические процессы, включая воспаление, иммунитет и гемопоэз.
Группа цитокинов в настоящее время включает в себя многие факторы различного происхождения и различных функций. Таким образом, очевидно, что классификация этих пептидов с трудом поддается реализации. Структурно они включают интерлейкины, интерфероны, хемокины, ростовые факторы, семейство фактора некроза опухоли, гемопоэтические цитокины и др. Функционально цитокины деляться на провоспалительные (такие как IL-1, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-y, TNF-a, TNF-Д FasL) и противовоспалительные (такие как IL-4, IL-10, TGF-Д) (Кетлинский С, Симбирцев А., 2008).
Продукция цитокинов осуществляется: лимфоцитами периферической крови, макрофагами, клетками яйцеводов, клетками эндометрия, эмбрионом (Clough et al., 1998). Клетки различных тканей могут продуцировать один и тот же цитокин. Цитокины, через свои специфические рецепторы, оказывают влияние на клетки организма. Обладая плейотропностью, один и тот же цитокин может оказывать влияние на различные типы клеткок. В результате чего, клетки-мишени проявляют различные эффекты, характерные для типа, к которому они относятся. Цитокины выступают в роли межклеточных медиаторов, устанавливают процессы роста клеток их дифференцировку, миграцию и апоптоз.
В настоящее время цитокины классифицируют по типу рецепторов с которыми они связываются и с помощью которых происходит реализация их функций, биохимическим и биологическим свойствам, строению (табл. 1). В результате ряда исселедований установлено что, рецепторы цитокинов подразделяются на несколько типов по схожести последовательности аминокислот и тонкостям структуры внеклеточных доменов (Симбирцев А., 2004).
Семейство интерлейкина-1 (IL-1) состоит из нескольких полипептидов. IL-1, IL-1 являются одними из наиболее известных представителей семейства. Проявляя схожий спектр биологической активности, IL-1 и IL-1 кодируются разными генами. Однако, последовательности их аминокислот схожи на четверть. Так же обнаружен белок, который блокирует активность интер-лейкина-1 («рецепторный антагонист IL-1»). Структура данного белка примерно схожа и гомологична с IL-1, IL-1 из-за чего возможно специфическое связывание с рецепторами этих интерлейкинов. В результате конкуренции за одни и теже рецепторы с интерлейкином-1 этот белок блокирует биологическую активность данного цитокина. Также достаточно полно изучен четвертый член семейства – IL-18, получивший свой порядковый номер до выяснения сходства строения и биологической активности с другими цитокинами семейства IL-1 (Sims J. et al., 2001).
Интерлейкины-1, -1, -18 синтезируются в виде предшественников. Для того что бы эти предшественники могли связываться с мембраной клетки и секретироваться через эндоплазматический ретикулум им необходимы гидрофобные участки в составе . В резуль тате посттрансляционного процессинга, которому подвергаются эти белки, происходит отщепление зрелого секреторного полипептида.
IL-1 играет важнейшую роль в развитии острофазового иммунного ответа. В результате попадания в организм инфекционных агентов или при нарушении целостности тканей начинается его синтез и развитие местной воспалительной реакции. IL-1 синтезируется, главным образом, моноцитами макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, TVK-клетками, купферовскими клетками, клетками Лангерганса, фибробластами, клетками эндотелия, нейтрофилами и др. (Lord P. et al., 1991). Примерно 90% моноцитов крови и 40-60% тканевых макрофагов участвуют в продукции IL-1 (Симбирцев А., 2004). IL-la преимущественно выступает в роли проводника защитных реакций на местном уровне. IL-lfi действует как на местном, так и на уровне всего организма (Кетлинский С, Симбирцев А., 2008).
