Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Род тобамовирус (tobamovirus): представители и краткая характеристика 8
1. 1.1. Вирус зеленой крапчатой мозаики огурца 9
1.1.2. Вирус табачной мозаики 12
1.2. Организация геномов вируса табачной мозаики и вируса зеленой крапчатой мозаики огурца 14
1.3. Хранение и передача генетической информации вируса 16
1.3.1. Стабильность вирусного генома обеспечивают структуры на 5'- и З'-кониах 17
1.3.2. Трансляция и образование вирусных репликаз 18
1.3.3. Репликация геномной РНК ВТМ. 20
1.3.4. Субгеномные мРНК 24
1.4. Транспорт ВТМ 27
1.4.1. Межклеточный транспорт вируса. 27
1.4.2. Сборка вирионов 32
1.4.3. Дальний транспорт вируса 33
1.5. Защитная система растения 35
1.5.1 Сайленсин? РНК. 35
1.5.2. Феномен перекрестной защиты 44
1.5.3. Сверхчувствительная реакция 46
1.5.5. Убиквитинирование 48
Цели и задачи 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
2.1. Материалы 51
2.2. Методы 53
2.2.1. Выделение вирусных штаммов и заражение растений 53
2.2.2.Очистка вирусных частиц и выделение вирусной РНК. 57
2.2.3. Синтез первой цепи кДНКс помощью обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция 58
2.2.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля или путем прямого осаждения 59
2.2.6. Автоматическое секвенирование 60
2.2.7. Твердофазный гетерогенный иммуноферментный анализ (ИФА) 60
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Изучение штаммов взкмо 62
3.1.1. Определение первичных структур геномов штаммов МС-1, МС-2, ВИРОГ-43М 62
3.1.2. Определение круга растений-хозяев штамма МС-1 63
3.1.3. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей геномов и белков штамма МС-1 и других представителей тобамовирусов 65
3.1.4. Множественное выравнивание и филогенетический анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей белков штамма МС-1 и тобамовирусов 70
3.1.4. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей штамма МС-1 с известными штаммами ВЗКМО 74
3.1.5. Сравнительный анализ первичной структуры вакцинного штамма ВИРОГ-43Мс патогенными МС-1, МС-2 80
3.1.6. Динамика размножения в растениях огурца вакцинного штамма ВИРОГ-43М по сравнению с патогенными штаммами МС-1, МС-2 82
3.2. Изучение полиморфизма штаммов вмто 87
3.2.1. Сравнительный анализ первичных структур патогенных и аттенуированных штаммов ВМТо 87
3.2.2. Динамика размножения аттенуированных и патогенных штаммов ВМТо в растениях табака 91
3.3. Сравнение изучаемых аттенуированных штаммов вмто и взкмо с другими известными ослабленными штаммами тобамовирусов 96
Заключение 103
Выводы 105
Список литературы
- Вирус табачной мозаики
- Выделение вирусных штаммов и заражение растений
- Определение первичных структур геномов штаммов МС-1, МС-2, ВИРОГ-43М
- Сравнительный анализ первичной структуры вакцинного штамма ВИРОГ-43Мс патогенными МС-1, МС-2
Введение к работе
Практически все обнаруженные растительные вирусы являются патогенными и вызывают заболевания сельскохозяйственных культур различной степени тяжести, иногда приводящие к гибели растений или полной потере урожая. На сегодняшний день существуют различные способы защиты от фитовирусов. К традиционным и наиболее надежным относятся методы селекции, благодаря которым возможно создание сортов или гибридов с генами, детерминирующими устойчивость к вирусным заболеваниям.
