Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Современные представления об этиопатогенезе венозного тромбоза 17
1.2. Эндотелиальная дисфункция и ее роль в патогенезе тромбозов 18
1.2.1. Методы оценки функциональной активности эндотелия 19
1.2.2. Возможные механизмы развития эндотелиальной дисфункции 21
1.2.3. Гипергомоцистеинемия и полиморфизм генов обмена метионина и фолатов 21
1.2.4. Оксидативный стресс 22
1.2.4.1. Дисбаланс оксидантной и антиоксидантной систем 22
1.2.4.2. Нарушение липидного обмена и полиморфизм генов регуляции липидного обмена 24
1.2.5. Нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодилатации 28
1.2.6. Гиперактивация локального иммунного ответа 32
1.2.7. Снижение тромборезистентности эндотелия сосудистой стенки 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Характеристика обследованных групп 38
2.2. Материал исследования 39
2.3. Методы исследования 40
Глава 3. Результаты исследования 46
3.1. Распределение аллелей и генотипов генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с венозным тромбозом 46
3.2. Анализ ген-генных взаимодействий” в группе больных с венозным тромбозом 48
3.3. Особенности полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у пациентов с различными клиническими проявлениями венозного тромбоза 55
3.3.1. Распределение аллелей и генотипов у пациентов с изолированным ТГВНК 57
3.3.2. Распределение аллелей и генотипов в группе пациентов с ТГВНК, осложненным ТЭЛА 58
3.3.3. Распределение аллелей и генотипов у пациентов с “изолированной” ТЭЛА 59
3.4. Распределение аллелей и генотипов изучаемых генов у пациентов с рецидивирующим течением венозного тромбоза 62
3.5. Распределение аллелей и генотипов изучаемых генов у пациентов с ВТ, осложнившимся развитием посттромботической болезни 65
3.6. Оценка функционального состояния эндотелия у больных с венозным тромбозом 70
3.7. Анализ взаимосвязи аллельного полиморфизма изученных генов и биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции 79
Глава 4. Обсуждение результатов 86
Выводы 103
Практические рекомендации 104
Список литературы 105
- Эндотелиальная дисфункция и ее роль в патогенезе тромбозов
- Дисбаланс оксидантной и антиоксидантной систем
- Анализ ген-генных взаимодействий” в группе больных с венозным тромбозом
- Распределение аллелей и генотипов изучаемых генов у пациентов с рецидивирующим течением венозного тромбоза
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Тромбоэмболические заболевания являются ведущей причиной смертности и инвалидизации населения в России, странах Европы и США (Харченко В.И. и соавт., 2005; Heit J.A., 2005; Dowling N.F. et. al, 2003; Heit J.A., 2008). Частота возникновения венозного тромбоза (ВТ) и тромбоэмболических осложнений в общей популяции составляет 1-2 случая на тысячу населения ежегодно (Heit J.A. et. al, 2001; Naess I.A. et al, 2007). Важной чертой ВТ является многофакторный характер его этиопатогенеза (Lijfering W. M. et. al, 2010). В последние годы убедительно доказано, что наряду с классическими факторами риска (травмы, операции, беременность и пр.) (Knudson M.M. et. al, 2004; Paffrath T. et. al, 2010; Pottier P. et. al, 2009; Zoeller B. et. al, 2012; James A.H. et. al, 2009) значительную роль в увеличении вероятности возникновения данной патологии играет генетическая предрасположенность (Franco R.F., Reistma P.H., 2001; Капустин С.И. и соавт., 2003; Brouwer J.P. et. al, 2006).
В настоящее время все большее число авторов уделяют внимание функциональному состоянию эндотелия и его роли в патогенезе различных заболеваний, сопровождающихся поражением сосудистого русла (атеросклероз, артериальная гипертензия, сахарный диабет, артериальные тромбозы) (Davignon J., 2004; Contreras F. et. al, 2000; Corey T.E. et. al, 2010). Согласно классическим представлениям, поражение сосудистой стенки является обязательным звеном патогенеза тромбоза в артериальном русле, тогда как значение этого важнейшего компонента триады Вирхова для развития ВТ долгое время оставалось под вопросом. Однако результаты проведенных в последние годы ретро- и проспективных исследований свидетельствуют о наличии общих патогенетических механизмов при артериальном и венозном тромбозе, главным из которых признается “эндотелиальная дисфункция” (ЭД) (Jerjes-Sanchez C., 2005, Migliacci R. et. al, 2007). Термином “эндотелиальная дисфункция” обозначают нарушение целостности и/или функциональных свойств сосудистого эндотелия, сопровождающееся вазоконстрикцией и усиленной продукцией веществ, обладающих провоспалительными и протромботическими свойствами (Endermann D.H., 2004).
Молекулярные механизмы развития ЭД весьма разнообразны, что объясняется наличием значительного числа факторов, осуществляющих регуляцию физиологической активности эндотелия. К числу возможных причин развития ЭД относятся: снижение концентрации оксида азота (NO), гипергомоцистеинемия (ГГц), оксидативный стресс, нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодилатации вследствие дисбаланса ренин-ангиотензиновой системы (РАС), нарушения липидного обмена, активизация локального иммунного ответа, сопровождающаяся продукцией провоспалительных цитокинов и белков острой фазы воспаления. Многофакторный генез ЭД отражается наличием значительного числа биохимических маркеров, используемых для подтверждения данного состояния, – снижение продукции NO и активности его эндотелиальной синтазы (eNOS), повышение концентрации в плазме крови растворимого тромбомодулина (sTM), ангиотензина II (AT II), фактора Виллебранда (vWF), ингибитора активатора плазминогена 1-го типа и многие другие (Петрищев Н.Н., 2007).