Гены семейства IL-1 локализованы на 2 хромосоме. Ген IL-lfi содержит 22 экзона, 20 из которых альтернативные, и 9 интронов, из которых 8 альтернативные. Некоторые аллельные варианты генов семейства IL-1 обуславливают изменение уровня экспрессии кодируемых белков. В гене IL-lfi известны полиморфизмы, связанные с заменой одного нуклеотида в промоторе в положении -31, -511 и в положении +3953. При наличии данных аллелей экспрессия гена IL-lfi характеризуется более высоким уровнем. Так, у лиц, гомо- или гетерозиготных по полиморфизму 3953С-71 синтезируется соответственно в 4 и 2 раза большее количество данного цитокина, чем у лиц, гомозиготных по аллели 3953С. Аллель гена IL-la c точечной заменой в области промотора (-889) ассоциирована с повышенной продукцией цитокина (Gri-maldi L. et al., 2000).
Полиморфизм генов IL-lfi и его рецептора влияет на особенности протекания реакций - наличие немутантных вариантов этих генов определяет адекватную продукцию соответствующих белков; у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону продукции IL-lfi воспаление протекает более остро, у носителей полиморфных вариантов гена рецептора, обуслав ливающих его повышенную выработку, воспалительный ответ более продолжителен, что может приводить к хронизации процесса.
Методы выделения нуклеиновых кислот
В ходе изучения частот генотипов исследованных аллельных вариантов установлено, что в контрольной группе и в группах женщин с НБ и СА в анамнезе для всех рассмотренных локусов эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (Р 0,05).
В результате исследования установлено, что в контрольной группе гомозиготами по аллели -31С гена IL-1/3 являлись 36,8% женщин, гетерозиготами по полиморфизму - 49,1% женщин (табл. 5). Распределение частот генотипов по исследуемому полиморфизму среди женщин с неразвивающейся беременностью не отличается от контрольной группы. Среди женщин со спонтанным абортом преобладают гомозиготы по аллели -31С гена IL-1/3. Однако данные отличия по сравнению с контрольной группой статистически не значимы.
Интересно отметить, что среди женщин с неразвивающейся беременностью гетерозигот по полиморфизму -31С-Т гена IL-1/З больше (59,7%), чем среди женщин с самопроизвольным абортом (36,7%) (табл. 5). При этом число гомозигот по аллели -31С гена IL-1/3 почти в два раза ниже по сравнению с группой женщин с самопроизвольным абортом. Доля гомозигот по исследуемому полиморфизму в двух данных группах одинакова. Таким образом, выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов по полиморфизму -31С-Т гена IL-lfi между двумя группами женщин с патологией беременности в 1 триместре (НБ и СА) ( =7,78; Р = 0,02).
Анализ частоты аллелей гена IL-1 показал, что аллель -31Т регистрируется с частотой 0,39 в группе контроля (рис. 9). Наибольшая частота данной аллели выявлена среди женщин с неразвивающейся беременностью, наименьшая частота аллели -31Т гена IL-1 характерна для женщин со спонтанным абортом в первом триместре беременности. Статистически значимых отличий по сравнению с контрольной группой не выявлено. Однако полиморфный вариант гена IL-1 среди женщин с неразвивающейся беременностью регистрируется статистически значимо чаще по сравнению с группой женщин со спонтанным абортом.
Примечание: МА – медицинский аборт; СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся беременность; 21 – сравнение частот генотипов с контролем; 22 – сравнение частот аллелей с контролем; 23.- сравнение между группами СА и НБ.
Рис. 9. Распределение частот аллелей по полиморфизму -31С-Т гена IL-lfi в клетках крови женщин с различным характером течения ранних сроков беременности (НБ - неразвивающаяся беременность; СА - спонтанный аборт).
18,4% женщин из контрольной группы являются гомозиготами по аллели -174G гена IL-6; гомозиготы по полиморфизму -174СС составили 21,1% женщин (табл. 5). В контрольной группе преобладают гетерозиготы по данному полиморфизму. Характер распределения частот генотипов по полиморфизму -174G-C гена IL-6 среди женщин со спонтанным абортом или неразвивающейся беременностью идентичен контрольному. Не выявлено статистически значимых различий в частотах генотипов и между двумя группами женщин с патологией ранних сроков беременности.
