Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе атеросклероза 12
1.1.1. Ишемическая болезнь сердца и атеросклероз артерий нижних конечностей как клинические осложнения атеросклероза 16
1.2. Факторы риска развития атеросклероза 18
1.3. Биохимические основы метаболизма метионина, гомоцистеина и фолатов 21
1.4. Механизмы атерогенного действия гомоцистеина 27
1.5. Роль гипергомоцистеинемии в возникновении атеросклероза и его клинических осложнений 32
1.6. Факторы риска развития гипергомоцистеинемии 39
1.7. Генетически обусловленная гипергомоцистеинемия
1.7.1. Гомоцистеинурия 41
1.7.2. Аллельный полиморфизм генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма метионина и фолатов 42
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материал исследования 55
2.2. Методы исследования 57
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Анализ ассоциативных связей между генотипами по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD, уровнем гомоцистеина в плазме и риском возникновения ишемической болезни сердца
3.1.1. Изучение ассоциативных связей между генотипами по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD и концентрацией гомоцистеина в плазме крови у больных с ишемической болезнью сердца 62
3.1.2. Особенности распределения генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с ишемической болезнью сердца .
3.2. Анализ ассоциативных связей между генотипами по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD, уровнем гомоцистеина в плазме и риском возникновения атеросклероза артерий нижних конечностей
3.2.1. Изучение ассоциативных связей между генотипами по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD и концентрацией гомоцистеина в плазме крови у больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей 70
3.2.2. Особенности распределения частот генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей
3.3. Изучение ассоциативных связей между генотипами по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD и концентрацией гомоцистеина в общей группе больных с атеросклеротическим поражением артерий 81
3.4. Особенности распределения генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с атеросклеротическим поражением артерий при наличии ряда классических факторов риска атерогенеза
3.4.1. Распределение генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD в группах курящих и некурящих больных с атеросклеротическим поражением артерий 87
3.4.2. Анализ ассоциативных связей между аллельными вариантами генов MTHFR, MS, MTRR, MTHFD и риском развития артериальной гипертензии у пациентов с атеросклеротическим поражением артерий 91
Глава 4. Обсуждение результатов 95
Выводы 124
Список литературы
- Механизмы атерогенного действия гомоцистеина
- Методы исследования
- Особенности распределения генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с ишемической болезнью сердца
- Распределение генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD в группах курящих и некурящих больных с атеросклеротическим поражением артерий
Введение к работе
Актуальность темы.
Сердечно-сосудистая патология, обусловленная атеросклеротическим поражением артерий, с середины XX века является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности населения в развитых странах. Классические факторы риска развития атеросклероза (курение, артериальная гипертензия, дислипопротеинемии, сахарный диабет и пр.) не могут полностью объяснить генез заболеваемости и смертности от кардиоваскулярной патологии. В связи с этим, пристальное внимание уделяется углублению понимания процесса развития атеросклеротического поражения сосудов и поиску триггерных факторов его возникновения. Особое место в литературе отводится выявлению причин генетической предрасположенности к развитию данного патологического процесса.
К доказанным факторам риска развития атеросклеротических и протромботических изменений относят гипергомоцистеинемию (ГГЦ) -повышенное содержание в плазме крови аминокислоты гомоцистеина (ГЦ). Атерогенное действие, оказываемое избытком гомоцистеина, является комплексным и может быть объяснено, прежде всего, патологическими изменениями в сосудистой стенке (Петрищев Н.Н., 2007; Dhillon В. et al., 2003; Roybal С. et al., 2004; Wang H. et al., 2002; Zhang С et al., 2001). Возникающая при этом дисфункция эндотелия характеризуется угнетением его антикоагулянтных и активацией прокоагулянтных свойств (Durand P. et al., 2001; Harpel P. et al., 1996; Joseph J. et al., 2003; Markis M., 2000).