Степень разработанности темы. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению роли аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты иммунной (Inge A.M., 2010), антиоксидантной (Levonen A.-L. et. al, 2008; Voetsch B. et. al, 2007), ренин-ангиотензиновой (Freitas A.I. et. al, 2008) и других систем организма, в патогенезе артериального тромбоза, данные об их распространенности и ассоциации с маркерами ЭД при ВТ практически отсутствуют. В связи с этим, а также учитывая большое клиническое и социальное значение проблемы тромбоэмболических заболеваний, является актуальным установление особенностей аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ранним дебютом ВТ.
Цель исследования
Установить роль аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, в патогенезе венозного тромбоза у лиц молодого возраста.
Задачи исследования
-
Провести сравнительный анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов ряда генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных молодого возраста с ВТ и у здоровых лиц, проживающих в Северо-Западном регионе Российской Федерации.
-
Провести анализ “ген-генных взаимодействий” в группе больных с ранним дебютом ВТ и установить особенности аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с классическими формами наследственной тромбофилии.
-
Выявить особенности распределения аллелей и генотипов изучаемых генов, характерные для пациентов с различными клиническими проявлениями ВТ.
-
Изучить особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ВТ в зависимости от тяжести течения заболевания.
-
На основании анализа ряда биохимических маркеров ЭД оценить функциональное состояние сосудистой стенки у больных с ВТ, а также фенотипическое проявление полиморфизма изучаемых генов.
Научная новизна
Впервые определены частоты встречаемости (ЧВ) аллельных вариантов ряда генов (TNF-, IL-1, IL-6, PON1, TМ, EPCR), ассоциированных с ЭД, и их сочетаний у больных ВТ и в группе здоровых лиц Северо-Западного региона России. Выявлено статистически значимое увеличение доли лиц с вариантом Ins/Ins гена АСЕ и снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) гена ТМ в группе пациентов с ранним дебютом ВТ.
Проведен комплексный анализ и выявлена взаимосвязь между аллельным полиморфизмом генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и рядом биохимических маркеров ЭД (sTM, AT II, vWF, гомоцистеин – Гц, холестерин – Хс) в группе больных с ВТ.
Установлено, что ЭД является одним из важных патогенетических механизмов развития тромботического процесса в венозном русле и выявляется у 71,4% больных с ранним дебютом ВТ.
Показано, что основными предпосылками развития ЭД при ВТ являются аллельный полиморфизм генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и оксидативный стресс на фоне ГГц и/или дислипидемии. Носителями “неблагоприятных” генотипов, ассоциированных с ЭД являются 99,5% пациентов с ВТ. При этом, в 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены новые данные, которые способствуют расширению знаний о патогенезе ЭД у больных с ВТ и определению информативного комплекса методов молекулярной диагностики дисфункции эндотелия у этих пациентов с целью выявления группы риска развития тромбоэмболических осложнений и посттромботической болезни (ПТБ), а также разработки индивидуализированного подхода к лечению.
Молекулярно-генетическое обследование пациентов с ранним дебютом ВТ имеет практическое значение для составления индивидуального профиля риска и определения прогноза течения заболевания. Для стратификации риска развития тромбоэмболических осложнений у больных с тромбозом глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК) целесообразно исследование аллельного полиморфизма генов IL-1, IL-6 и TNF-. Для определения риска развития ПТБ рекомендуется молекулярно-генетическое тестирование «инсерционно-делеционного» диморфизма гена АСЕ, а рецидива ВТ – анализ полиморфизма генов АСЕ (Ins/Del) и IL-1 (–31Т/С).
Методология и методы исследования
В работе были использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (клинические, лабораторные, статистические).
На первом этапе исследования были определены ЧВ вариантов генов, ассоциированных с ЭД, у больных с ВТ и в группе контроля (КГ) и проанализирована взаимосвязь между особенностями распределения генотипов отдельных генов и риском развития ВТ. Далее для выявления наиболее тромбоопасных сочетаний вариантов различных генов был проведен анализ “ген-генных взаимодействий” в группе пациентов с ВТ, результаты которого были сопоставлены с аналогичными данными в здоровой популяции.
Возможность использования молекулярно-генетических характеристик пациента для прогнозирования течения ВТ была оценена на основании сравнительного анализа особенностей полиморфизма изученных генов в различных клинических подгруппах больных. Кроме того, в группе больных с ВТ была выполнена оценка функционального состояния эндотелия сосудистой стенки путем исследования ряда биохимических показателей, являющихся маркерами или/и факторами риска ЭД, и проведен анализ их взаимосвязи с полиморфизмом изучаемых генов. Анализ ассоциативных связей выполнялся по единому плану.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Аллельный полиморфизм генов, ассоциированных с ЭД играет значимую роль в патогенезе ВТ у лиц молодого возраста, в том числе, являющихся носителями мутаций в гене фактора V (G1691A, FV Leiden) и гене протромбина (G20210A).
-
Молекулярно-генетические механизмы развития ЭД у больных с ВТ носят гетерогенный характер и оказывают влияние, как на риск возникновения тромбоза, так и на особенности его клинического течения.
-
Генетически обусловленная склонность к повышенной продукции провоспалительных цитокинов ассоциирована с риском развития тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК.