Сравнительно новыми являются биотехнологические методы, при использовании которых можно либо каждый раз получать оздоровленный посадочный материал, либо создавать линии трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Однако, для применения перечисленных методов по созданию невосприимчивых гибридов необходимо наличие доноров с генами устойчивости. Альтернативным способом может быть применение ослабленных (аттенуированных) штаммов, которые заражают растение, но не вызывают внешних симптомов инфекции и способствуют развитию защитного ответа к близкородственным патогенным штаммам. Селекция аттенуированных штаммов позволяет выбрать лучший изолят, обладающий максимальной генетической стабильностью и наибольшей способностью к перекрестной защите. Такой штамм называется вакцинным, а обработка им растений на ранних этапах развития обозначается как вакцинация. В результате, в случае заражения сильно патогенным штаммом вируса, значительно уменьшается число больных растений, или же ослабляются симптомы заболевания, что приводит к снижению потерь урожая. Такой метод защиты очень прост, т. к. необходима лишь однократная обработка сеянцев вакцинным штаммом с помощью распылительных устройств, и не требует значительных материальных затрат.
Получение аттенуированных штаммов, безусловно, выгодно для защиты растений.
Для создания ослабленных изолятов раньше использовали метод селекции, когда на фоне массового заражения выявляли растения без симптомов инфекции и путем многих пассажей и отбора получали стабильный аттенуированный штамм. В настоящее время с использованием арсенала молекулярно-биологических методов, возможно установить генетическую природу аттенуации. Для этого необходимо определить, а затем сравнить первичные структуры вирусных геномов родственных патогенных и аттенуированных штаммов. Анализ полученных результатов позволяет выявить мутации и определить, в каком из генов вируса возникли изменения, приводящие к ослаблению симптомов. Эти данные важны для целенаправленных генно-инженерных работ по дальнейшему улучшению имеющихся вакцинных штаммов и созданию новых ослабленных штаммов на основании геномов патогенных изолятов без применения традиционной селекции.
Лаборатория генетики растений Института общей генетики (ИОГен) им. Ы.И. Вавилова РАН многие годы занималась разработкой вакцинных штаммов для защиты хозяйственно-ценных овощных культур от патогенных вирусов. Для данной работы были выбраны следующие представители рода тобамовирусов: томатные штаммы вируса табачной мозаики (ВТМ) или, как принято называть сегодня, вируса мозаики томатов
(ВМТо), а также изоляты вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО). Помимо выявления и описания особенностей огуречных штаммов тобамовирусов, выделенных в России, мы также исследовали их эволюционные связи с другими тобамовирусами и степень родства с известными штаммами ВЗКМО. Однако, главным в работе являлось определение генетической природы аттенуации штаммов, а также установление общих закономерностей аттенуации путем сравнения первичных структур геномов ослабленных и патогенных штаммов изученных нами и имеющихся в базе данных GenBank.
Вирус табачной мозаики
Еще в 1886 году Майером был открыт ВТМ. Именно он доказал, что причиной мозаичного поражения растений табака является инфекционное заболевание, названное им мозаичной болезнью. ВТМ, как и. ВЗКМО, представляет собой простую палочковидную частицу 18x300 нм. Вирус имеет широкий круг хозяев: так, в 1946 году Холмс установил, что 199 из 310 видов покрытосемянных, относящихся к 30 семействам, могут быть поражены ВТМ. Правда, у 100 из этих видов инфекции подвергался только инокулированный лист, и не наблюдалось системного распространения вируса по растению. Исследованные виды растений сильно отличались по способности поддерживать репликацию ВТМ; многие, включая папоротников, поддерживали репликацию на очень низком уровне (данные взяты из http://www.dpvweb.net/dpv/ showdpv.php?dpvno=l 51).
ВТМ встречается везде, где выращивается табак и другие растения-хозяева. Вирус проявляется в виде системной мозаики на листьях растения, также симптомами
ВТМ может быть окрашивание жилок и некротическая реакция. ВТМ, также как и ВЗКМО, переносится при любых механических контактах, но не передается с помощью насекомых.