Повышение уровня гомоцистеина в плазме крови может быть вызвано приобретенными и генетическими факторами. Большинство из них прямо или опосредованно вызывают нарушения в метаболическом цикле данной аминокислоты. Приобретенная ГГЦ возникает, прежде всего, вследствие воздействия факторов, провоцирующих развитие витамино-дефицитных состояний (De Bree A. et al., 2001; Nygard О. et al., 1998). "Генами-кандидатами", обуславливающими наследственную предрасположенность к развитию ГГЦ, являются гены ферментов, непосредственно вовлеченных в регуляцию метаболизма метионина и фолатов.
Имеющиеся в литературе данные о влиянии аллельных вариантов генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма метионина и фолатов на уровень ГЦ в плазме крови и риск возникновения атеросклеротического поражения артерий весьма противоречивы (Laraqui A. et al., 2006; Lewis S. et al., 2005; Lievers K. et al, 2001; Klerk M. et al., 2003; Kluijtmans L. et al., 2003). В частности, ни одна из ассоциативных связей не была однозначно подтверждена всеми исследователями.
Принимая во внимание разнообразие патогенетических механизмов, лежащих в основе возникновения ГГЦ и атеросклероза, важным при установлении генетических детерминант, предрасполагающих к развитию данных патологических состояний, является сочетанныи анализ генетических вариантов (так называемый анализ "ген-генных взаимодействий"). Работы,
направленные на анализ ген-генных взаимодействий крайне немногочисленны. В популяции Северо-Западного региона России подобные исследования не выполнялись.
Все вышесказанное определило значимость изучения влияния аллельного полиморфизма генов метаболизма метионина и фолатов на риск возникновения ГГЦ и атеросклеротического поражения артерий и явилось основанием для проведения данного исследования.
Цель исследования.
Установить роль аллельного полиморфизма генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов в развитии гипергомоцистеинемии и атеросклеротического поражения артерий различной локализации.
Задачи исследования.
-
Выявить ассоциативные связи между носительством аллельных вариантов генов метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR С677Т и А1298С), метионин синтазы (MS A2756G), редуктазы метионин синтазы (MTRR A66G), метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (MTHFD G1958A) и уровнем ГЦ в плазме крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и атеросклерозом артерий нижних конечностей (ААНК).
-
Определить генотипические сочетания аллельных вариантов генов MTHFR, MS, MTRR, MTHFD ("ген-генные взаимодействия"), ассоциированные с риском развития ГГЦ у больных с атеросклеротическим поражением артерий
-
Провести сравнительный анализ частот встречаемости генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных ИБС, ААНК и в контрольной группе. На основании анализа "ген-генных взаимодействий" выявить генотипические сочетания, ассоциированные с риском развития ИБС и ААНК.
-
Провести сравнительный анализ распределения генотипов по генам между пациентами с ИБС, ААНК и больными ААНК с наличием в анамнезе клинически и инструментально подтвержденных осложнений, связанных с атеросклеротическим поражением коронарных артерий.
-
Изучить ассоциативные связи между генотипом индивида и некоторыми общепризнанными индукторами атерогенеза у больных с атеросклеротическим поражением артерий.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Полиморфизм генов метионинового и фолатного циклов является важной генетической составляющей, оказывающей влияние на уровень ГЦ в плазме крови. Аллельные варианты MTHFR 677ТТ, MTHFR 1298АА, MS 275 бАА и в особенности их сочетания, являются существенными генетическими предпосылками развития ГГЦ.
-
Аллельный полиморфизм генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов оказывает существенное влияние на риск развития
ИБС и ААНК. Генетические варианты MTHFR 677Т , MTHFR 1298АА и MS 2756АА реализуют свой неблагоприятный эффект через развитие ГГЦ. Генотипическое сочетание MTRR 66GG/MTHFD 1958GA ассоциировано с риском развития указанных заболеваний независимо от уровня ГЦ в плазме. 3. Общий характер закономерностей, выявленных при изучении ассоциативных связей между аллельным полиморфизмом генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов, уровнем ГЦ в плазме, а также риском возникновения ИБС и/или ААНК свидетельствует об универсальности механизмов генетической предрасположенности к развитию ГГЦ и атеросклеротическому поражению артерий.
Научная новизна.
