Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза и терапии хронического миелолейкоза 10
1.1.Клиническая и молекулярно-биологическая характеристика хронического миелолейкоза .10
1.1.1. Клиническая характеристика хронического миелолейкоза .10
1.1.2. Молекулярная биология хронического миелолейкоз 12
1.1.3. Молекулярные механизмы прогрессии заболевания .18
1.2. Ингибиторы тирозинкиназ в терапии хронического миелолейкоза .22
1.2.1. Структура и механизм действия ингибиторов тирозинкиназ 22
1.2.2. Молекулярно-биологические механизмы резистентности к ингибиторам тирозинкиназ .25
1.3. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при хроническом миелолейкозе 35
1.3.1. Эффективность и безопасность аллоТГСК .35
1.3.2. Прогностические факторы, влияющие на исход трансплантации 37
1.3.3. Роль аллогенной трансплантации в эпоху ингибиторов тирозинкиназ 42
Глава 2. Методы исследования и характеристика пациентов 46
2.1. Характеристика пациентов 46
2.2. Метод исследования уровня относительной экспрессии транскриптов химерного гена BCR-ABL .48
2.3. Методы исследования мутационного статуса гена BCR-ABL 50
2.4. Метод исследования уровня относительной экспрессии гена EVI1 .53
2.5. Статистическая обработка данных .55
Глава 3. Результаты исследования 56
3.1. Молекулярно-генетические характеристики больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ .56
3.1.1. Уровень экспрессии транскрипта р210 BCR-ABL 56
3.1.2. Коэкспрессия транскрипта р190 BCR-ABL 58
3.1.3. Спектр и частота мутаций в киназном домене гена BCR-ABL 60
3.1.4. Экспрессия гена EVI1 .68
3.2. Анализ влияния молекулярно-генетических факторов на эффективность аллоТГСК у больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ 72
3.2.1. Результаты аллоТГСК 73
3.2.2. Прогностическое значение уровня экспрессии транскрипта р210 BCR-ABL 74
3.2.3. Прогностическое значение коэкспрессии транскрипта р190
BCR-ABL 78
3.2.4. Прогностическое значение мутаций в киназном домене гена BCR-ABL 83
3.2.5. Прогностическое значение уровня экспрессии гена EVI1 93
Глава 4. Обсуждение 102
Выводы 111
Практические рекомендации 113
Список сокращений 114
Список литературы 115
- Клиническая характеристика хронического миелолейкоза
- Молекулярно-биологические механизмы резистентности к ингибиторам тирозинкиназ
- Метод исследования уровня относительной экспрессии транскриптов химерного гена BCR-ABL
- Уровень экспрессии транскрипта р210 BCR-ABL
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) – это заболевание крови опухолевой природы, основным проявлением которого является пролиферация гемопоэтических стволовых клеток, на начальных этапах заболевания способных к созреванию. При ХМЛ в опухолевых клетках выявляется та к называемая Филадельфийская (Ph) хромосома (Nowell P.C. et al., 1960). Это специфическое нарушение кариотипа возникает вследствие сбалансированной реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11). На молекулярном уровне возникновение Ph-хромосомы приводит к возникновению химерного гена BCR-ABL, кодирующего конститутивно активную тирозинкиназу (Melo J.V. et al., 2007). В ряде экспериментов было продемонстрировано, что активность белка BCR-ABL необходима для поддержания лейкемического фенотипа клеток (Daley G.Q. et al., 1990; Kelliher M.A. et al., 1990; Heisterkamp N. et al., 1990).
Исследования патогенеза ХМЛ на молекулярном уровне позволили подобрать низкомолекулярные соединения, способные специфически связываться с белком BCR-ABL и подавлять его тирозинкиназную активность. Ингибиторы тирозинкиназ показали чрезвычайно высокую эффективность как в исследованиях in vitro и in vivo, так и в клинической практике. C 2001 года ингибитор тирозинкиназ иматиниб используется в качестве первой линии терапии при ХМЛ.
Открытие и внедрение в клиническую практику таргетных ингибиторов тирозинкиназы BCR-ABL стало одним из наиболее заметных достижений в современной онкологии. Тем не менее, терапия ингибиторами тирозинкиназ эффективна далеко не у всех больных ХМЛ. Во-первых, не удается получить стойких длительных ремиссий у пациентов в фазе акселерации и бластного криза. Во-вторых, острой проблемой остается первичная и вторичная резистентность к ингибиторам тирозинкиназ, развивающаяся в 20 – 30 % случаев (Cortes J. et al., 2007; Kantarjian H. et al., 2007).