Существует несколько растений-тестеров для ВТМ. На табаке {Nicotiana tabacum) различных сортов, в том числе Самсун (без гена устойчивости к ВТМ, пп) и Ксанти, ВТМ проявляется в виде системной инфекции и мозаичных симптомов. На других тестерах: табаке клейком (N. ghitinosd), сортах Самсун (с геном N устойчивости к ВТМ) и Ксанти-nc, на фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris) сорта Пинто и лебеде {Chenopodiwn amaranticolor), — инфекция ВТМ вызывает образование некрозов на инокулированном листе при температуре ниже 28С. На табаке лесном (К sylvestris) и сорте табака Ява ВТМ развивает системную инфекцию, а некоторые мутантные штаммы на этих растениях могут давать некрозы (http://www.dpvweb.net/dpv/shovvdpv.php?dpvno=370).
Известно большое количество штаммов ВТМ. Типичным является выделенный из табака штамм ВТМ vulgare, обозначаемый также как U1. Некоторые штаммы, которые первоначально относились к ВТМ, впоследствии выделили в отдельный вид. К примеру, штамм ВТМ из подорожника, инфицирующий также наперстянку, настурцию, смолевку белую, васаби и гулявник, сейчас является отдельным видом, обозначаемым как вирус мозаики подорожника (согласно данным Международного комитета таксономии вирусов; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm). То же произошло и со штаммами ВТМ, выделенными из томата. Сейчас их выделяют в отдельный вид, вирус мозаики томатов (ВМТо), насчитывающий порядка 50 изолятов. В 1994 году Дорохов с соавторами изолировали штамм ВТМ-кр, поражающий Крестоцветные (Dorokhov et al., 2004). Данный штамм интересен тем, что поражает резушку Таля {Arabidopsis thaliana), у которой полностью определена первичная структура генома. Как и в случае с ВЗКМО, основным критерием принадлежности штамма к ВТМ является сходство нуклеотидных последовательностей геномов и аминокислотных последовательностей белков (не менее 90%) нового изолята с типичными представителями вида.
ВТМ является удобным объектом для исследований, так как накапливается в больших количествах и поражает модельный объект молекулярной генетики - табак. Как отмечалось выше, многое известно о геномной организации ВТМ, его цикле репродукции и взаимодействии с хозяином. Современное представление об особенностях функционирования ВТМ и защитной системе растения в ответ на вирусную инфекцию, описано в следующих разделах.
Вирусы с РНК геномом отличаются большой компактностью: плюс-цепь РНК одновременно является матрицей, с которой транслируются белки репликазы, и матрицей при репликации вирусного генома и субгеномных РНК. Несмотря на то, что эти процессы задействуют одну и ту же молекулу РНК, интеференции между ними не происходит. Т.е. не происходит столкновения между рибосомами, движущимися по РНК от 5 - к З -концу, и репликазой, движущейся по геному от 3 - к 5 -концу. Более того, поскольку для процесса трансляции необходим белок-синтезирующий аппарат растения, та же вирусная геномная РНК имеет специфические структуры для взаимодействия с хозяйскими факторами трансляции (из обзора Mandahar, 2006). Просто невероятно, как одна молекула РНК регулирует и контролирует эти процессы во времени и пространстве.
ВТМ и ВЗКМО, как и все представители рода тобамовирус, имеют кэппированный и иеполиаденилированый геном с тРНК-подобной структурой на 3 -конце. Геномные РНК ВТМ и ВЗКМО содержат порядка 6400 нуклеотидов (н.) и кодируют следующие белки: короткую репликазу молекулярной массы 126 кДа (К) /129К, длинную репликазу массой 183/186К, ТБ массой 30/29К и БО массой 17,5/17,ЗК. Положение генов и нетранслируемых областей геномов ВТМ штамма U1, ВМТо штамма L и ВЗКМО штамма SH указаны в соответствии со сведениями базы данных GenBank и приведены в таблице 1 и на рис. 1.