Впервые определены частоты встречаемости аллельных вариантов генов MTHFR А1298С, MS A2756G, MTRR A66G, MTHFD G1958A и их сочетаний у больных ИБС и ААНК с учетом содержания ГЦ в плазме, и в здоровой популяции Северо-Западного региона России.
Впервые показано, что генотипы MTHFR 1298АА, MS 2756АА, а также, сочетания MTHFR 677TT/MTHFR 1298АА, MTHFR 677TT/MS 2756АА, MTHFR 1298AA/MS 2756АА являются существенными генетическими предикторами развития ГГЦ у больных ААНК и ИБС, проживающих в Северо-Западном регионе России.
Установлено, что увеличение риска развития ИБС и ААНК у лиц с неблагоприятными генотипами MTHFR 677СТ и 677ТТ, MS 2756АА, а также их сочетаниями, наблюдается только при наличии ГГЦ.
Впервые показано, что генотипическое сочетание MTRR 66GG/MTHFD 1958GA ассоциировано с риском развития атеросклеротического поражения артерий вне зависимости от уровня ГЦ в плазме.
Практическая значимость.
Полученные данные способствуют более эффективному выделению лиц группы риска развития ГГЦ, что позволит повысить эффективность профилактических мероприятий по снижению частоты сердечно-сосудистых заболеваний в популяции.
Использование результатов генотипирования полиморфизма генов MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с венозной и артериальной патологией может способствовать повышению качества прогнозирования и профилактики повторных тромботических осложнений.
Данные о частотах встречаемости генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD в здоровой популяции могут быть использованы в качестве референтных при изучении предрасположенности к различным заболеваниям.
Апробация материалов диссертации.
Положения диссертационной работы были представлены на Международных Конгрессах по тромбозу и гемостазу: 2007 год - Женева, Швейцария, 2009 год - Бостон, США; Всероссийских научно-практических конференциях "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.), Всероссийской конференции с международным участием "Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 2009 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 2010), Международной конференции "Математическая биология и биоинформатика" (Москва, 2010).
Внедрение результатов исследования в практику.
Полученные результаты используются при обследовании больных с сердечно-сосудистой патологией, находящихся на лечении в КО "Хирургия" ФГУ "РосНИИГТ" ФМБА России, а также направляемых на обследование из других медицинских учреждений города.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ.
Структура и объем диссертации.
Механизмы атерогенного действия гомоцистеина
Клиническая картина атеросклероза зависит от его локализации и характера поражения артерии. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) -патологическое состояние, возникающее в результате нарушения равновесия между коронарным кровотоком и метаболическими потребностями сердечной мышцы [23]. Главным фенотипическим проявлением ИБС выступает атеросклеротическое повреждение стенок коронарных артерий с образованием атеросклеротических бляшек, которые формируют так называемый фиксированный коронарный стеноз. Однако сужение просвета сосудов создает препятствие кровотоку лишь при значительном стенозировании (гемодинамически значимым считается стеноз, приводящий к уменьшению поперечного просвета по крайней мере на 75%). Согласно имеющимся данным [23], уже в первый год и даже первые месяцы от начала клинических проявлений ИБС у большинства больных, в том числе и молодого возраста, обнаруживается функционально значимое поражение коронарного русла, а при типичной стенокардии напряжения функционально значимое поражение коронарных артерий выявляется у 90-96% пациентов. Под ИБС подразумеваются как острые, так и хронические патологические состояния. Наиболее опасным является развитие острой ишемии миокарда -состояния, требующего неотложной помощи для предотвращения критических для жизни осложнений. В его основе лежит разрыв или частичная эрозия атеросклеротической бляшки с локальным тромбообразованием, изменением реакции сосудистой стенки и резким нарушением кровоснабжения участка сердечной мышцы [136].