В настоящее время у больных ХМЛ в фазе акселерации и бластного криза, а также при развитии резистентности к ингибиторам тирозинкиназ второго поколения показано проведение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) периферической крови или костного мозга (Gratwohl A. et al., 2006). АллоТГСК является одним из эффективных методов лечения многих злокачественных заболеваний миелоидной и лимфоидной тканей (Афанасьев Б .В. и соавт., 2002, 2007; Абдулкадыров K.M. и соавт., 2004; Зубаровская Л.С. и соавт., 2001; Румянцев
А.Г. и соавт., 2003; Савченко В.Г. и соавт., 2010). Накопленный за более чем 30 лет опыт применения аллоТГСК в практике лечения ХМЛ показал, что , несмотря на огромные достижения в развитии таргетной терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ, аллоТГСК до сих пор остается единственным методом, который позволяет достичь полного излечения у больных ХМЛ.
На эффективность аллоТГСК у больных ХМЛ влияют как клинические факторы, характеристики пациента и особенности режима трансплантации, так и молекулярно-биологические свойства опухолевых клеток . Развитие резистентности к ингибиторам тирозинкиназ, также как и прогрессия заболевания, ассоциированы с широким спектром молекулярно-биологических изменений в лейкозных клетках. Наиболее изученным механизмом развития резистентности к ингибиторам тирозинкиназ при ХМЛ считается появление мутаций в киназном домене гена BCR-ABL. Частота мутаций BCR-ABL, по данным разных исследований, варьирует от 30% до 90% в зависимости от фазы заболевания и методов детекции мутации (Gorre M.E. et al., 2001; Hochhaus A. et al., 2004). Молекулярно-биологические механизмы, ведущие к развитию резистентности и прогрессии заболевания, во многом схожи между собой . В частности, в проведенных в посл еднее время исследованиях была выявлена роль гиперэкспрессии гена EVI1 как при прогрессии заболевания, так и при развитии резистентности к ингибиторам тирозинкиназ (Ogawa S. et al., 1996, 1997; Paquette R.L. et al., 2011; Daghistani M. et al., 2010). Показано, что гиперэкспрессия EVI1 ассоциирована с резистентностью к химиотерапии у больных острыми миелоидными лейкозами и миелодиспластическим синдромом, а также с прогрессией и переходом к метастазированию ряда солидных опухолей (Valk P.J. et al., 2004; Groschel S. et al., 2010).
Степень разработанности темы исследования
Прогностическое значение клинических факторов и характеристик пациентов в отношении эффективности аллоТГСК у больных ХМЛ изучено достаточно подробно . В шкалу рисков входят стадия заболевания на момент трансплантации, возраст пациента, длительность периода болезни до трансплантации, а также тип донора и сочетание по полу донора и реципиента (Gratwohl A. et al., 1998).
В то же время, прогностическое значение молекулярно-биологических факторов, ассоциированных с прогрессией заболевания и резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ, в отношении эффективности аллоТГСК у больных ХМЛ изучено значительно меньше. Так, немногочисленны и противоречивы данные о прогностическом значении мутаций в киназном домене гена BCR-ABL, неясно значение уровня экспрессии гена BCR-ABL. Неясно также
прогностическое значение уровня экспрессии гена EVI1 при аллоТГСК у больных ХМЛ.