-
Для группы пациентов с рецидивирующим течением ВТ и/или развившейся ПТБ характерно значимое увеличение частоты встречаемости генотипа Ins/Ins гена АСЕ.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации
Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом аллельного полиморфизма изучаемых генов, функционального состояния венозного эндотелия и анамнестических данных 207 больных с ВТ с использованием современных методов молекулярно-генетического, биохимического и иммуноферментного анализа, медицинской документации (истории болезни, выписные эпикризы, заключения о проведенных функциональных исследованиях), адекватных методов статистической обработки полученных данных. Апробация результатов диссертационной работы была выполнена 19 декабря 2013 года на межлабораторном заседании в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии ФМБА. Положения диссертационной работы были представлены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011, 2013 гг.), «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2012 гг.), «Беломорский симпозиум» (Архангельск, 2011 г.), «Актуальные вопросы сосудистой хирургии» (Санкт-Петербург, 2012 г.), «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2012г.), «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012 г.), «Патология гемостаза – общеклиническая проблема» (Санкт-Петербург, 2013 г.), «Противоречия современной кардиологии. Спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2013 г.), международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013 г.), международных конгрессах по тромбозу и гемостазу: XXIII (Киото, 2011 г.) и XXIV (Амстердам, 2013 г.) конгрессы Международного общества по тромбозу и гемостазу, 18-ом конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Стокгольм, 2013 г).
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационной работы используются при обследовании больных с ВТ, находящихся на стационарном или амбулаторном лечении в клиническом отделении “Хирургическая гематология”, а также получающих консультативную помощь в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.
Результаты диссертационной работы войдут в качестве фрагмента в Методические рекомендации “Генетические факторы риска венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста”.
Публикации результатов исследований
По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 3 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 35 рисунками. Библиография включает 199 источников, из них 19 – отечественных и 180 – зарубежных авторов.
Личный вклад автора
Автором лично выполнено исследование аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с ВТ и в КГ, которое включало в себя выделение ДНК, постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР), учет результатов генетического анализа; выполнен иммуноферментный анализ уровней тромбомодулина и ангиотензина II в плазме крови у обследованных лиц; произведен сбор анамнестических данных, регистрация, статистическая обработка, анализ полученных данных, обобщение результатов исследований и подготовка материалов к публикациям.
Эндотелиальная дисфункция и ее роль в патогенезе тромбозов
Несмотря на многочисленные исследования последних лет, механизмы развития ЭД до сих пор до конца не выяснены. Считается, что она имеет комплексную природу, так как очень многие биохимические процессы оказывают влияние на целостность и функциональную активность эндотелия. Наиболее вероятными механизмами развития ЭД считаются: повреждение эндотелиальных клеток в условиях оксидативного стресса и ГГц (повышенного уровня Гц в плазме крови); нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодилатации вследствие снижения продукции и/или биодоступности NO и повышенной активности РАС; активация локального иммунного ответа и формирование провоспалительного статуса [11; 37; 65; 90; 91; 138; 180; 162]. Еще одним возможным механизмом формирования ЭД является генетически обусловленный дисбаланс про- и антикоагулянтных факторов, синтезируемых эндотелием.
Гипергомоцистеинемия является доказанным фактором риска ВТ [16; 17; 61]. Гомоцистеин – это серосодержащая аминокислота, которая является промежуточным продуктом метаболизма метионина [37; 184]. Относительно постоянный уровень Гц в плазме крови поддерживается благодаря двум путям его метаболизма: транс-сульфурированию с участием цистатионин--синтазы и витамина В6 в качестве кофактора, а также реметилированию с участием ферментов метионин-синтазы и 5,10-метилентетрагидрофолат редуктазы в присутствии активных форм фолата и витамина В12 [193]. Механизм патологического влияния ГГц на сосудистый эндотелий до конца не ясен. Однако имеются данные о том, что повышенный уровень Гц в плазме крови ассоциирован с нарушением эндотелий-зависимой вазодилатации за счет снижения продукции NO, усиления оксидативного стресса и повреждения ДНК клеток [37; 180; 188]. К развитию ГГц может приводить снижение как активности ферментов, участвующих в метаболизме Гц, так и уровня их кофакторов (фолатов, витаминов В6 и В12) в плазме крови. Тяжелая ГГц ( 100 мкмоль/л), наблюдаемая, как правило, при дефиците цистатион--синтазы, встречается достаточно редко и сопровождается серьезными, зачастую не совместимыми с жизнью осложнениями. Легкое и умеренное повышение уровня Гц встречается значительно чаще и связано, преимущественно, с мутациями в гене метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR) либо с пищевым дефицитом фолатов, витаминов В6 и В12 [75]. Ген MTHFR расположен в локусе 1p36.3 и состоит из 11 экзонов. Известно несколько аллельных вариантов данного гена, ассоциированных с синтезом фермента со сниженной активностью. Наиболее значимым считается полиморфизм MTHFR (677С/Т), приводящий к замене аланина на валин в фолат-связывающем участке этого белка и образованию термолабильной формы фермента, обладающей сниженной каталитической активностью [37; 184]. Носительство аллеля MTHFR 677Т при определенных условиях может стать причиной развития ГГц и, соответственно, увеличения риска как венозного, так и артериального тромбоза, а также наиболее распространенных форм акушерской патологии – синдрома потери плода, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, эклампсии, гестоза, дефектов нервной трубки плода [10; 16; 28; 85; 153].
Дисбаланс оксидантной и антиоксидантной систем приводит к развитию оксидативного стресса (рисунок 1), который характеризуется избыточным накоплением в тканях свободных радикалов – веществ, молекулы которых имеют на своих орбитах свободные электроны и обладают, за счет этого, выраженными окислительными свойствами. Подписи: О2- - супероксид-анион; ОН- - гидрокси-анион; H2O2 – перекись водорода; GSH – глутатион; GSSG – глутатион дисульфид. Рисунок 1 – Механизм образования и утилизации активных форм кислорода (Wakamatsu T.H., 2008 в модификации). К числу свободно-радикальных молекул относятся активные формы кислорода (супероксид-анион, гидрокси-анион, оксид азота (NO-), перекись водорода, пероксинитрит, гипохлорная кислота), а также окисленные липопротеиды низкой плотности [11]. Следует отметить, что продукция какой-либо одной свободно-радикальной молекулы может вызывать образование нескольких других. В условиях нормальной жизнедеятельности организма некоторые свободные радикалы выполняют регуляторные функции и имеют определенное адаптационно-компенсаторное значение.