Согласно данным аналитического обзора, выполненного Харченко В.И. и соавт. [25], смертность от ишемической болезни сердца в России в 1,7 раза превышает соответствующий показатель для экономически развитых стран и составляет 28% от всех случаев летального исхода среди населения. Причем, анализ динамики возрастных показателей смертности населения от ишемической болезни сердца в России свидетельствует о значительном омоложении летальности от этой патологии
Другим заболеванием, обуславливаемым атеросклеротическим поражением артерий, является атеросклероз артерий нижних конечностей (ААНК). Согласно результатам ряда эпидемиологических исследований [65, 116, 182], распространенность ААНК варьируется в пределах от 3% до 10% среди лиц моложе 70 лет, и достигает 15-20% в возрастной группе старше 70 лет. Выделяют асимптомные и симптомные формы течения данного заболевания, соотношение между которыми, по имеющимся данным, составляет 1:3-1:4 [7]. Асимптомные формы ААНК могут быть определены при использовании неинвазивных методов исследования, прежде всего, измерения лодыжечно-плечевого индекса (отношение систолического артериального давления на нижних конечностях к систолическому артериальному давлению на верхних конечностях, определяемое с помощью ультразвуковых приборов). Снижение данного показателя = 0,9 обычно вызвано гемодинамически значимым стенозом артерии. Интересно отметить, что, по результатам аутопсий среди взрослого населения, у 15% мужчин и у 5% женщин, не предъявлявших при жизни жалоб, были выявлены гемодинамически значимые стенозы артерий нижних конечностей [7].
Симптомный ААНК в 80% случаев является причиной развития хронической артериальной недостаточности (ХАН). Данное патологическое состояние сопровождается гипоксией, дистрофическими и атрофическими изменениями сосудистой стенки, а также разрастанием соединительной ткани [13, 14, 64]. В зависимости от степени выраженности клинической симптоматики выделяют четыре степени тяжести ХАН (по классификации Фонтейна-Покровского). Неуклонно прогрессирующее течение, переход одной стадии в другую, развитие ишемии и постоянный болевой синдром -главные особенности течения симптомного ААНК [7].
Согласно данным Grundy S. et al. [106] и Steg P. et al. [188], атеросклероз артерий нижних конечностей можно рассматривать как значимый предиктор системного атеросклероза, а по риску развития критических осложнений ААНК сопоставим с атеросклерозом коронарных артерий [106, 188]. Так, Criqui М. et al. оценили, что у пациентов с ААНК риск летального исхода от сердечно-сосудистых осложнений в 6 раз выше, чем у лиц, не имеющих данного диагноза [66]. По данным Murabito J. et al. вероятность смерти в 10-летний период у пациентов с атеросклерозом артерий нижних конечностей составляет около 40%, причем, несмотря на широкое применение антиатерогенных препаратов нового поколения, данный показатель не претерпел существенных изменений с 1950 года [164].
Методы исследования
Интересные результаты были получены в мета-анализе, проведенном Lewis S. et al. [146]. На основании сравнения работ по данной теме, выполненных в различных регионах мира (Азия, Австралия, Ближний Восток, Северная Америка и Европа), авторы пришли к заключению, что имеется корреляция между величиной оцениваемого риска развития кардиоваскулярного осложнения (атеросклероза коронарных артерий и/или инфаркта миокарда) и разницей между средними концентрациями ГЦ в группах лиц с гомозиготным носительством аллелей 677Т и 677С по гену MTHFR. По оценкам авторов, увеличение различия по уровню ГЦ между носителями генотипов 677ТТ и 677СС на 1 мкмоль/л повышает риск развития сердечно-сосудистого осложнения до 1,1 раза. Однако это наблюдение требует дальнейшего изучения и уточнения в связи с ограничениями, которыми обладает любой мета-анализ [146].
Ген метионин синтазы (MS) так же, как и ген MTHFR, локализован на первой хромосоме (lq34), обладает высокой степенью гомологии с аналогичными генами других видов млекопитающих и имеет подобную MTHFR структуру промоторной области. Ген метионин синтазы содержит 12 экзонов и кодирует белок с молекулярным весом около 140 кДа, состоящий из 1265 аминокислот. Белок содержит три домена: N - терминальный домен отвечает за связывание белков, принимающих участие в качестве кофакторов в реакциях восстановления гомоцистеина; центральный домен строго консервативен и связывает кобаламин, в то время как С-терминальный домен является регуляторным [54,156].