Цель исследования
Изучить молекулярно-генетические характеристики больных хроническим миелолейкозом с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ и определить их прогностическое значение при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Задачи исследования
-
Изучить мутационный статус гена BCR-ABL и экспрессию его транскриптов р210 и р190 у больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ
-
Исследовать особенности экспрессии гена EVI1 у больных хроническим миелолейкозом с резистентностью и с оптимальным ответом на терапию ингибиторами тирозинкиназ
-
Изучить взаимосвязь между уровнем экспрессии гена EVI1 и структурным и функциональным состоянием гена BCR-ABL
-
Оценить прогностическое значение наличия мутаций в гене BCR-ABL и экспрессии его транскриптов при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных хроническим миелолейкозом
-
Определить прогностическое значение гиперэкспрессии гена EVI1 при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с хроническим миелолейкозом
Научная новизна исследования
Впервые установлено значение высокого уровня экспрессии гена EVI1 как фактора, имеющего неблагоприятное прогностическое значение при аллоТГСК у пациентов с ХМЛ, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ в отношении увеличения частоты пост-трансплантационных рецидивов. Впервые обнаружена ассоциация между повышенным уровнем экспрессии гена EVI1 у больных ХМЛ и предшествующей терапией ингибиторами тирозинкиназ второго поколения . Впервые установлено, что повышенный уровень экспрессии EVI1 характерен для пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ, не имеющих мутаций в киназном домене гена BCR-ABL. Определены также спектр и частота мутаций в киназном домене гена BCR-ABL, обнаружены ранее не описанные сложные нарушения структуры (комплексные делеции) BCR-ABL, изучена динамика возникновения мутантного клона и предложен метод более чувствительной детекции мутации T315I.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в результате исследования данные дополняют систему знаний о молекулярно-биологических механизмах патогенеза хро нического миелолейкоза и развития резистентности к ингибиторам тирозинкиназ.
Определение уровня экспрессии гена EVI1 перед проведением аллоТГСК у больных ХМЛ позволяет осуществлять дифференцированный подход к планированию терапии в пред- и пост-трансплантационном периоде. В частности, это открывает возможность для выявления пациентов с высоким риском развития пост -трансплантационных рецидивов, которые нуждаются в своевременной противорецидивной и иммуноадоптивной терапии.
Предложенный метод высокочувствительной детекции мутации T315I гена BCR-ABL с помощью ПЦР в реальном времени позволяет выявить пациентов, имеющих показания к проведению аллоТГСК, на несколько месяцев раньше, чем это может быть сделано стандартным методом прямого секвенирования по Сэнгеру.
Методология и методы исследования
Научная методология исследования основывается на системном подходе
к изучаемой проблеме и комплексном рассмотрении процессов патогенеза и
терапии заболеваний крови опухолевой природы. В работе использованы
молекулярно-биологические, статистические, а также клинические и
общенаучные методы исследования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Высокий уровень экспрессии гена EVI1 характерен для резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ больных ХМЛ, не имеющих мутаций в киназном домене гена BCR-ABL.
-
Высокий уровень экспрессии гена EVI1 имеет неблагоприятное прогностическое значение в отношении частоты развития рецидивов и продолжительности безрецидивной выживаемости после аллоТГСК у больных ХМЛ с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ.
-
Высокий уровень экспрессии гена EVI1 и поздняя стадия заболевания (фаза акселерации или бластный криз) на момент трансплантации являются независимыми предикторами менее продолжительной безрецидивной выживаемости.
-
Мутации в киназном домене гена BCR-ABL, в том числе T315I, а также высокий уровень экспрессии BCR-ABL, в исследованной группе пациентов не имели негативного прогностического значения в отношении общей и безрецидивной выживаемости после аллоТГСК у больных ХМЛ, резистентных к ингибиторам тирозинкиназ.
Внедрение результатов исследования в практику
Основные положения диссертации внедрены в практическую и научно-
исследовательскую работу на кафедре гематологии, трансфузиологии и
трансплантации Первого Санкт-Петербургского государственного
медицинского университета имени академика И.П.Павлова и гематологического отделения Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения "Детская городская больница №1".
Степень достоверности и апробация результатов работы
Степень достоверности полученных результатов проведенных исследований определяется достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов и подтверждена адекватными поставленным задачам методами статистической обработки данных.
Материалы диссертации представлены на IV симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток», посвященном памяти Р.М. Горбачевой (Санкт-Петербург, 2011), XIX Wilsede Meeting «Modern trends in human leukemia» (Гамбург, 2012), 38 Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (Женева, 2012), 39 Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (Лондон, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013).
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора
Автором лично проведены анализ литературных данных и планирование диссертационного исследования , выполнены молекулярно-генетические исследования, включая определение уровня экспрессии гена EVI1 и мутационного статуса гена BCR-ABL, осуществлены статистический анализ, обобщение и интерпретация экспериментальных данных.
Структура работы
Диссертационная работа изложена на 141 странице текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики, главы результатов исследования , главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографии. Список литературы включает 63 источника на русском языке и 194 источника на иностранном языке. Работа содержит 38 рисунков и 15 таблиц.