Однако их избыточная продукция преодолевает защитные механизмы антиоксидантной системы и становится сильным патогенным фактором, подвергая окислению и нарушая функции таких биологических макромолекул, как ДНК, белки, липиды. При этом наблюдаются существенные изменения функции эндотелия сосудов: торможение эндотелий-зависимой вазодилатации; увеличение синтеза адгезивных молекул и факторов роста; усиление агрегации тромбоцитов и тромбообразования; повышение активности апоптоза [5]. Кроме того, происходит усиление пролиферации гладкомышечных клеток, приводящее к гипертрофии и ремоделированию стенки сосудов, утолщению их медиального слоя, нарушению состава межклеточного матрикса и структуры сосудистой стенки в целом. Увеличение массы гладких мышц сосудов способствует усилению их сокращения и сужению просвета в ответ на различные стимулы [11].
Дисбаланс оксидантной и антиоксидантной систем
Помимо активных форм кислорода, к числу свободных радикалов относят продукты перекисного окисления липидов, в частности, окисленные формы липопротеидов низкой плотности (ЛПНП). Они оказывают ряд характерных воздействий на структуру и функции сосудов [11] (рисунок 2). Различные формы дислипидемии являются признанным фактором риска атеросклероза и артериального тромбоза. В то же время, результаты исследований последних лет, в частности, данные о положительном влиянии статинов на снижение частоты возникновения тромботических осложнений в венозном русле [20; 78; 146; 153] могут свидетельствовать о вовлечении нарушений липидного обмена и в патогенез ВТ. Повышение содержания ЛПНП в плазме крови наблюдается, главным образом, при нарушении их захвата клетками печени и тканей в результате неэффективной работы соответствующих рецепторов. Взаимодействие ЛПНП с рецепторами происходит посредством белков-лигандов (апопротеинов – Аро) [73; 84].
Основным лигандом для рецепторов ЛПНП и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) является апопротеин Е (АроЕ) [73]. Известно три изоформы АроЕ, отличающихся комбинацией аминокислот в 112 и 158 позициях молекулы белка и имеющих разную степень сродства к указанным рецепторам [63; 82; 106]. Эти изоформы кодируются различными аллелями гена ApoE (2, 3 и 4), расположенного в локусе 19q13.2 (рисунок 3).
Подписи: аллельным вариантам 2, 3 и 4 гена АроЕ соответствуют три изоформы аполипопротеина Е, которые отличаются друг от друга наличием в положениях 112 и 158 молекулы белка аминокислотных остатков цистеина (Cys) или аргинина (Arg). Рисунок 3 – Изоформы Apo Е, соответствующие полиморфизму “ 2/ 3/ 4”. (С. И. Капустин, 2007)
Наименьшим сродством к рецептору обладает лиганд АроЕ, соответствующий аллелю 2 (АроЕ 2), а наибольшим – вариант АроЕ 4, что приводит в последнем случае к ускоренному захвату ЛПНП и ЛПОНП клетками печени и, по механизму обратной связи, к усилению их эндогенного синтеза [63; 82]. Кроме того, липопротеиды, несущие на своей поверхности лиганды ApoE 4, в большей степени подвержены перекисному окислению [103]. По данным большинства авторов, наличие в генотипе аллеля ApoE 4 ассоциировано с повышенным риском атеросклероза, ишемического инсульта, острого инфаркта миокарда [62], болезни Альцгеймера [124]. Однако в последние годы стали появляться работы, указывающие на возможную роль полиморфизма гена ApoE в патогенезе ВТ [8; 104].
Другим немаловажным фактором, способствующим формированию оксидативного стресса, является снижение активности параоксоназы – фермента, участвующего в метаболизме окисленных форм липидов. Параоксоназа синтезируется в печени, а после появления в кровеносном русле связывается с липопротеидами высокой плотности и способствует выполнению их функций. Протективная роль параоксоназы заключается также в ее участии в метаболизме гомоцистеин-тиолактона – метаболита Гц, оказывающего токсическое воздействие на клетки эндотелия. В результате ряда исследований было показано, что уровень активности этого фермента может отличаться у разных индивидуумов в десятки раз [110; 181]. Значительная часть этих различий обусловлена полиморфизмом гена параоксоназы (PON1), расположенного в локусе 7q21.22 и содержащего 9 экзонов. В настоящее время описано более 160 различных аллельных изоформ гена PON1, связанных, в основном, с наличием однонуклеотидных замен в его кодирующей либо промоторной области [52]. Некоторые из них представляют особый интерес, поскольку приводят к снижению концентрации и/или активности фермента. Наиболее изученными, с клинической точки зрения, вариантами параоксоназы являются Gln192Arg и Leu55Met, а также полиморфизм 107Т/С в регуляторной области гена.
Изоформа PON1, содержащая Arg192, обладает значительно более низкой каталитической активностью по отношению к ЛПНП, чем Gln192 [52; 122]. Хотя данные о клинической значимости полиморфизма Gln192Arg противоречивы, многие авторы указывают на возможную роль варианта 192Arg в патогенезе атеросклероза, ишемической болезни сердца, ишемического инсульта, сосудистых осложнений при сахарном диабете [46; 181; 186]. Кроме того, в одном из недавних популяционных исследований было показано, что изоформа 192Arg может являться фактором риска рецидивирующего течения ВТ [198]. Полиморфизм PON1 (Leu55Met) ассоциирован с концентрацией параоксоназы в плазме крови. У носителей варианта Met55 наблюдаются более низкие уровни фермента, чем у гомозигот по аллелю, кодирующему Leu в позиции 55 гена PON1 [110]. Причина указанного явления точно не установлена, однако предполагают, что оно может быть связано со стабильностью связи параоксоназы с липопротеидами высокой плотности. Клиническая значимость полиморфизма Leu55Met обсуждается и в настоящее время до конца не установлена [186]. Наиболее значимой вариацией в промоторной области гена PON1 считается замена Т107С. У гомозиготных носителей аллеля PON1 107С уровень параоксоназы в плазме крови почти в 2 раза выше, чем у лиц с генотипом 107(Т/Т) PON1 [52]. Ассоциация между носительством аллеля PON1 107Т и повышенным риском сердечно-сосудистой патологии была показана в отдельных работах, хотя недавно проведенный мета-анализ этого не подтвердил [186].