Полиморфизм A2756G в гене MS приводит к замене аспарагиновой кислоты на глицин (D919G) на участке а-спирали между двумя доменами — центральным и регуляторным [144, 195]. Данный участок содержит сайты связывания кофакторов в реакции восстановления гомоцистеина.
Аспарагиновая кислота является полярной аминокислотой, поэтому замена ее на неполярную аминокислоту глицин может приводить к изменению третичной структуры метионин синтазы и ее функциональной активности [201]. В свою очередь, изменение активности метионин синтазы может оказывать влияние на уровень ГЦ в плазме крови.
Имеющиеся в литературе данные об ассоциации между полиморфным вариантом A2756G и уровнем ГЦ неоднозначны: согласно результатам одних исследований эта замена приводит к снижению уровня гомоцистеина [193, 201], в то время как другие работы свидетельствуют об обратном эффекте [86, 139], либо об отсутствии рассматриваемой взаимосвязи [131, 133, 199]. Так, авторы Laraqui A. et al. [139, 140] наблюдали существенный вклад аллеля 2756G в умеренное повышение концентрации ГЦ у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий, а также в здоровой популяции. В исследовании Jing Ma et al. [150] авторы изучали влияние аллельного полиморфизма MS A2756G на концентрацию ГЦ у больных раком ободочной и прямой кишки, а также в группе здоровых лиц. Однако проведенный анализ не выявил существенных различий по содержанию в плазме гомоцистеина, а также фолата и витамина Bi2 между носителями различных генотипов и в группе больных, и в контроле. Отсутствие влияния полиморфизма A2756G на уровень ГЦ у больных с атеросклерозом коронарных артерий и в группе контроля отмечалось в работе Kruger W. et al.[138]. Однако в большинстве исследований повышение содержания ГЦ в плазме крови связывают с носительством "нормального", т.е. более распространенного в популяции аллеля 2756А, тогда как аллель 2756G характеризуется как протективный в отношении риска развития ГГЦ [56, 113, 150, 185, 193]. Так, на основании обследования группы здоровых мужчин работоспособного возраста, ирландские авторы Harmon D. et al. [113] сделали вывод, что полиморфизм A2756G ассоциирован с изменением концентрации ГЦ, а генотип 2756АА вносит достоверный вклад в повышение его уровня. Причем, в исследовании отмечается, что выявленная ассоциация не зависит от уровней фолата и витамина Bi2, но наиболее сильно выражена у лиц с низким содержанием витамина В6. С другой стороны, при обследовании проживающих в Финляндии здоровых женщин детородного возраста, было установлено, что носительство аллеля 2756G ассоциировано с более интенсивным снижением уровня ГЦ в плазме в ответ на диету с высоким содержанием натуральных фолатов (в составе овощей и фруктов) [185]. В работе, выполненной Yates et al. (Великобритания) [229], наиболее низкий уровень ГЦ и, напротив, наиболее высокие уровни витамина BJ2 и фолатов наблюдались у гетерозигот по полиморфизму A2756G гена метионин синтазы. По мнению авторов, этот результат находится в соответствии с полученными ими данными о снижении риска возникновения тромботических эпизодов у носителей аллеля 2756G. Следует отметить, что снижение уровня ГЦ у гетерозигот MS 2756AG по сравнению с лицами, имеющими нормальный генотип 2756АА отмечалось как среди пациентов с тромботическими заболеваниями, так и в группе контроля.
В отличие от нуклеотидной замены С677Т и А1298С в гене MTHFR, исследования, посвященные изучению ассоциации между аллельными вариантами по полиморфизму A2756G гена MS и риском возникновения атеросклеротического поражения артерий немногочисленны. В большинстве из них достоверных различий в распределении генотипов среди больных и в контроле не было выявлено [138,139].
Ген редуктазы метионинсинтазы (MTRR) локализован на 5 хромосоме (5р15.2-р15.3) и характеризуется низкой и практически одинаковой экспрессией во всех тканях [143]. Подобно генам MTHFR и MS, у гена MTRR в области промотора имеется несколько сайтов связывания транскрипционных факторов, однако отсутствует ТАТА-бокс [143]. Ген содержит 15 экзонов и кодирует протеин из 698 аминокислот с молекулярной массой около 77 кДа.