Клиническая характеристика хронического миелолейкоза
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) – это миелопролиферативное заболевание, основным проявлением которого является клональная пролиферация гемопоэтических стволовых клеток, на начальных этапах заболевания способных к созреванию. Лейкемические клетки при ХМЛ характеризуются усилением пролиферативной активности, сниженной способностью к апоптозу и нарушением процессов дифференцировки (Волкова М.А. и соавт., 2010).
На долю ХМЛ приходится около 15% всех случаев заболеваний крови опухолевой природы у взрослых. Заболеваемость ХМЛ достигает 1–1,5 на 100 000 населения. ХМЛ встречается во всех возрастных группах, однако у детей заболевание встречается крайне редко, а медиана возраста больных на момент диагноза составляет 50–60 лет (Cortes J. et al., 1996; Давыдов М.И. и соавт., 2009). ХМЛ в своем развитии проходит 3 фазы – хроническую фазу (ХФ ), фазу акселерации (ФА) и бластный криз (БК). В хронической фазе лейкемические клетки сохраняют способность к дифференцировке, а также морфологическую и функциональную полноценность. Незрелые клетки (бласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты) в периферическои крови обнаруживаются, но преобладают зрелые элементы миелоидного ростка. У подавляющего большинства пациентов (80%) заболевание диагностируют в хронической фазе, несмотря на то , что в значительном числе случаев оно протекает бессимптомно (Ломаиа Е.Г. и соавт., 2009).
С течением времени заболевание неизбежно прогрессирует в более агрессивную форму. Характерными особенностями фазы акселерации являются прогрессирующее нарушение дифференцировки, усиление пролиферативной активности и подавление апоптоза в лейкозных клетках. В организме постепенно накапливаются незрелые предшественники гранулоцитопоэза со склонностью к образованию экстрамедуллярных очагов гемопоэза в разных органах и тканях. Наряду с этим постепенно подавляются эритроцито- и мегакариоцитопоэз.
На стадии бластного криза зрелые клетки почти полностью вытесняются либо миелоидными, либо лимфоидными бластными клетками. Миелоидный вариант БК выявляют у 50% пациентов. Четверти пациентов свойственен лимфоидный вариант БК, а у остальных 25% случаев четко определить линейную принадлежность бластных клеток при БК не удается. Основными причи нами смерти больных в БК ХМЛ являются геморрагические и инфекционные осложнения, а также полиорганная недостаточность, возникающая вследствие нарастающей опухолевой интоксикации (Savage D.G. et al., 1997).
Для установления диагноза ХМЛ необходимо выявление ассоциированного с этим заболеванием специфического генетического нарушения, ассоциированного с этим заболеванием - транслокации t(9;22)(q34;q11) и соответствующего ей химерного гена BCR-ABL. Стандартное цитогенетическое исследование позволяет обнаружить транслокацию t(9;22) у 95% пациентов с ХМЛ (Домрачева Е.В. и соавт., 2005). С помощью методов ПЦР и FISH химерный ген BCR-ABL детектируется почти у всех больных ХМЛ (Мисюрин A.B. и соавт., 2007).
Терапия ХМЛ в настоящее время основана на применении ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) (Туркина А.Г. и соавт., 2008; Ломаиа Е.Г. и соавт., 2009, 2010; Волкова М.А. и соавт., 2010). В качестве первой линии терапии у пациентов в хронической фазе используют ИТК первого поколения иматиниб. В случае неудачи терапии иматинибом в качестве второй линии терапии используют ИТК второго поколения дазатиниб и нилотиниб . Пациентам в фазе акселерации и бластного криза или с резистентностью к ИТК показана аллоТГСК. В современных условиях цитогенетические и молекулярно-биологические методы исследования используются не только на этапе первичной диагностики ХМЛ, но и при оценке уровня ответа на проводимую терапию. Так, эффективность терапии определяют не только по достижению гематологического, но цитогенетического и молекулярного ответов, причём с учетом сроков их достижения. Полное отсутствие Ph-положительных клеток свидетельствует о достижении полного цитогенетичекого ответа у больного. Критерием достижения полного молекулярного ответа является неопределяемый с помощью метода количественной ПЦР в реальном времени уровень экспрессии мРНК гена BCR-ABL (Мартынкевич И.С. и соавт., 2011, 2012).