5 -проксимальная рамка считывания геномов ВТМ и ВЗКМО кодирует 126К/129К белки и заканчивается терминирующим амбер кодопом UAG. N-конец данного белка содержит метилтрансферазный домен (MET; Gorbalenya and Koonin, 1989), а С-конец -геликазный домен (ГЕЛ), относящийся к суперсемейству 1 (Ishihama, Barbier, 1994; Rozanov et al., 1992). 183K белок ВТМ и 186К белок ВЗКМО синтезируются в результате супрессии амбер-кодона и содержат на С-конце полимеразный домен (ПОЛ) супергруппы 3. Гены репликазы транслируются непосредственно с геномной РНК. Совместно с хозяйским белком (как минимум одним) вирусные репликазы образуют активный репликативный комплекс, который прикреплен к мембране эндоплазмотического ретикулума (ЭР) инфицированных клеток. 3 -проксимальные гены (ТБ, БО) кодируются с соответствующих субгеномных РНК (сгмРНК), причем ТБ экспрессируется на ранних стадиях инфекции, а БО - на более поздних (из обзора Mandahar, 2006).
У ВТМ в пределах гена 183К была найдена дополнительная рамка считывания для 54К белка, соответствующая полимеразному домену. 54К белок, транслируется с сгмРНК, однако, в тканях инфицированных растений он не обнаруживается (Sulzinski et al., 1985). Синтез 54К белка можно наблюдать только in vitro. Также в геноме ВТМ была найдена еще одна, шестая открытая рамка считывания (ORF6), перекрывающая З -конец гена ТБ и 5 -конец гена БО (Morozov et al., 1993). Данная область была найдена как у штамма ВТМ U1, так и у штамма ВТМ-кр. ORF6 потенциально кодирует белок размером 4,8 кДа, который повышает вирулентность вируса, но при этом не увеличивает репликацию и не способствует его активному передвижению (Canto et al., 2004).
Выделение вирусных штаммов и заражение растений
Для проведения секвенирования РНК индивидуальных штаммов соответствующие растения-хозяева заражались нужным штаммом, затем выделялись вирусные частицы, из которых экстрагировали РНК для проведения последовательно реакций обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (ПЦР), выделения фрагмента из геля и секвенирования очищенного фрагмента.
Заражение растений
Заражение растений вирусными штаммами проводили механическим способом. Для этого листья растений табака или огурца (в зависимости от вируса) посыпали карборундом в качестве абразива, наносили 100 мкл препарата очищенных вирусных частиц, содержащих 1 мкг РНК, и осторожно растирали стеклянным шпателем. Концентрацию геномной РНК в вирусных частицах определяли с помощью электорофореза в 1% агарозном геле, после чего в случае необходимости до заражения растений разводили вирусные частицы деионизованной водой так, чтобы они содержали в 100 мкл 1 мкг РНК. Инфекционность штаммов ВМТо проверяли на листьях сверхчувствительного гибрида Терновского, на которых на 2-3 день после инокулирования наблюдали образование локальных некрозов.
Для системной инфекции штаммов ВМТо использовали растения табака Samsun на стадии 3-4 настоящих листьев. Развитие системной инфекции на растениях табака наблюдали на 12-15 день после инфицирования. Соответственно, инфекция ВЗКМО на огурцах развивалась 14 дней. После чего пораженные листья использовали для выделения вирусных частиц. Получение экстракта вирусных частиц
За основу получения экстракта и очистки вирусных частиц была взята методика из практикума по общей вирусологии (Атабеков, 1981) с некоторыми модификациями. Навеску (100 г) предварительно замороженного (-20С) растительного материала, инфицированного вирусом, измельчали в фарфоровой ступке с добавлением 50 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7.5) с 10 мМ ЭДТА. Затем полученную массу отжимали через 4 слоя марли и собирали экстракт. После массу вновь смешивали с 50 мл того же буфера, добавляли немного порошка карборунда, растирали в фарфоровой ступке, отжимали, первый и второй экстракты объединяли. Суспензию подщелачивали 0.1 н NaOH до рН 7.0-7.5 и центрифугировали в течение 20 мин при 600 - 700 g при +4С. Надосадочную жидкость экстрагировали хлороформом (1/10 объема); смесь встряхивали в течение 20 мин и вновь центрифугировали в течение 10 мин при 600 g при +4С. Верхний слой экстракта, содержащий вирусные частицы, отбирали и повторно обрабатывали хлороформом.