Регуляция тонуса сосудов осуществляется благодаря продукции эндотелием целого ряда биологически активных веществ. Одним из основных вазодилатирующих веществ, вырабатываемых эндотелием сосудистой стенки, является оксид азота. Помимо вазодилатирующего, он оказывает противовоспалительный, антиагрегантный и антиоксидантный эффект, уменьшает проницаемость сосудистой стенки [138]. Снижение выработки NO также оказывает влияние на способность эритроцитов к деформации и, тем самым, приводит к повышению вязкости крови [123]. Оксид азота синтезируется в процессе конверсии L-аргинина в L-цитруллин под действием NO-синтазы (NOS). Известно несколько изоформ NOS, имеющих сходную структуру, – две конститутивные (эндотелиальная – eNOS и нейрональная – nNOS), и одна индуцибельная (iNOS) [44]. Важную роль в функционировании NOS играют кофакторы – флавинадениндинуклеотид, флавинаденинмононуклеотид, гем, тетрагидробиоптерин и комплекс кальций/кальмодулин [2]. Основной формой NO-синтазы в нормальной сосудистой стенке является eNOS. Экспрессия и активность eNOS зависит от целого ряда различных факторов, в том числе, генетических (аллельный полиморфизм гена eNOS). Ген eNOS локализован на 7 хромосоме (7q35-36) и состоит из 26 экзонов (рисунок 4). Известно несколько аллельных вариантов данного гена, ассоциированных со снижением уровня или/и активности кодируемого фермента. Наиболее изучены однонуклеотидные замены Т786С в промоторной области гена eNOS и G894T в 7 экзоне, а также полиморфизм числа тандемных повторов из 27 п.н. в 4 экзоне (4a/4b). Замена Т786С приводит к снижению транскрипции гена eNOS и, следовательно, к уменьшению продукции NO-синтазы эндотелиальными клетками.
У носителей аллеля eNOS 786С повышен риск спонтанного спазма коронарных артерий, атеросклероза, нарушения вегетативной регуляции при наличии сердечной недостаточности. Миссенс-мутация G894T в 7 экзоне гена eNOS, приводящая к замене Glu289Asp, чаще обнаруживается при артериальной гипертензии [136], ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда [58], преэклампсии [196]. Интересно, что в китайской популяции данный полиморфизм ассоциирован также и с ВТ [112]. Наличие в 4-ом интроне гена eNOS четырех вместо пяти тандемных повторов, состоящих из 27 п.н., приводит к образованию так называемых «коротких аллелей». Взаимосвязь этого полиморфизма с сердечно-сосудистыми заболеваниями до конца не определена, но имеются сведения о том, что у носителей «коротких аллелей» уровень NO в плазме крови ниже, чем у гомозигот по «длинным аллелям» [184; 189]. К числу важнейших вазоконстрикторов, продуцируемых эндотелием, относится ангиотензин II – ключевой эффекторный пептид РАС. Синтез АТ II происходит из белка-предшественника, циркулирующего в кровеносном русле, ангиотензиногена, под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). Передача сигнала в клетку от АТ II осуществляется благодаря его взаимодействию с соответствующими рецепторами (AGТR), экспрессия которых наблюдается в различных органах (почки, легкие, печень, головной мозг и пр.) и тканях [57]. На поверхности эндотелиальных клеток представлены рецепторы АТ II 1-го типа – AGTR1. При дисфункции эндотелия АТ II приобретает качества организатора и ключевого фактора, объединяющего агрессивные компоненты организма. Помимо прямого вазоконстрикторного эффекта, АТ II оказывает и опосредованное влияние на сосудистую стенку: он является сильным антагонистом NO и уменьшает его содержание в плазме крови. Ангиотензин II блокирует синтез и выделение NO эндотелием, увеличивая повреждение последнего. При этом образуется дефицит L-аргинина – субстрата для синтеза NO, нарушаются сигнальная передача и ферментативная активность соответствующих синтаз. Увеличение содержания окислительных радикалов приводит к повышению активности НАДН и НАДФ – зависимой оксидазы, что переводит NO в оксидантную форму – пероксинитрит. Уменьшение количества NO под действием ангиотензина II происходит и по другому пути: AT II разрушает брадикинин – мощный стимулятор синтеза и защиты NO. В дальнейшем запускается целый каскад реакций, ведущих к усилению окисления липидов, образованию свободно-радикальных молекул, усилению оксидативного стресса и еще большему повреждению эндотелия [9].