Анализ частот аллелей гена IL-6 показал, что аллель -174С регистрируется с частотой 0,51 в группе контроля (рис. 10). При анализе частот аллелей отдельно между женщинами с неразвивающейся беременностью и самопроизвольным абортом статистически значимых отличий не выявлено. Рис. 10. Распределение частот аллелей по полиморфизму -174G-C гена IL-6 в клетках крови женщин с различным характером течения ранних сроков беременности (НБ – неразвивающаяся беременность; СА – спонтанный аборт).
В результате исследования установлено, что в контрольной группе гомозиготами по аллели -592С гена IL-10 являлись 57% женщин (табл. 6). Гомозиготы по аллели -592А IL-10 составили 10,5%. Среди женщин с неразвивающейся беременностью также как и в контрольной группе преобладают гомозиготы -592СС гена IL-10. Частота аллелей по полиморфизму -592С-А гена IL-10 в исследуемых группах женщин представлена на рисунке 11.
Постановка аллель-специфической ПЦР
Таким образом, нами выявлена ассоциация повышенного уровня экспрессии гена IL-1 с неразвивающейся беременностью. Экспрессия гена повышена в хорионической ткани.
Провоспалительные цитокины синтезируются на ранних сроках беременности в незначительном количестве, обеспечивая динамическое равновесие между процессами инвазии и отторжения трофобласта. По данным литературы известно, что при беременности связывание IL-1 с рецепторами в материнском организме необходимо для имплантации (Левкович М., 2008). Высказывается мнение о том, что IL-1 способствует развитию плода, стимулирует пролиферацию клеток, обра зующих плацентарный барьер (Чистякова Г. и др., 2005).
Однако, продукция провоспалительных цитокинов выше нормального уровня (одной из причин которого может быть наличие полиморфного варианта гена) может приводить к тромбозам и ишемическим некрозам в структуре фетоплацентарных тканей. Цитокины, которые относят к провоспали-тельным, оказывают токсическое воздействие непосредственно на развивающийся эмбрион, приводят к нарушению формирования и ограничению инвазии трофобласта. В результате чего возможно прекращение развития эмбриона или задержка данного процесса. Наряду с этим, возникающие тромбозы, инфаркты трофобласта, отторжение трофобласта может стать след -ствием чрезмерной активности протромбиназы, вызванной повышенным содержанием провоспалительных цитокинов.
Данные литературы об ассоциации уровня экспрессии гена IL-1 с невынашиванием беременности противоречивы. Показана ассоциация гиперэкспрессии Th1 цитокинов с рекуррентными спонтанными абортами (Reid J. et al., 2001; Costeas P. et al., 2004). Однако по другим данным литературы такой ассоциации н е выявлено (Zammiti W. et al., 2009; Pietrowski D. et al., 2004). У женщин с привычным невынашиванием беременности уровень IL-1 в тканях эндометрия был снижен (Von Wolff M. et al., 2000). Krieg S. с коллегами показали, что у женщин с привычным невынашиванием беременности уровень экспрессии IL-1 в децидуальной ткани снижен (Krieg S. et al., 2012). IL-1 активирует синтез целого ряда других цитокинов и факторов роста. Например CSF2, который является фактором роста для клеток трофобласта и участвует в формировании и дифференцировке плаценты (Giacomini G. et al., 1995). Отклонение уровня мРНК гена IL-1 и самого цитокина от оптимальных значений способно вызвать изменения в функционировании целого ряда сигнальных путей в клетке.
При нормально развивающейся беременности уровень экспрессии гена IL-6 с 4 по 8 недели развития не высок и изменяется волнообразно как в де-цидуальной, так и в хорионической тканях (рис. 34, 35). При этом уровень экспрессии IL-6 в децидуальной ткани превосходит данный показатель в хо-рионической ткани (как в норме, так и принеразвивающейся беременности). Рис. 34. Изменение уровня экспрессии гена IL-6 в децидуальной ткани в зависимости от срока беременности (относительно экспрессии гена GAPDH).