Опухолевые элементы больных хроническим миелолейкозом маркирует так называемая Филадельфийская (Ph) хромо сома (Nowell PC. et al., 1960). Это специфическое нарушение кариотипа возникает вследствие сбалансированной реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11). На молекулярном уровне возникновение Ph хромосомы приводит к возникновению химерного гена BCR-ABL, кодирующего конститутивно активную тирозинкиназу (Melo J.V. et al., 2007). Это событие происходит в гемопоэтических стволовых клетках , дающих начало как миелодному, так и лимфоидному росткам кроветворения (рис. 1). Прогрессия заболевания и переход в стадию бластного криза связаны с накоплением дополнительных мутаций в клетках-предшественниках миелодного или лимфоидного ряда.
Молекулярно-биологические механизмы резистентности к ингибиторам тирозинкиназ
Иматиниб показал очень высокую эффективность в качестве первой линии терапии ХМЛ. Однако, только небольшая часть пациентов достигает полного молекулярного ответа при терапии иматинибом, в то время как у большинства из них транскрипты BCR-ABL продолжают выявляться (Druker B.J. et al., 2006). Поэтому у 20 – 30% пациентов в конечном счете развивается первичная или вторичная резистентность к иматинибу. Более того, частота ответа на иматиниб у пациентов в фазе акселерации и бластного криза значительно ниже, чем в хронической фазе, а достигнутая ремиссия в подавляющем большинстве случаев кратковременна (Druker B.J. et al., 2001). В настоящее время большинство исследователей придерживается мнения о том, что резистентность к иматинибу и другим ингибиторам тирозинкиназ обусловлена взаимодействием множества клинических и молекулярно-биологических факторов, в том числе приверженностью к лечению, биодоступностью, фармакодинамикой, разнообразными генетическими изменениями.
В нескольких исследованиях было продемонстрировано, что уровень концентрации иматиниби в плазме крови пациентов значительно варьирует (le Coutre. et al., 2003; Peng B. et al., 2004) и отмечена взаимосвязь между концентрацией иматиниба в плазме и частотой цитогенетического и молекулярного ответа на терапию (Picard S. et al., 2007). Одной из причин снижения концентрации иматиниба в плазме может быть генетический полиморфизм ферментов цитохрома Р450 — изоферментов CYP3A4 и CYP3A5, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов (Picard S. et al., 2007).
Внутриклеточный транспорт иматиниба Количество иматиниба в клетке также тесно связано с балансом между поглощением препарата и его выведением. Иматиниб доставляется внутрь клетки из межклеточного пространства транспортным белком hОСТ1, полиморфизмы гена которого, а также уровень его экспрессии могут могут быть ответственны за скорость поступления иматиниба в клетку. С другой стороны, выведение иматиниба из клетки связано с активностью трансмембранного белка MDR1, опосредующего множественную лекарственную резистентность к химиотерапии. Между тем, уровень экспрессии MDR1 при БК ХМЛ, а также у пациентов с резистентностью к ИТК, по сравнению с хрониче ской фазой, значительно повышен (Picard S. et al., 2007; Ставровская А.А. и соавт., 2008; Стромская Т.П. и соавт., 2008).
Популяция лейкозных клеток при ХМЛ неоднородна. Была обнаружена небольшая субпопуляция так называемых покоящихся стволовых клеткок ХМЛ (Lin-CD34+), которая составляет около 0,5% всех CD34+ клеток и обнаруживает резистентность к иматинибу (Holtz M.S. et al., 2005). По-видимому, данное обстоятельство обуславливает невозможность полного уничтожения лейкозного клона клеток и персистирование минимальной остаточной болезни у большинства пациентов. Поэтому в последнее время много внимания уделяется разработке новых подходов к терапии ХМЛ с использованием комбинированной терапии, включающей ИТК и препараты с BCR-ABL независимым механизмом действия.