Поддержание баланса процессов вазоконстрикции и вазодилатации во многом зависит от генетического фактора – аллельного полиморфизма генов компонентов РАС. Ген АСЕ, кодирующий АПФ, локализован на 17 хромосоме (17q23.3) и состоит из 26 экзонов [96]. Аллельный диморфизм “Ins/Del” гена АСЕ характеризуется наличием (Ins – “инсерция”) либо отсутствием (Del – “делеция”) участка 16-го интрона, состоящего из 287 пар нуклеотидов. “Делеционный” вариант ассоциирован с усиленной экспрессией гена и, соответственно, повышенной концентрацией АПФ в плазме крови. Считается, что данный полиморфизм гена АСЕ в наибольшей степени объясняет вариабельность значений уровня циркулирующего АПФ у здоровых индивидуумов [40; 72]. Ген рецептора АТ II 1-го типа – AGTR1, локализован на 3-ей (3q22) хромосоме, состоит из 5 экзонов. Известно порядка 50 различных аллельных вариантов гена AGTR1, из которых наиболее изученным является структурный полиморфизм А1166С [30]. Он связан с формированием рецепторов, обладающих повышенным сродством к АТ II, что приводит к усилению вазоконстрикторного действия главного эффектора РАС на сосудистую стенку [42]. Литературные данные о клинической значимости полиморфизма 1166А/С гена AGTR1 противоречивы. В отдельных исследованиях показано, что носительство аллеля AGTR1 1166С обуславливает повышенный риск артериальной гипертензии в европейской [36; 187] и китайской популяциях [102], но не имеет существенного значения у японцев [140]. В то же время, мета-анализ влияния указанного полиморфизма на риск развития ишемической болезни сердца, выполненный M.Xu et al, выявил слабую ассоциативную связь [195].
Анализ ген-генных взаимодействий” в группе больных с венозным тромбозом
С целью поиска генотипических сочетаний, ассоциированных с риском развития ВТ, был выполнен анализ “ген-генных взаимодействий” в общей группе больных. В ходе этого анализа проводилось изучение ассоциативных связей между аллельными вариантами различных генов и выявление неслучайных генотипических сочетаний, ЧВ которых в исследуемой группе имеют отклонения от произведения ЧВ входящих в их состав аллельных вариантов. C помощью компьютерной программы для анализа генетических данных “GenePop” в исследуемой группе были выявлены пары изученных генов с максимально значимым (p 0,2) коэффициентом неравновесного сцепления определенных аллельных вариантов. Затем, для каждой пары генов, с помощью точного критерия Фишера, были определены сочетания генотипов, для которых уровень статистической значимости ассоциативной связи между входящими в их состав генетическими вариантами соответствовал р 0,05. При отсутствии в составе “межгенной комбинации” генетического варианта с “основным эффектом”, ЧВ которого в исследуемой группе пациентов имела статистически значимое отклонение от таковой в контроле, для оценки роли этого сочетания в развитии ВТ было использовано сравнение его ЧВ у больных и в КГ.
Как видно из приведенной таблицы, значимых различий в ЧВ генотипических комбинаций между группой больных с ВТ и КГ выявлено не было, что может быть связано с наличием в общей популяции аналогичных ассоциативных связей. Для оценки возможного влияния аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на риск развития ВТ у лиц с классическими формами наследственной тромбофилии – мутациями в генах факторов II и V, обладающих “основным эффектом” в отношении риска развития заболевания, в исследуемой группе пациентов был проведен анализ распределения генотипов изученных генов в зависимости от наличия либо отсутствия указанных маркеров НТ. Результаты анализа представлены в таблице 6.
В обследованной группе пациентов с ВТ частота носительства классических детерминант НТ, мутаций G1691A в гене фактора V (FV G1691A Leiden) и G20210A в гене протромбина (FII G20210A), составила 19,3% и 9,7%, соответственно. У 4 (1,4%) больных Лейденская мутация была выявлена в гомозиготной форме, в 4 (1,9%) случаях обнаруживалось одновременное гетерозиготное носительство указанных генетических вариантов. Из данных, приведенных в таблице 6, видно, что для пациентов с ВТ и классическими маркерами НТ была характерна повышенная частота носительства аллеля АроЕ 2 и генотипа 2/3 АроЕ по сравнению с группой больных с “нормальными” генотипами FV и FII. Статистически значимыми эти различия оказались для больных с мутацией G20210A в гене протромбина (20,0% против 6,9%, OR=3,3; 95%CI: 1,4–8,2; p=0,01 и 40,0% против 11,9%, OR=4,9; 95%CI: 1,8–13,9; p 0,01 соответственно).
Кроме того, в группе пациентов с мутацией в гене фактора II наблюдалось снижение ЧВ аллеля АроЕ 4 по сравнению с носителями Лейденской мутации (2,5% против 8,8%, OR=0,3; 95%CI: 0,03–2,3; p=0,3) и больными без указанных детерминант наследственной тромбофилии (2,5% против 10,3%, OR=0,2; 95%CI: 0,03–1,7; p=0,2), однако выявленные различия не были статистически значимыми.
Как показали результаты проведенного анализа, для больных с ВТ, являющихся носителями мутации в гене фактора V, было характерно почти 2-кратное увеличение ЧВ гомозигот по аллелю eNOS –786С по сравнению с больными, имеющими мутацию G20210A в гене протромбина (27,5% против 15,0%, OR=2,1; 95%CI: 0,5–8,8; p=0,3), и лицами без обозначенных генетических маркеров НТ (27,5% против 14,6%, OR=0,2; 95%CI: 1,0–5,1; p=0,06). При этом, носители генотипа –786(T/С) eNOS встречались среди обладателей FV Leiden почти в 2 раза реже, чем у больных без генетических маркеров НТ (25,0% против 45,7% соответственно, OR=0,4; 95%CI: 1,2–0,9; p=0,02). На значимость эффекта полиморфизма гена eNOS на риск возникновения ВТ в молодом возрасте у носителей Лейденской мутации может также указывать отклонение распределения генотипов eNOS в этой группе от канонического распределения Харди-Вайнберга (р=0,002).