Особенности распределения генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с ишемической болезнью сердца
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов с помощью солевого метода [160]. К 3-5 мл венозной крови, стабилизированной ЭДТА в конечной концентрации 0,25%, добавляли равный объем холодной (+4С) бидистиллированной воды и тщательно перемешивали содержимое переворачиванием пробирки в течение 30 секунд. Осадок, полученный в результате центрифугирования в течение 10 мин при 2000g, суспендировали в 2.5 мл раствора, содержащего ЮмМ Трис-НСІ, рН 8,0; 0,4М NaCl; 2мМ ЭДТА; 0,5% додецилсульфат натрия и протеиназу К в конечной концентрации 125 мкг/мл. После инкубации в течение ночи при 37 С белки удаляли добавлением 1/3 объема 5М NaCl с последующим интенсивным перемешиванием и центрифугированием в течение 20 мин при 5500g. ДНК осаждали из надосадочной жидкости двумя объемами этилового спирта, наматывали на стеклянную палочку и после подсушивания при комнатной температуре растворяли в 200 мкл бидистиллированной воды. После растворения ДНК определяли ее концентрацию путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 260 нм.
В таблице 2 представлен список исследованных в работе однонуклеотидных замен, приводящих к полиморфизму генов MTHFR, MS, MTHFD с указанием метода генотипирования и оригинального источника. Для детекции аллельных вариантов указанных генов осуществляли амплификацию участков геномной ДНК, включающих соответствующие нуклеотидные замены, на основе технологии ПЦР. Стандартная реакционная смесь объемом 15 мкл содержала: 67 мМ Трис-HCI, рН 8.8; 1,5 мМ MgC12; 16,6 мМ сульфат аммония; 0,01% Твин-20; 200 мкМ каждого из дезоксирибонкулеотидфосфатов (ООО "Сибэнзим", Россия); 500 нМ каждого из праймеров (ЗАО "Синтол", Россия); 1 ед. Taq-полимеразы (ООО "Силекс", Россия) и 30-300 нг образца геномной ДНК.
Ген (сокращение) Локализация Полиморфизм Метод Источник Метилентетрагидро-фолат редуктаза (MTHFR) ІрЗб.З С677Т (Ala222Val) ГЩР-ПДРФ 93 Метилентетрагидрофолат-редуктаза(MTHFR) ІрЗб.З А1298С (Е433А) ГЩР-ПДРФ 200 Метионин синтаза (MS) lq34 A2756G (D919G) ГЩР-ПДРФ 142 Редуктаза метионин-синтазы (MTRR) 5р15.2-р15.3 A66G(I22M) ПЦР-ПДРФ 141 Метилентетрагидроф олат дегидрогеназа (MTHFD) 14q24 G1958A (R653Q) ПЦР-ПДРФ 43 Идентификацию аллельных вариантов осуществляли с помощью анализа длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта (метод ПЦР-ПДРФ). После проведения 35 циклов ПЦР, образовавшийся амплификат инкубировали с 10 ед. специфической эндонуклеазы рестрикции в условиях, рекомендуемых поставщиком (ООО "Сибэнзим", Россия). Продукты рестрикции анализировали с помощию электрофореза в 7% (для MTHFR А1298С - в 10%) полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистим этидием в концентрации 1 мкг/мл [15]. На рис. 2 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР с результатами генотипирования по аллельным вариантам генов MTHFR, MS, MTRR, MTHFD.
Электрофореграмма продуктов ПЦР при генотипировании аллельных вариантов генов MTHFR С677Т и А1298С, MS A2756G, MTRR A66G, MTHFD G1958A методом ПЦР-ПДРФ. Статистическая обработка результатов была выполнена на персональном компьютере с использованием целого ряда современных статистических программ. Расчет выборочных статистических показателей описательной статистики был выполнен с использованием программы GraphPad Prism (версия 4). Наряду со средним значением - популярной оценкой параметра положения статистического распределения, использовался показатель среднее геометрическое. Среднее геометрическое дает более правильное представление о среднем, когда отдельные значения в статистической совокупности удалены от других значений, что постоянно встречается на практике. Для непрерывной переменной (содержания ГЦ в плазме) проведена проверка на нормальность распределения всех выборок.