Таким образом, уровень экспрессии данного гена в децидуальной ткани несколько выше по сравнению с хорионической как в норме, так и при неразвивающейся беременности (Р = 0,035 и Р 0,06 соответственно) (рис. 36, 37). Рис. 36. Уровень экспресии гена IL-6 в клетках хорионической и децидуаль-ной тканей относительно экспрессии гена GAPDH при физиологически протекающей беременности.
Рис. 37. Уровень экспресии гена IL-6 в клетках хорионической и децидуаль-ной тканей относительно экспрессии гена GAPDH при неразвивающейся беременности.
В хорионической ткани при НБ уровень мРНК данного цитокина не отличается от такового показателя для нормально протекающей беременности и снижается по сравнению с уровнем мРНК гена IL-6 в децидуальной ткани (Р = 0,203) (рис. 37, 38).
Рис. 38. Уровень экспрессии гена IL-6 в клетках хорионической ткани относительно экспрессии гена GAPDH при физиологически протекающей и неразвивающейся беременности (МА – медицинский аборт, НБ – неразвивающаяся беременность).
В децидуальной ткани выявлено повышение экспрессии гена IL-6 при неразвивающейся беременности по сравнению с нормально протекающей беременностью (P = 0,033) (рис. 39). Это согласуется с выявленным ранее снижением частоты полиморфного варианта данного гена среди женщин с неразвивающейся беременностью. Повышение уровня IL-6 может приводить к нарушению процессов имплантации, ангиогенеза децидуальной ткани и трофобласта, а также к нарушению инвазии трофобласта, увеличению синтеза провоспалительных цитокинов. И как следствие – нарушение ранних этапов развития плода. Рис. 39. Уровень экспрессии гена IL-6 в клетках децидуальной ткани относительно экспрессии гена GAPDH при физиологически протекающей и неразвивающейся беременности (МА – медицинский аборт, НБ – неразвивающаяся беременность).
При спонтанном аборте уровень экспрессии гена IL-6 в клетках хорио-нической и децидуальной тканей практически одинаков и при этом не отличается от контрольного уровня (рис. 40). Рис. 40. Уровень экспрессии гена IL-6 в клетках хорионической и децидуаль-ной тканей относительно экспрессии гена GAPDH в норме и при спонтанном аборте.
По данным литературы IL-6, относящийся к провоспалительным цито-кинам, способен секретироваться трофобластом. Наряду с другими цитоки-нами он необходим для успешной имплантации (Prins J. et al., 2012). Повышение уровня IL-6 изменяет весь цитокиновый профиль, что может приводить к невынашиванию беременности и бесплодию. Эффекторные реакции материнской иммунной системы по отношению к развивающемуся эмбриону могут усугубляться IL-6. У женщин с привычным невынашиванием беременности IL-6, являясь по своим эффектам типичным провоспалительным цито-кином, стимулирующим ангиогенез и активирующим коагуляционные реакции, одновременно ингибирует продукцию IL-1, TNF, оказывая противовоспалительное действие, ограничивая продукцию провоспалительных цитоки-нов в тканях (Zammiti W. et al., 2008). По некоторым данным литературы уровень IL-6 в периферической крови женщин с угрозой прерывания беременности повышается (Чистякова Г. и др., 2007).
Исследование частоты регистрации полиморфизма генов цито -кинов в клетках децидуальной и хорионической тканей при различном характере течения ранних сроков беременности
Впервые получены данные о частоте полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках децидуальной и хорионической тканей при двух различных патологиях первого триместра беременности - спонтанном аборте и неразвивающейся беременности.
Статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей по исследуемым полиморфизмам генов цитокинов в клетках хорионической ткани между контрольной группой и группой женщин со спонтанным абортом в первом триместре беременности не выявлено.