Киназа BCR-ABL активирует киназы LYN, HCK, и FGR, которые относятся к семейству цитоплазматических нерецепторных киназ SRC (Hu Y. et al., 2004). Было показано, что у пациентов с резистентностью к иматинибу, не имеющих мутаций в гене BCR-ABL, уровень экспрессии киназы LYN значительно повышен (Wu J. et al., 2008). Дазатиниб ингибирует киназы семейства SRC и поэтому может быть особенно эффективен в группе пациентов с гиперэкспрессией LYN. Амплификация гена BCR-ABL
Амплификация BCR-ABL была одним из первых обнаруженных механизмов резистентности к иматинибу (Gorre M.E. et al., 2001). Кроме того, была выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии BCR-ABL и мутациями BCR-ABL, заключающаяся в том, что при нарастании уровня экспрессии мутации, в том числе обуславливающие резистентность к иматинибу, возникают чаще (Barnes D.J. et al., 2005). Мутации в киназном домене гена BCR-ABL Появление мутаций в киназном домене гена BCR-ABL наиболее изученный механизм развития резистентности к ингибиторам тирозинкиназ при ХМЛ (Куцев С.И. и соавт., 2008). Частота мутаций BCR-ABL по данным разных исследований варьирует от 30% до 90%, завися от фазы заболевания и методов детекции мутации (Gorre M.E. et al., 2001; Shah N.P. et al., 2002; Lowenberg B. et al., 2003; Corbin A.S. et al., 2003; Gambacorti-Passerini C.B. et al., 2003; Hochhaus A. et al., 2004; Hughes T. et al., 2006). Первой мутацией, описанной у пациентов с резистентностью к иматинибу, была мутация T315I. Треонин в 315 положении играет ключевую роль в связывании иматиниба, поскольку между ним и молекулой иматиниба образуется водородная связь. При замене треонина на изолейцин водородная связь не образуется и аффинность иматиниба к BCR-ABL снижается. Кроме того, изолейцин представляет собой гораздо более крупную молекулу, чем треонин, и поэтому стерически препятствует проникновению иматиниба в сайт связывания (Р-петлю) (Gorre M.E. et al., 2001; Zhou T. et al., 2007).
Метод исследования уровня относительной экспрессии транскриптов химерного гена BCR-ABL
Уровень относительной экспрессии транскриптов р210 и р190 гена BCR-ABL определяли по методу, описанному в работе Gabert и соавторов (Gabert J. et al., 2003). Метод предусматривает последовательное проведение следующих этапов: 1) выделение тотальной РНК из периферической крови больных ХМЛ; 2) реакцию обратной транскрипции со случайными гексамерными праймерами; 3) ПЦР в реальном времени с праймерами и зондами, специфичными к последовательностям транскриптов р 210, р 190 и контрольного гена ABL. Определение уровня относительной экспрессии в исследуемом образце основано на определении соотношения количества транскриптов изучаемого гена BCR-ABL и контрольного гена ABL, используемого для нормализации. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, которые были использованы в ра боте, представлены в таблице 2.
Тотальную РНК выделяли из 200 мкл периферической крови больных ХМЛ с помощью гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольного метода с использованием набора для экстракции РНК Рибозоль Д (ИнтерЛабСервис, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Синтез кДНК из РНК осуществляли с использованием случайных гексамерных праймеров и обратной транскриптазы (набор RevertAid, Fermentas. Литва). Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 40 мкл по протоколу производителя. Для отжига и проведения реакции использовался ПЦР-амплификатор iQ5 (Bio-Rad, США)
Реакцию ПЦР в реальном времени по технологии Taqman проводили на амплификаторе iQ5 (Bio-Rad, США) с использованием набора реагентов для амплификации M-428 (Синтол, Россия). Электрофоретически чистые праймеры и зонды, содержащие флуорофоры FAM и JOE, были произведены компанией “Синтол” (Россия). Реакционная смесь содержала 4 мM NaCl, 50 мM KCl, 12 мM ТрисHCl (pH 8.0), 2.5 мM MgCl2, 200 мкМ dNTP, 0,4 мкМ каждого праймера, 0,25 мкМ зонда, 0.05 мкг кДНК, а также 1 ед . Taq ДНК полимеразы. ПЦР проводили в объеме 25 мкл в следующем режиме: начальная инкубация при 95С в течение 5 мин, затем 45 циклов с условиями 95С - 15 сек, 60С - 1 мин. Флуоресцентный сигнал определяли при 60С по каналам FAM и JOE.