Кроме того, у пациентов с классическими маркерами НТ был обнаружен необычный характер распределения генотипов некоторых генов компонентов РАС, в частности, AGT и ACE, по сравнению с группой больных, имеющих “нормальные” генотипы FII и FV. Как у пациентов с вариантом FV Leiden (15,0% против 26,5% в группе сравнения, OR=0,6; 95%CI: 0,2–1,3; p=0,1), так и у лиц с мутацией G20210A в гене протромбина (15,0% против 26,5%, OR=0,5; 95%CI: 0,1–1,8; p=0,4) наблюдалось снижение ЧВ генотипа 704(C/C) AGT, ассоциированного с повышенной продукцией ангиотензиногена. В группе больных с ВТ была выявлена положительная ассоциативная связь между наличием мутации FII G20210A и генотипом Ins/Ins гена АСЕ (OR=8,4; 95%CI: 1,1–65,5; р=0,02). Среди больных с ВТ, являющихся носителями мутации в гене протромбина, было отмечено существенное преобладание лиц с аллелем АСЕ Ins (90,0%) и гомозигот по этому аллелю (55,0%) по сравнению с больными, не имеющими генетических детерминант наследственной тромбофилии (OR=2,4; 95%CI: 1,2–5,0; p=0,02 и OR=3,0; 95%CI: 1,2–7,9; p=0,02, соответственно). В то же время, ЧВ гомозигот по «делеционному» аллелю гена АСЕ, характеризующихся повышенным уровнем продукции АПФ, в группе пациентов с вариантом FII G20210A была существенно ниже (10,0% против 23,8% в группе FII(-)/FV(-), OR=0,4; 95%CI: 0,1–1,6; p=0,3). Анализ распределения аллелей и генотипов EPCR показал почти 2-кратное снижение ЧВ аллеля EPCR 6936G и гетерозигот по этому аллелю в группе пациентов с вариантом FV Leiden по сравнению с носителями мутации G20210A в гене протромбина (7,5% против 15,0%, OR=0,5; 95%CI: 0,1–1,5; p=0,2 и 15,0% против 30,0%, OR=0,4; 95%CI: 0,1–1,5; p=0,2, соответственно) и лицами с “нормальными” генотипами факторов II и V (7,5% против 14,9%, OR=0,5; 95%CI: 0,2–1,1; p=0,1 и 15,0% против 27,2%, OR=0,5; 95%CI: 0,2–1,2; p=0,1 соответственно). Интересно также отметить, что в группе пациентов, не имеющих классических генетических детерминант наследственной тромбофилии, доля лиц, являющихся носителями аллеля EPCR 6936G (28,5% против 18,7%; OR=1,4; 95%CI: 0,8–2,4; p=0,3) и гетерозигот по этому аллелю (27,2% против 18,0%; OR=1,7; 95%CI: 1,0–2,9; p=0,07) была значительно выше, чем в КГ.
Распределение аллелей и генотипов изучаемых генов у пациентов с рецидивирующим течением венозного тромбоза
В исследуемой группе больных с ВТ рецидивирующий характер течения заболевания наблюдался у 58 (28,0%) человек. Для установления возможных ассоциативных связей между полиморфизмом изученных генов и наличием повторных эпизодов ВТ в анамнезе был проведен сравнительный анализ распределения аллельных вариантов и генотипов рассматриваемых генов у пациентов с рецидивирующим течением венозного тромбоза и в группе больных с единственным тромботическим эпизодом в анамнезе. Как видно из данных, приведенных в таблице 8, у пациентов с рецидивирующим течением ВТ было выявлено статистически значимое снижение доли носителей АСЕ Del аллеля и гомозигот по этому аллелю (OR=0,5; 95%CI: 0,4–0,8; р 0,01 и OR=0,4; 95%CI: 0,2–0,9; р=0,03, соответственно). Число обладателей генотипа Ins/Ins АСЕ в этой группе, наоборот, было значительно выше, чем у больных без рецидива заболевания (41,4% против 26,2%; OR=2,0; 95%CI: 1,1–3,8; р=0,04). Кроме того, у больных с рецидивирующим течением ВТ наблюдалась тенденция к снижению числа носителей “редкого” аллеля другого компонента РАС – AGTR1 (19,8% против 25,2% у больных без рецидива ВТ, OR=0,7; 95%CI: 0,4–1,2; р=0,3).
Из приведенной таблицы также видно, что ЧВ генотипа –31(С/С) IL-1 в подгруппе пациентов с рецидивирующим течением ВT была почти в 3 раза выше, чем у лиц с единственным тромботическим эпизодом в анамнезе (15,5% против 5,4%, OR=3,2; 95%CI: 1,2–8,9; p= 0,02). Помимо этого в обследуемой группе наблюдалась тенденция к увеличению числа носителей “редких” аллелей генов АроЕ и ТМ по сравнению с группой больных, перенесших единственный эпизод ВТ в анамнезе, однако эти различия не были статистически значимыми (OR=1,4; 95%CI: 0,7–2,8; р=0,4 и OR=1,4; 95%CI: 0,8–2,4; р=0,2, соответственно).
Как видно из данной таблицы, в группе пациентов с развившейся ПТБ было выявлено увеличение доли лиц с генотипом 704(T/C) AGT и, напротив, снижение ЧВ гомозиготных носителей аллеля AGT 704C по сравнению с больными без клинических проявлений ПТБ (OR=2,4; 95%CI: 1,1–4,9; p= 0,03 и OR=0,5; 95%CI: 0,2–1,2; p=0,1, соответственно).