Дробное высаливание вирусных частиц.
К грубому экстракту вируса при комнатной температуре небольшими порциями при постоянном перемешивании добавляли сульфат аммония до 15% от насыщения и инкубировали при комнатной температуре не менее 30 мин. После осадок удаляли центрифугированием при 600 g в течение 20 мин. Затем к полученной надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до 25-30% от насыщения. Раствор оставляли на ночь в холодильнике для осаждения вируса. Надосадочную жидкость удаляли с помощью сифонной трубки, а жидкую концентрированную суспензию осадка вируса хранили при +4С.
Для очистки вирусных частиц 5 мл сульфат-аммонийной суспензии центрифугировали при 17000 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в 10 мл ТЕ и выдерживали при комнатной температуре 15 мин. Затем добавляли 5 М NaCl и тритона Х-100 до 0.2М и 1%, соответственно, суспендировали и через 15 мин осветляли центрифугированием при 17000 g в течение 10 мин. После надосадочную жидкость отбирали в чистую пробирку, добавляли сухого ПЭГ-6000 до конечной концентрации 3% и выдерживали для формирования осадка при +4С 1час. Осадок получали центрифугированием при 17000 g 10 мин. и растворяли в I мл ТЕ. Выделение вирусной РНК из препарата вирусных частиц
Для выделения вирусной РНК использовали метод с гуанидин тиоцианатом (ГТЦ; Гусев 1997). 4М ГТЦ готовили следующим образом: брали навеску 47,26 г сухого ГТЦ на 100 мл раствора и добавляли 50 мМ трис-HCl, рН 7,0, 20 мМ ЭДТА. К 1 мл 4 М ГТЦ добавляли 400 мкл этилового спирта и солюбилизировали 200 мкл вирусных частиц. Затем пропускали данную смесь через колонку с измельченным стекловолокнистым фильтром GF/F (Whatman) (примерно 1см2 фильтра на колонку), центрифугируя колонку при 200 g в течение 5 мин. После колонку промывали последовательно 1 мл 80% этилового спирта и 0,5 мл ацетона. Фильтр сушили в вакуумном эксикаторе, после чего РНК элюировали в 100 мкл деионизованной воды, не содержащей РНКаз. Инфекционность выделенной РНК соответствовала 30-80 некрозов на 0,2-0,5 мкг РНК на листьях табака гибрида Терновского.
Экспресс- выделение вирусной РНК из зараженных тканей
500 мкг молодой зараженной ткани растения растирали в ступке с 4М ГТЦ; 700 мкл экстракта переносили в эппендорф и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавляли 700 мкл хлораформа и центрифугировали при 15000 g 10 мин. Отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объем хлораформа и центрифугировали при 15000 g 5 мин. К верхней фазе добавляли объем изопропилового спирта и 1/10 объема ацетата натрия (рН 4,3); инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Осадок получали центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин, после его промывали два раза 70% этиловым спиртом. Осадок растворяли в 50 мкл деионизованной воды.