Установлено, что риск развития неразвивающейся беременности повышается в случае гомозиготного состояния по аллели -174С гена интерлей-кина-6 в клетках хорионической ткани (OR = 18; 95% CI 3,2-100,9). Частота аллели -174G в данной группе в 2,8 раз меньше по сравнению с контролем.
Показано, что в случае спонтанного аборта генотип клеток децидуальной и хорионической ткани, как правило, отличается по наличию полиморфного варианта гена IL-1/3. Если в контрольной группе 58% парных образцов тканей являются гетерозиготами по полиморфизму -31С-Т гена IL-1/3, то в группе со спонтанным абортом данный показатель составил 7,1% (OR = 0,056; 95% CI 0,006-0,52; P = 0,0036).
В проведенном исследовании не выявлено ассоциации полиморфизма генов MTHFR и MTRR с повышенным риском развития невынашивания беременности первого триместра. В то же время установлено, что наличие полиморфизма А2 756G гена MTR ассоциировано с повышением риска невынашивания беременности. Показано, что в группе женщин с невынашиванием беременности статистически значимо чаще регистрируется сочетание в одном генотипе полиморфных вариантов двух генов фолатного цикла - MTRR и MTR. Последствием может быть повышение риска развития гипергомоцисте-инемии и тромбообразования.
В данном исследовании не выявлено ассоциации отдельных полиморфизмов генов ITGA2, ITGB3, FGB, SERPINE1 с повышенным риском невынашивания беременности первого триместра. Однако выявлено повышение риска для женщин, в генотипе которых полиморфные варианты генов фолат-ного цикла сочетаются c наличием полиморфизма по генам SERPINE1 или генам интегринов. Установлено, что риск потери беременности в первом триместре повышен у женщин, имеющих одновременно полиморфные варианты как генов фолатного обмена, так и генов интегринов. При этом возможны нарушения ранних этапов развития эмбриона из-за нарушения обмена метильных групп, а также тромботические процессы в формирующейся системе новых кровеносных сосудов плаценты. Совокупность подобных неблагоприятных факторов увеличивает риск спонтанного прерывания беременности.
Сочетанный анализ полиморфных вариантов генов фолатного цикла, факторов свертывающей системы крови и цитокинов показал, что риск невынашивания беременности в первом триместре возрастает в 2 раза у женщин, имеющих в своем генотипе полиморфные варианты генов MTRR, MTR, ITGA2, IL-1. Еще более высокий риск характерен для лиц, у которых полиморфизм по генам MTRR, MTR сочетается с полиморфизмом по гену SER-PINE1 и IL-1.
Установлено наличие положительной корреляционной связи между активностью генов IL-6 и TNF, а также IL-10 и TNF в децидуальной ткани при физиологически протекающей беременности. В хорионической ткани установлено наличие корреляции между уровнем экспрессии генов IL-1 и IL-6, а также IL-10. Установлено, что уровень экспрессии генов IL-1, IL-6, IL-10 повышается в децидуальной ткани при неразвивающейся беременности. Установлено, что все корреляционные связи между активностью генов цитокинов нарушаются в хорионической ткани при неразвивающейся бере-120 менности; уровень экспрессии гена IL-1 практически в 2 раза выше по сравнению с физиологически протекающей беременностью. Поскольку цитокины являются медиаторами межклеточных взаимодействий, изменение характера функционирования генов цитокиновой сети влечет за собой изменение в регуляции экспрессии и функционировании целого ряда метаболических кас -кадов.
Выявленные нами отличия в частотах генотипов и аллелей по генам цитокинов между группами женщин СА и НБ предполагают изменение различных звеньев цитокиновой системы. Первичным звеном в нарушении баланса цитокинов может выступать обусловленное генотипом повышение уровня экспрессии провоспалителтьных цитокинов (в частности IL-1). Последующие нарушения функционирования плаценты могут приводить к остановке развития эмбриона и, как следствие, неразвивающейся беременности.
Похожие диссертации на Молекулярно-генетическая характеристика факторов цитокиновой системы при ранних эмбриональных потерях
