Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Материал, методология и методика исследования 22
2.1. Иммунологическая реактивность человека 22
2.2. Краткая характеристика используемых в работе признаков, характеризующих состояние иммунной системы 23
2.3. Материал и методика исследования 39
2.4. Статистическая обработка данных 45
Глава 3. Внутрисистемные корреляционные взаимосвязи иммунологических параметров у практически здоровых жителей севера 47
Глава 4. Корреляционные взаимосвязи иммунных параметров при некоторых иммунных дисбалансах 81
Заключение 96
Выводы по
Практические рекомендации 112
Список литературы 113
- Иммунологическая реактивность человека
- Краткая характеристика используемых в работе признаков, характеризующих состояние иммунной системы
- Материал и методика исследования
- Корреляционные взаимосвязи иммунных параметров при некоторых иммунных дисбалансах
Введение к работе
Актуальность исследования. С появлением новых и совершенствованием известных иммунологическим методов исследования значительно расширяются возможности углубленного и всестороннего изучения различных факторов и параметров механизмов иммунной защиты. Но для выявления сущности функционирования иммунной системы изучение того или иного её элемента, пусть даже самого ультрасовременного и тонкого, недостаточно [39, 90, 130]. Каждый компонент иммунной системы функционирует в совокупности с другими, количественная характеристика параметра иногда значит очень мало и не отражает истинного положения. Какова эта взаимосвязь иммунных параметров, чем она обусловлена, при каких обстоятельствах она появляется, когда и почему исчезает? Многие из ответов на эти вопросы, в какой-то мере, могли бы дать новые сведения о значимости развития отдельных компонентов иммунной реакции.
Указанный подход к изучению иммунной системы имеет некие преимущества перед способами исследования среднестатистических значений и отклонений изучаемых параметров от нормативных уровней. Это объясняется, прежде всего, тем, что при среднестатистическом сравнении исключается влияние биологических ритмов, воздействия на иммунитет состояния других систем организма, действия постоянно меняющегося уровня антигенной нагрузки.
Корреляционные взаимодействия и их коэффициенты лежат в основе многочисленных уравнений для определения ряда иммунологических параметров, концентраций иммунокомпетентных клеток, индифферентных или чувствительных к различным испытуемым иммуномодуляторам, а также для определения активности экспрессии тех или иных рецепторов [2, 135].
Взаимосвязи иммунологических параметров положены в основу способов параметрической количественной оценки функционального состояния организма, что позволяет выявить и оценить количественно тенденции в изменении функционального состояния, прогнозировать как дальнейшее течение заболевания, так и возможные отклонения, осложнения, отслеживать влияние лечебных, физиологических, экологических воздействий на организм с учетом состояния различных органов и систем [71,93].
Анализ характера взаимосвязей используется для изучения эффекта биологической обратной связи. В качестве параметров для произвольной характеристики используются различные интегральные показатели [119].
Изучение взаимосвязей, возможно, поможет объяснить ситуации иммунного баланса при наличии количественного дефицита тех или иных показателей, а также явные дефекты иммунной защиты при физиологическом соответствии уровней содержания иммунокомпетентных клеток, иммуноглобулинов и цитокинов.
Цель и задачи исследования. Цель работы - выявить особенности взаимодействия некоторых компонентов иммунной реакции.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Установить взаимосвязи между параметрами, характеризующими состояние иммунной системы, и оценить наиболее сильные из них.
Выявить корреляционные зависимости, отражающие лимфопролифера-тивные процессы иммунной реакции.
Оценить различия корреляционных взаимосвязей в зависимости от возраста и пола.
Определить особенности корреляционных взаимосвязей при дисбалансах регуляции иммунной системы.
Положения, выносимые на защиту.
1. Взаимосвязи, отражающие дифференцировку иммунокомпетентных клеток, являются наиболее сильными. Инициация дифференцировки иммуноцитов наиболее тесно взаимосвязана с содержанием Т-клеток с рецептором к трансферину.