В качестве положительных контролей использовали стандартные разведения плазмид с известным числом копий с вставкой участка соответствующего гена (Invitrogen, США). Диапазон используемых концентраций стандартов составлял 102-106 копий/мкл. Стандарты использовали для построения калибровочной кривой и определения эффективности реакции. Мутационный статус гена BCR-ABL изучали с помощью двух методов – прямого секвенирования по Сэнгеру и аллель-специфичной ПЦР (АС ПЦР). Метод определения мутаций в киназном домене гена BCR-ABL с помощью прямого секвенирования по Сэнгеру подробно изложен в работе Hochhaus A. (Hochhaus A. et al., 2002). Последовательность кДНК киназного домена амплифицировали в два этапа с использованием праймеров, представленных в таблице 2.3. и затем секвенировали в обоих направлениях с использованием реактивов Big Dye 3.1. (Applied Biosystems, США). Полученную нуклеотидную последовательность сравнивали с референсной последовательностью транскрипта c-abl 1 (NCBI Reference Sequence: NM_005157.4). Используемый метод позволял определять точную последовательность фрагмента с 596 по 1270 нуклеотид транскрипта с-abl1 (рис. 6).
Аллель-специфичную ПЦР для детекции точечной мутации T315I и количественной оценки содержания мутантных транскриптов проводили в два этапа. На первом этапе амплифицировали фрагмент химерного транскрипта p210 гена BCR-ABL, на втором этапе использовали ПЦР в режиме реального времени c аллель-специфичными праймерами. Для повышения специфичности реакции использовались LNA-модифицированнные праймеры, которые отличаются от классических олигонуклеотидов повышенной специфичностью и аффинностью при гибридизации (Orum H. et al., 1999). Для дискриминации нормальной и мутантной последовательностей подобраны два обратных аллель специфичных праймера, один прямой праймер и проба, содержащая флуорофор и гаситель для детекции сигнала в режиме реального времени (таблица 3).
ПЦР проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл, каждая проба содержала 1 мкл продукта первого этапа амплификации, 0,4 мкМ каждого праймера и 0,25 мкМ зонда, TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, США). Амплификацию и детекцию сигнала осуществляли на амплификаторе iQ5 (Bio-Rad, США) с использованием следующего режима: начальная инкубация при 95С в течение 10 мин, 40 циклов денатурации при 95С 15 сек, отжига праймеров и элонгации при 60С 1 мин.
Количественную оценку результатов ПЦР проводили по методу Ct. Одновременное проведение двух реакций, специфичных для мутантного транскрипта и транскрипта дикого типа позволяло получить два значения Ct, которые использовали для определения соотношения мутантного и нормального транскриптов в пробе по ранее о писанному методу (Germer S. et al., 2000). Процент мутантных транскриптов рассчитывали по формуле % MUT = 1/(2Ct(mut-wt)+ 1) 100.
Уровень экспрессии транскрипта р210 BCR-ABL
Экспрессия типичного для ХМЛ транскрипта р210 гена BCR-ABL была обнаружена у всех включенных в исследование пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ (n=92). У ровень экспрессии p210 BCR-ABL относительно контрольного гена ABL значительно варьировал, медиана составила 98, диапазон от 1 до 474 копий BCR-ABL на 100 копий ABL. У пациентов в фазе акселерации и бластного криза уровень экспрессии p210 BCR-ABL был лишь в незначительной степени повышен по сравнению с группой пациентов в хронической фазе ХМЛ (р = 0,65, рис. 8).
Уровень экспрессии транскрипта р210 гена BCR-ABL в группе больных, получавших терапию ИТК второго поколения после развития резистентности к иматинибу, был также незначительно повышен по сравнению с группой больных, получавших только иматиниб (рис. 9).