Помимо этого, у больных с ПТБ наблюдалось статистически значимое снижение ЧВ аллеля АСЕ Del (37,5% против 51,4% у больных без ПТБ, OR=0,7; 95%CI: 0,3–0,9; p=0,03), а также 3-х кратное снижение доли лиц с генотипом Del/Del ACE по сравнению с пациентами, у которых объективное обследование не выявило признаков ПТБ (10,0% против 30,0% соответственно, OR=0,3; 95%CI: 0,1–0,8; p=0,01). Кроме того, была выявлена тенденция к увеличению ЧВ “мутантного” аллеля гена eNOS и генотипа –786(T/С) eNOS, однако выявленные различия были статистически не значимы (43,7% против 35,0%, OR=1,4; 95%CI: 0,9–2,4; p=0,2 и 52,5% против 37,8%, OR=1,8; 95%CI: 0,9–3,7; p=0,1, соответственно). Анализ распределения ЧВ генотипов генов, участвующих в регуляции липидного обмена выявил некоторое увеличение ЧВ редкого аллеля гена PON1 у больных с развившейся ПТБ по сравнению с лицами, не имевшими данного осложнения в анамнезе (31,2% против 23,1%; OR=1,6; 95%CI: 0,8–3,2; p=0,2). Кроме того, носители генотипа 192(Arg/Arg) PON1 встречались в группе пациентов с ПТБ в 2 раза чаще, чем у больных с не осложненным течением ТГВНК (10,0% против 4,9% соответственно, OR=2,2; 95%CI: 0,6–7,8; p= 0,3). Присутствие в генотипе варианта 3/4 гена АроЕ было более характерно для лиц с ПТБ, хотя различия и не достигали пределов статистической значимости (OR=1,5; 95%CI: 0,6–3,8; p=0,3). В то же время, в этой группе не было выявлено ни одного гомозиготного носителя аллеля АроЕ 4.
Распределения ЧВ генотипов генов цитокинов не имело существенных отличий между подгруппами. Хотя в группе пациентов с ПТБ и было выявлено некоторое увеличение доли лиц с генотипом 308(G/A) TNF- по сравнению с больными без указанного осложнения (OR=1,6; 95%CI: 0,7–3,5; p=0,3). Кроме того, в группе пациентов с развившейся ПТБ несколько чаще встречались гетерозиготы по гену ТМ (37,5% против 28,7%; OR=1,5; 95%CI: 0,7–3,1; p=0,3).
Таким образом, наиболее значимые различия между изучаемыми подгруппами больных наблюдались в распределении ЧВ вариантов генов, участвующих в регуляции тонуса сосудов, что позволяет предположить их значимую роль в развитии ПТБ у пациентов, перенесших эпизод(ы) ТГВНК.
Для оценки функционального состояния эндотелия в группе больных с ВТ и у лиц КГ был выполнен анализ ряда лабораторных показателей, которые могут либо сами являться маркерами ЭД (растворимая форма тромбомодулина – sTM, антиген фактора Виллебранда – Ag vWF), либо оказывать повреждающее воздействие на сосудистую стенку (гомоцистеин – Гц, холестерин – Хс, малоновый диальдегид – МДА, ангиотензин II – АT II) и характеризовать ее выраженность. Средний уровень sTM в плазме крови в группе пациентов с ВТ и у здоровых лиц составил 8,57±1,20 нг/мл и 9,12±0,55 нг/мл (р=0,6) соответственно. У больных мужского пола средний уровень sTM был несколько выше, чем у женщин (9,30±1,97 нг/мл против 8,20±1,26 нг/мл), однако выявленные различия не были статистически значимыми (р=0,6). В КГ наблюдалась обратная ситуация – содержание растворимой формы ТМ в плазме крови было выше у женщин, чем у мужчин (10,00±1,37 нг/мл против 8,20±0,35 нг/мл, р=0,3). Значения sTM более 14,88 нг/мл (90% процентиль) расценивались как гипертромбомодулинемия, ЧВ которой в контрольной группе составила 9,8%. В группе больных с ВТ повышенные уровни sTM регистрировались несколько чаще, в 11,8% случаев.
Средний уровень Гц в плазме крови пациентов с ВТ составил 10,71±1,1 мкмоль/л. Анализ распределения уровней Гц в исследуемой группе (рисунок 15) выявил наличие ГГц (Гц 13,5 мкмоль/л) у 10 человек (37,0%), что подтверждает ее значимую роль в качестве фактора риска развития ВТ. Показатели Гц в этой группе колебались в пределах от 13,8 до 24,1 мкмоль/л, средний уровень составил 16,7±1,0 мкмоль/л.
Гиперхолестеринемия (Хс 5,2 ммоль/л) наблюдалась более, чем у половины (55,6%) больных с ВТ. Средний уровень холестерина в этой группе составил 6,40±0,21 ммоль/л. Гистограммы, представленные на рисунках 16-18, отражают распределение уровней различных показателей липидного обмена в группе больных с ВТ.
Выявленные нарушения липидного обмена были обусловлены, главным образом, повышенным содержанием липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови, средний уровень которых был равен 3,84±0,25 ммоль/л. Доля лиц с уровнем ЛПНП выше референтного значения 3,0 ммоль/л в обследуемой группе составила 65,4%.
Средняя концентрация триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови у больных с ВТ определялась на уровне 1,53±0,2 ммоль/л. Гипертриглицеридемия (ТГ 2,16 ммоль/л) была выявлена у 5 (18,5%) пациентов. Выявленные особенности липидного профиля у пациентов с ВТ подтверждают значимость патофизиологической роли нарушений липидного обмена в развитии венозного тромбоза.
Cредний уровень МДА – вторичного продукта перекисного окисления липидов, являющегося одним из показателей оксидативного стресса, составил в группе больных с ВТ 12,22±0,46 мкмоль/л (рисунок 19). При этом, у 12 пациентов (44,4%) содержание МДА было выше верхнего предела референтных значений для здоровой популяции (11,9 мкмоль/л), что свидетельствует о важной роли оксидативного стресса в патогенезе ЭД у значительной части больных с ВТ.
Интересно, что в группе пациентов с ВТ отмечалось снижение уровня АТ II по сравнению с КГ, хотя выявленное различие и не было статистически значимым (0,17±0,03 нг/мл против 0,27±0,04 нг/мл, р=0,07). Таким образом, вопреки ранее высказанному предположению о том, что данный показатель может отражать степень выраженности ЭД, полученные результаты не позволяют сделать такой вывод.