Клеточный состав периферической крови отражает активность иммунных процессов пролиферации; наиболее постоянными корреляционными взаимосвязями являются корреляции между общим содержанием лимфоцитов и количеством активированных Т-лимфоцитов.
Смена знака корреляционной взаимосвязи отражает процесс саморегуляции на уровне изменения рецепторнои чувствительности клеток. Изменение рецепторнои активности иммунокомпетентных клеток и связанная с этим чувствительность их к цитокинам, иммуноглобулинам и метаболитам проявляется сменой знака коррелятивных взаимосвязей. При повышении концентраций ИЛ-2, трансферина, IgE, возникают отрицательные корреляции с содержанием соответствующих клеток (CD25, CD71, CD23): низкие их уровни ассоциируются с положительными взаимосвязями.
4. При формировании иммунных дисбалансов регистрируется увеличение силы корреляционных взаимосвязей с увеличением их количества и усложнением структуры: формирование иммунного дисбаланса в целях компенсации дефекта иммунной защиты обусловливает активизацию ряда механизмов иммунных систем с увеличением силы, количества и усложнением структуры корреляционных взаимосвязей.
Научная новизна исследования. Впервые проведено исследование внутрисистемных взаимосвязей в регуляции иммунных реакций у лиц, проживающих на Севере, и получены новые данные, свидетельствующие о последовательности развития иммунных реакций, о значимости уровня выраженности некоторых звеньев процесса на конечный результат иммунного ответа, а также закономерности, свидетельствующие о механизмах саморегуляции иммунной реакции.
Впервые установлены корреляционные взаимосвязи между содержанием активированных Т-клеток (CD25, CD71, HLA DR) и концентрацией ИЛ2. Выявлена взаимосвязь (сопряженность) активизации клеток с рецептором к трансферину и Т-хелперов.
Установлено, что дисбаланс в системе иммунитета проявляется увеличением числа и спектра корреляционных взаимосвязей иммунологических параметров. Впервые доказано, что в обратные взаимосвязи рецептор -эффектор (на примерах CD25h ИЛ2, CD71 и трансферті, CD23 и IgE) лежат в основе процесса саморегуляции баланса в системе иммунитета.
Практическая значимость работы. Коэффициенты корреляции могут быть использованы для определения количества различных фенотипов лимфоцитов по имеющимся данным содержания общего числа лимфоцитов и одного из определяемых фенотипов.
Предложен способ выявления дефицита цитотоксических лимфоцитов CD8+ по общему содержанию лимфоцитов в периферической крови (удостоверение на рационализаторское предложение № 6/04 от 12 апреля 2004г.)
Появление корреляционных взаимосвязей с содержанием иммуноглобулинов свидетельствует об активности антителообразования иммунной реакции, связанной с воспалительным или аллергическим процессом.
Появление отрицательных взаимосвязей между содержанием биологически активного вещества (ИЛ-1, трансфернії, IgE) и количеством клеток с рецептором к нему указывает на превышение физиологических границ в содержании данного вещества.
Выявленные закономерности могут быть использованы в практике путем сокращения объема исследований для оценки состояния иммунной защиты. Применение коэффициентов корреляции возможно для вычисления вероятных уровней интересующего параметра. Признак усложнения и расширения спектра корреляционных взаимосвязей может быть применен для оценки дисбаланса в системе иммунитета в эколого-иммунологических исследованиях и мониторинге. Результаты исследования используются при организации и проведении медико-биологического обеспечения мероприятий МК «Биокор» (акт внед-рения от 15 мая 2004г.).
Диссертационное исследование выполнено в соответствии с планом НИР в рамках темы научных исследований Института физиологии природных адаптации Уральского Отделения РАН «Физиологические границы функциональной активности систем организма человека на Севере» (№ Госрегистрации 01,2.00101811).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных семинарах Института физиологии природных адаптации УрО РАН (Архангельск, 2001-2005), заседаниях Ученого Совета ИФПА УрО РАН (Архангельск, 2001-2005), заседаниях Архангельского общества физиологов им. И.П. Павлова (Архангельск, 2003-2005), 1-ой конференции иммунологов (Екатеринбург, 2001), Пятом конгрессе иммунологов и аллергологов «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002).