Синтез первой цепи кДНК проводили с помощью набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (фирма «Fermentas») по следующему протоколу. К 0,5-1 мкг РНК добавляли 0,2 мкг набора случайных гексамерных праймеров и доводили объем до 11 мкл. Затем инкубировали полученную смесь 5 мин при +70С и охлаждали во льду. После добавляли 20 ед. ингибитора РНКаз, нуклеотидтрифосфаты (dNTP) до конечной концентрации 1,0 мМ, реакционный буфер и доводили объем смеси до 19 мкл. Далее инкубировали реакционную смесь 5 мин при +25С и добавляли 200 ед M-MuLV обратной транскриптазы. Полученную смесь инкубировали 10 мин. при +25С, 60 мин. при +42С и 10 мин. при +70С, а затем охлаждали во льду. Синтезированную первую цепь кДНК хранили при -20С.
Вторую цепь синтезировали со специфического праймера и амплифицировали нужный фрагмент с помощью ПЦР и праймеров, указанных в таблицах 3 и 4. Для ПЦР готовили реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 20 нг каждого праймера, 1-Ю нг матрицы, 1 ед. Гад-ДНК-полимеразы, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.05М КС1, 0.02М трис-HCl рН 8,4, 2.5мМ MgCb и 0.1мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Для предотвращения испарения в каждую пробирку добавляли по 20 мкл вазелинового масла. Температура отжига подбиралась индивидуально для каждой пары праймеров, исходя из формулы 4(GC)+2(AT)-(2-5C), время отжига колебалось от 30 до 60 сек.. Температура денатурации составляла +94С, а время в зависимости от длины фрагмента - 0,5-1,0 мин.; температура элонгации - +72С, время элонгации подбиралось в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента из расчета 1 мин на 1000 п.н.. Количество циклов варьировало от 25 до 30. В качестве положительного контроля амплифицировали фрагмент определенного молекулярного веса, а в качестве отрицательного брали 1 мкл деионизованной воды. Амплификацию проводили в программируемом термостате Терцик фирмы «ДНК Технология».
Определение первичных структур геномов штаммов МС-1, МС-2, ВИРОГ-43М
Одной из важных характеристик вирусов является круг его хозяев. Поскольку полученные ранее в нашей лаборатории штаммы вирусов, поражающих огурцы, подробно не изучались, необходимо было определить, поражают ли они растения-тестеры, характерные для ВЗКМО, а также других представителей сем. Тыквенные. Для этого заражали очищенными препаратами вирусных частиц растения-тестеры: лебеду {Chenopodium amaranticolor) и дурман {Datura stramonium), а также представителей сем. Тыквенные: кабачок (Cucurbita реро var. giraumons), дыню (Cucumis melo) и огурец {Cucumis sativum) в качестве положительного контроля. Эксперименты по заражению повторялись трижды на пяти и более растениях, имевших 3-4 полностью развитых листа. Симптомы оценивали и собирали образцы для анализа по истечению четырех недель после заражения.
Было установлено, что штамм МС-1, подобно типичным представителям ВЗКМО, не вызывал внешних симптомов у дурмана, но приводил к появлению, мелких локальных некрозов на инокулированных штаммом листьях лебеды. У кабачка и дыни патогенный штамм вызывал системную инфекцию, проявлявшуюся в виде симптомов, сходных с симптомами на растениях огурца (зеленую мозаику, крапчатость, иногда деформацию листьев).
Для подтверждения типа развивающейся в растениях инфекции была проведена реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР с препаратами РНК из зараженных растений. Для этого брали 100-200 мг растительной ткани, выделяли суммарную РНК (как описано в главе 2) и для получения первой цепи кДНК ставили реакцию обратной транскрипции. Вторую цепь получали ПЦР с праймеров: прямого 4771+ и обратного 4-. Электрофорез ПЦР проб в 1% агарозном геле представлен на рисунке 11. Результаты ПЦР подтверждают, что патогенные штаммы не заражают дурман, но заражают лебеду, кабачок, огурец и дыню.