Установление нормальности распределения осуществлялось с помощью программ AtteStat (версия 12.2) и Past (версия 1.82Ь). Методы, представленные в данном программном обеспечении, выдают фактически достигнутый уровень значимости, иначе р-значение, позволяющее сделать вывод, соответствует ли распределение эмпирической выборки, измеренной в количественной шкале, нормальному распределению. Поскольку в большинстве случаев наблюдалось отклонение от нормального распределения (р было существенно меньше установленного уровня значимости 0,05), для дальнейшего анализа количественных данных было принято решение об использовании непараметрических тестов.
С целью установления ассоциативных связей между генотипами по изучаемым генам и содержанием гомоцистеина в плазме крови применялись методы дисперсионного анализа. Для проверки статистической однородности сравниваемых выборок (содержание ГЦ в плазме у носителей различных генотипов по изучаемым полиморфизмам) был использован критерий Краскела-Уоллиса. Рассматриваемые выборки считались неоднородными, если фактически достигнутый уровень значимости р был меньше установленного уровня значимости 0,05. В тех случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность, для последующего
Распределение генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD в группах курящих и некурящих больных с атеросклеротическим поражением артерий
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния аллельного полиморфизма генов ферментов метаболизма метионина и фолатов на риск возникновения ГТЦ (угроза гиперкоагуляционного сдвига) и атеросклеротического поражения артерий (гемодинамические нарушения кровотока). В соответствии с поставленной целью, диссертационная работа была выполнена на основании результатов, полученных при обследовании лиц с различными проявлениями артериальной патологии - 99 пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца и 126 больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей. В группу сравнения был включен 121 донор крови. Пациенты и доноры являются жителями Северо-Западного региона России.
Анализ ассоциативных связей между полиморфными вариантами генов MTHFR С677Т и А1298С, MS A2756G, MTRR A66G, MTHFD G1958A, риском развития ГГЦ и атеросклеротического поражения артерий в группах больных ИБС и ААНК выполнялся по единому плану. На первом этапе исследования была проанализирована взаимосвязь между носительством аллельных вариантов генов MTHFR, MS, MTRR, MTHFD и содержанием ГЦ в плазме. Выполненный анализ продемонстрировал идентичность результатов для пациентов с ИБС и ААНК. Так, было установлено, что и в той, и в другой группе больных имелась корреляция между уровнем ГЦ и однонуклеотидными заменами 677 С- Т и 1298 А- С в гене MTHFR, а также наблюдалась тенденция к изменению содержания ГЦ в зависимости от генотипа по полиморфному варианту A2756G гена MS. Аналогичный анализ, выполненный в отношении вариантов MTRR A66G и MTHFD G1958A не выявил их значимого влияния на содержание ГЦ.
Идентичность результатов, полученных для пациентов с ИБС и ААНК, закономерна и является отражением единообразия процессов, связанных с метаболизмом гомоцистеина, вне зависимости от выявленного бассейна атеросклеротического процесса. В связи с этим, представлялось обоснованным объединение этих больных в единую группу.
Анализ влияния полиморфного варианта гена MTHFR С677Т на содержание ГЦ у больных с атеросклеротическим поражением артерий (объединенная группа, в которую включены пациенты с диагнозом атеросклероз артерий нижних конечностей и ишемическая болезнь сердца) продемонстрировал, что между носителями генотипов 677СС, 677СТ и 677ТТ наблюдались существенные различия по уровню ГЦ (р=0,0002) (рис.3). Причем следует подчеркнуть, что статистически высоко значимыми являлись различия по уровню ГЦ не только между группами лиц с гомозиготным носительством "Т" и "С" аллельных вариантов ("ТТ" против "СС" р=0,0007; ДГЦ=6,2 мкмоль/л), но также и в группе гетерозигот 677СТ по сравнению с "нормальным" 677СС вариантом (р=0,01; АГЦ=3,1 мкмоль/л).