Таким образом, у ровень экспрессии гена BCR-ABL у больных ХМЛ, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ, варьирует в широком диапазоне. Не было получено данных, свидетельствующих об ассоциации высокого уровня экспрессии BCR-ABL с фазой заболевания или предшествующей терапией ИТК второго поколения. Рис. 9. Уровень относительной экспрессии транскрипта р210 гена BCR-ABL у больных ХМЛ в группах с резистентностью к иматинибу и ИТК второго поколения Интересной особенностью ХМЛ является довольно часто обнаруживаемая коэкспрессия второго химерного транскрипта, р190, гена BCR-ABL. В исследованной группе пациентов коэкспрессия химерного транскрипта p190 была отмечена у половины больных, причем уровень экспрессии p190 относительно экспрессии гена ABL был низким (медиана 1,0, диапазон 0,02 - 12,7). Наличие коэкспрессии р190 было ассоциировано с высоким уровнем экспрессии р210 (p = 0,0156, рис. 10). Была обнаружена тенденция к более высокой частоте встречаемости коэкспрессии р190 BCR-ABL в группе пациентов в фазе акселерации и бластного криза по сравнению с группой в хронической фазе, однако наблюдаемая тенденция не достигла уровня статистической значимости (р=0,1931). Рис. 10. Уровень относительной экспрессии транскрипта р210 гена BCR-ABL у больных ХМЛ в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии транскрипта р190 BCR-ABL Между группами пациентов, резистентных к иматинибу и ИТК второго поколения статистически значимых различий в частоте коэкспрессии р190 BCR-ABL обнаружено не было (р=0,6404). В исследуемой группе пациентов уровень экспрессии транскрипта р190 был в среднем в 100 раз ниже, чем уровень экспрессии транскрипта р210 BCR-ABL, что свидетельствует скорее о нарушениях в механизмах, контролирующих альтернативный сплайсинг, чем о ведущей роли транскрипта р190 в патогенезе заболевания и развитии резистентности. При исследовании мутационного статуса гена BCR-ABL методом прямого секвенирования у 36 из 92 (38%) пациентов с резистентностью к ИТК были выявлены различные мутации, представляющие собой замены единичных нуклеотидов в последовательности ДНК. Была отмечена тенденция к ассоциации мутаций в гене BCR-ABL c повышенным уровнем экспрессии этого же гена (рис. 11), что подтверждает выводы проведенных ранее исследований (Barnes D.J. et al., 2005).
Всего было обнаружено 13 различных мутаций, частота встречаемости которых значительно варьировала. Полный спектр и частота выявленных мутаций представлены на рисунке 12. Мутации T315I, G250E, Y253H, F317L, E255K и F359C обнаруживались с наибольшей частотой, частота их встречаимости составила 26% (n=10), 18% (n=7), 13% (n = 5), 11% (n=4), 8% (n=3) и 5% (n=2) соответственно. Другие мутации (G250E, Q252Hc, E255V, V299L, F359V, H396P и H396R) были выявлены только в одном случае каждая. У пяти (13%) пациентов были обнаружены двойные мутации, у троих из них обе мутации присутствовали в 100% клеток, у двоих же, по-видимому, сосуществовали два различных клона лейкозных клеток, несущих две различные мутации, по одной мутации в каждом клоне. Рис. 12. Спектр и частота мутаций в киназном домене гена BCR-ABL у больных ХМЛ с резистентностью к ИТК
Как показал анализ наблюдаемого спектра мутаций, изменениями были затронуты только 9 аминокислотных остатков в последовательности белка BCR-ABL. Их частота, а также пространственное расположение в структуре киназы BCR-ABL в комплексе с иматинибом представлены на рисунке 13. Рис. 13. Локализация обнаруженных мутаций (желтый цвет) в структуре киназного домена белка BCR-ABL (фиолетовый цвет) в комплексе с иматинибом (красный цвет) и их частота у больных ХМЛ с резистентностью к ИТК Как видно на рисунке, почти все мутации затронули участки молекулы белка BCR-ABL, непосредственно взаимодействующие с ИТК. Распределение мутаций по функциональным участкам киназного домена BCR-ABL было следующим: 48% мутаций были локализованы в Р-петле (G250, Q252, Y253, E255) и 6 % (Н396) в А-петле. Нетипичные мутации в киназном домене BCR-ABL Согласно литературным данным, подавляющее большинство мутаций в киназном домене гена BCR-ABL, ассоциированных с резистентностью к терапии ИТК, являются миссенс-мутациями, приводящими к замене одной аминокислоты в белке BCR-ABL на другую. Остальные же типы мутаций встречаются крайне редко. В нашей группе пациентов мы наблюдали такую же закономерность. Однако у одного из пациентов структура киназного домена BCR-ABL была довольно нетипичной. Помимо мутации T315I были обнаружены три делеции -del P296-G303, del L341-I347 и del G383389 (рис. 14). Пространственное расположение делеций в структуре белка BCR-ABL таково, что белок с этими делециями полностью утрачивает тирозинкиназную активность (рис. 15). Несмотря на это, у пациента наблюдалась резистентность как к иматинибу, так и к ИТК второго поколения, что косвенно свидетельствует о том, что BCR-ABL независимые механизмы патогенеза ХМЛ и резистентности к терапии ИТК могут полностью компенсировать утраченную тирозинкиназную активность BCR-ABL.