В настоящее время представляется очевидным, что при обнаружении нового штамма вируса, даже если он вызывает характерные симптомы и имеет соответствующий круг хозяев, однозначно и исчерпывающе установить его видовую принадлежность позволяют только данные сравнительного анализа первичных структур генома и аминокислотных последовательностей его белков. Хотелось бы отметить, что, несмотря на высокую частоту встречаемости ВЗКМО в тепличных хозяйствах, первичные структуры изолятов вируса из России не изучались и, соответственно, не проводилось сравнение с геномами других тобамовирусов. Поэтому было особенно важно выяснить, являются ли Российские изоляты типичными штаммами ВЗКМО.
Парные сравнения нуклеотидных последовательностей геномов и выведенных из них аминокислотных последовательностей четырех белков штамма МС-1 и представителей тобамовирусов были проведены с помощью компьютерной программы АНВее - Multiple Alignment (сайт в Интернете http://www.genebee.msu.su /services/ malign_full.html). Данная программа основана на методе CLUSTAL W; при нуклеотидных выравнивания использовалась DNA/RNA матрица, при аминокислотных - РАМ 250. В таблице 4 указаны используемые в сравнительных анализах представители тобамовирусов: название вирусов и обозначения, штамм вируса, страна, в которой он был выделен, растение-хозяин и семейство, к которому оно относится, а также регистрационный номер в базе данных GenBank.
Необходимо отметить, что для анализов были выбраны только классифицированные члены тобамовирусов (см. раздел 1.1 главы 1), общее количество которых равно 17. В качестве типичного представителя ВЗКМО использовался штамм SH, выделенный в Японии из сетчатой дыни. ВЗКМО являлся не единственным вирусом семейства Тыквенные. Растения данного семейства поражались также вирусами крапчатой мозаики цветков огурца (CFMMV), «кьюри» зеленой крапчатой мозаики огурца (KGMMV), и вирусом зеленой мозаики цуккини (ZGMMV). Результаты парного сравнения нуклеотидных последовательностей представлены в таблице 5, а аминокислотных - в таблице 6.
Сравнительный анализ первичной структуры вакцинного штамма ВИРОГ-43Мс патогенными МС-1, МС-2
С помощью праймер-опосредованной прогулки по геному и последующего секвенирования были определены первичные структуры вирусных РНК вакцинного штамма ВЗКМО ВИРОГ-43М и патогенных МС-1, МС-2 (см. приложение 1.1). В таблице 9 указаны все нуклеотидные мутации, а на рис. 13 показаны те мутации, которые приводят к заменам аминокислот у вакцинного штамма ВИРОГ-43М по сравнению с патогенными МС-1 и МС-2. Сравнения нуклеотидных последовательностей геномов проводили с помощью сервера BLAST, программы BLAST 2 SEQUENCES (сайт в Интернете http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/bl2seq/ wblast2.cgi).
В результате сравнения первичных структур геномов патогенного МС-1 и вакцинного штамма ВИРОГ-43М было выявлено шесть трансзиций. Две из шести трансзиций, располагавшиеся в гене репликазы и в гене транспортного белка, являлись молчащими. Четыре остальные мутации у вакцинного штамма ВИРОГ-43М, находивиеся в гене репликазы, приводили к аминокислотным заменам. Первая замена у вакцинного штамма ВИРОГ-43М (Gly-86— Ser) располагалась в метилтрансферазном домене репликазы, последняя (Рго-1362 — Leu) в полимеразном домене, а вторая (Ser-534 —» Phe) и третья (Рго-698 — Leu) — в неконсервативной области между метилтрансферазным и геликазным доменами (каждый последний показатель в ряду приводимых аминокислотных замен соответствует ВИРОГ-43М).