Ассоциация между генотипами по полиморфному варианту MTHFR С677Т и содержанием ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий. Фермент MTHFR осуществляет конверсию 5,10 метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат - основную циркуляторную форму фолатов в организме и донора метильной группы в реакции восстановления гомоцистеина в метионин (см.рис.ІА). Ген, кодирующий данный фермент, локализован на первой хромосоме (ІрЗб.З) и обладает высокой степенью гомологии с другими видами млекопитающих. Вариабельные позиции С677Т и А1298С расположены в области гена, кодирующей каталитический домен.
Согласно имеющимся данным, полиморфный вариант С677Т гена влияет на активность фермента MTHFR. Выполненные in vitro рядом авторов оценки свидетельствуют о снижении активности у гетерозигот 677СТ на 30-35% и гомозигот по мутантному "Т" аллелю на 60-70% по сравнению с уровнем активности нормального (677СС) фермента [93, 108]. Однако, активность "дефектного" фермента может быть скорректирована путем увеличения концентрации 5-метил-тетрагидрофолата [108].
Несмотря на однозначность выводов о влиянии полиморфного варианта С677Т на ферментативную активность MTHFR, сведения об ассоциации между С677Т полиморфным вариантом и уровнем ГЦ носят противоречивый характер. Согласно данным, представленным в мета-анализе Lewis S. et al. [146], показатель АГЦ (разница между концентрациями для рассматриваемых генотипов) при сравнении между гомозиготными вариантами в различных популяционных группах варьируется в пределах от -0,8 мкмоль/л (т.е. концентрация незначительно повышена в группе носителей 677СС по сравнению с 677ТТ генотипом) до 8,8 мкмоль/л (сильно выраженное различие по уровню ГЦ между лицами с носительством 677ТТ и 677СС генотипов). Следует подчеркнуть, что с целью минимизации эффекта от внутри-лабораторных погрешностей в измерении концентрации ГЦ, для сравнения используется именно показатель АГЦ, а не абсолютные значения уровня ГЦ [146]. Противоречивость результатов, представленных в мета-анализе Lewis S. et al., прежде всего, связывают с различными рационами питания (в частности, употреблением в пищу витаминов группы В) в "изучаемых выборках [33,146]. Недаром минимальным данное различие является в США и Канаде (усредненный показатель ЛГЦ для Северной Америки составил 1,35), где принята национальная программа по обогащению зерновых культур фолатами. Для Европы усредненный показатель АГЦ несколько выше и согласно результатам исследования Lewis J. et al. составляет 2,03. В популяции Северо-Западного региона России данный показатель оказался равным 6,02 мкмоль/л, что существенно превышает аналогичные усредненные показатели для США, Европы, но является ниже, чем для стран Среднего Востока (8,80 мкмоль/л). Следует отметить, что в обследованной нами группе пациентов 68,1% больных являлись курильщиками. Известно, что никотин является антогонистом фолиевой кислоты. Поэтому, выявленное нами сильно выраженное влияние аллельного варианта С677Т на уровень ГЦ может быть объяснено не только диетой, в среднем достаточно бедной фруктами и овощами для жителей нашего региона [1], но и наличием такого неблагоприятного фактора, как курение. Возможно, благодаря сочетанию двух вышеназванных внешних неблагоприятных факторов, существенное повышение уровня ГЦ было выявлено не только в группе гомозигот 677ТТ, но и среди гетерозигот 677СТ по сравнению с "нормальным" 677СС вариантом гена MTHFR.
В отличие от полиморфного варианта С677Т, данные о влиянии нуклеотидной замены А1298С на ферментативную активность MTHFR1 противоречивы [200, 216, 227]. Тем более дискуссионным является вопрос о связи между полиморфным вариантом А1298С и уровнем ГЦ. Выполненный нами анализ продемонстрировал статистическую неоднородность значений уровня ГЦ между группами пациентов с генотипами 1298АА, 1298АС и 1298СС генотипами (р=0,003), что свидетельствует о наличии ассоциации между полиморфным вариантом А1298С и содержанием ГЦ (рис.4А).