При сравнении нуклеотидных последовательностей геномов патогенного изолята МС-2 и вакцинного штамма ВИРОГ-43М было обнаружено 9 трансзиций в гене репликазы, 6 из которых являлись молчащими. Три точковые мутации, приводившие к аминокислотным заменам Gly-86 — Ser, Ser-534 —» Phe и Pro-1362 — Leu у штаммов МС-2 и МС-1 совпадали. Однако характерная для штамма МС-1 мутация в положении 2152 у патогенного штамма МС-2 отсутствовала, поэтому в позиции 698 репликазы штамма МС-2 присутствовал лейцин, а не пролин. При визуальной оценке проявления симптомов заболевания и скорости их появления не было существенных различий между изолятами МС-1 и МС-2. Поэтому, скорее всего, замена в положении 698 у штамма МС-1 не является критичной для аттенуации.
В завершении раздела необходимо отметить, что вакцинный штамм ВЗКМО ВИРОГ-43М для защиты растений огурца от патогенных штаммов был впервые получен в нашей лаборатории и с успехом прошел производственные испытания. Он имеет особую ценность, поскольку еще не найдены гены устойчивости к данному вирусу, и, соответственно, невозможно создать гибриды или сорта, устойчивые к данному заболеванию. Поэтому данный способ защиты огурцов и других тыквенных от ВКЗМО является единственно возможным. Кроме нашей лаборатории вакцинный штамм ВЗКМО был получен также в Японии, где он применяется для защиты арбузов от патогенных штаммов, однако информация его первичной структуре отсутствует (Motoyoshi F. Et al., 1988). Нами было установлено, что все транзиции, потенциально являвшиеся критическими для патогенности, располагались в гене репликазы. Соответствующие аминокислотные замены находились в МЕТ, ПОЛ доменах, а также в НКО между МЕТ и ГЕЛ доменами.
Поскольку вакцинный штамм ВИРОГ-43М был получен в нашей лаборатории и других сведений, кроме его бессимптомности и способности к защите ранее не имелось, на наш взгляд, было важно изучить особенности динамики размножения (накопления) в растениях огурца данного штамма и сравнить с динамикой накопления патогенных изолятов, что может дополнить наши знания о специфике биологии аттенуированных штаммов. Также представлялось интересным узнать, обладали ли штаммы МС-1 и МС-2 одинаковой степенью патогенности. В предыдущем разделе было изложено, что оба штамма отличались на одну аминокислотную замену в НКО.
Если штаммы размножались с практически одинаковой скоростью, то подтверждалась гипотеза о том, что замена Leu-698 — Pro не влияла на аттенуацию.
Наиболее доступным способом измерения накопления вируса в зараженном растении является определение методом ИФА количества белка оболочки, основного по массе компонента вирусной частицы. Для этого растения огурца выращивали до стадии 3 развернутых настоящих листьев, и затем два первых нижних листа огурца заражались 100 мкл очищенных вирусных частиц штаммов ВЗКМО, содержащих 1 мкг геномной РНК. После чего на третий, седьмой, десятый и четырнадцатый дни после инокуляции (д.п.и.) с верхних развивающихся неинокулированных листьев брались дисковые высечки для проведения ИФА по методике, описанной в разделе 2.2.7. Для каждого штамма заражали по 10 растений, из них на третий день выбирали 6 одинаково развитых, зараженных растений, с отсутствием травмированных листьев от инокуляции, которые использовались затем для эксперимента. Отрицательным контролем служили листья незараженных растений огурца, выращивавшиеся на протяжении всего эксперимента; положительным контролем являлись гомогенизированные системно зараженные патогенным штаммом ВЗКМО листья огурца, поставляемые фирмой «Adgen» вместе с набором ADGEN IDENTIKIT CGMMV. Отрицательный и положительный контроль тестировался дважды при каждом анализе ИФА.
Результаты данного эксперимента приведены в виде графика на рис. 14, где количество белка оболочки в пробе представлено в виде оптической плотности окраски, получаемой в результате ИФА, и рассчитано как среднее арифметическое значение отдельных проб. Необходимо отметить, что в таблице указаны значения анализа ИФА с учетом отрицательного контроля, т.е. от показателя спектрофотометра отнимали среднее значение отрицательного контроля и полученную величину вносили в таблицу.