По теме диссертации опубликовано 6 работ и сделано одно рационализаторское предложение (удостоверение на рационализаторское предложение № 6/04 от 12 апреля 2004г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит з введения, 4 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 24 рисунками. Список литературы включает 143 отечественных и 42 зарубежных источника.
Иммунологическая реактивность человека
Взаимосвязи в системе иммунитета определяются системой взаимодействия клеток, цитокинов, лиганд и рецепторов в иммунном ответе [17,24,32,39,45,46,62,90,91,93,99,102,129,130,136,173].
Лимфоциты, в особенности Т-клетки, рассматриваются как диффузная циркулирующая железа внутренней секреции, которая продуцирует пептиды с биологическими эффектами, сходными с эффектами гормонов, неиромедиаторов и вазомоторных пептидов. В центральном органе иммунной системы - тимусе - вырабатываются тимические гормоны, а также хемотоксические, ростовые и колониестимулирующие факторы для различных типов клеток и нейропептиды (нейрофизин, соматостатин, вазопрессин, окситоцин). В опытах клеточных культурах продемонстрированы тесные взаимосвязи тимических гормонов с гормонами гипофиза и гормонами щитовидной железы.
Экспрессированный на цитоплазматических мембранах сложный и динамичный рецепторний аппарат иммунокомпетентных клеток является основой для многочисленных внутри- и межклеточных взаимодействий [6,90,94,100,108,109,112,117].
Клетки эндометрия матки человека эксперессируют антигены HLA класса II; экспрессия их усиливается под влиянием ИФа. Эти клетки, а также клетки эндометрия базолатеральной субэпителиальной стромы, являются активными антигенпредставляющими клетками [183].
CD25 и CD4 играют очень важную роль в опосредованном через ИЛ-2 контроле CD8 Т-клеток с фенотипом клеток памяти [175].
Межсистемные отношения, динамика которых проявляется в изменчивости параметров активности того или иного процесса, является модифицируемой, изменяющейся от реализации к реализации.
Сделана попытка выявить новые возможности использования системного многофакторного анализа путем анализа интегральных показателей иммунологических параметров, определенных в зависимости от ведущего иммунологического критерия, выявленного методом распределения частот. Такой подход позволяет подтвердить значимость выбранного иммунологического критерия с прогностической и патогенетической точек зрения [19,88,117,118,131,132].
В приступном периоде при бронхиальной астме отмечается снижение содержания в крови Т- и В-лимфоцитов, сывороточных иммуноглобулинов А и гиперкоагуляции. Выявлена четкая взаимосвязь между степенью снижения содержания Т-лимфоцитов и гиперкоагуляции сыворотки крови [63]. Сегодня наблюдается явная неточность диагностики бронхиальной астмы и у детей, да и у взрослых. В большинстве так называемых атопических бронхиальных астм, в действительности скрываются типичные инфекционно-аллергические проявления. Наличие высокой степени коррелятивных взаимосвязей ОРЗ и приступов бронхиальной астмы подтверждают это мнение [28].
С помощью метода корреляционной зависимости установлено, что аутоиммунный процесс, как правило, не имеет специфического патогенетического агента и может быть спровоцирован многими микроорганизмами. Так, анкилозирующий спондилит сочетается с гиперреактивностью в отношении клебсиелл, стрептококков и дрожжеподобных грибов [110,162].
С помощью корреляций доказывается этиопатогенетическая роль иммунодефицита в развитии послеоперационных осложнений. Осложнения после кесарева сечения ассоциируются с дефицитом содержания Т-лимфоцитов, Т-хелперов в первые 2 дня после операции и, особенно, до операции [74].
С помощью метода корреляционных плеяд показано взаимодействие реакций неспецифической резистентности и воспалительного процесса. Установлено, что воспаление характеризуется возникновением взаимосвязей между клеточными реакциями в очаге воспаления и реакциями на уровне всего организма, в том числе изменения содержания кортизола [25].
Корреляционная статистика широко используется для обоснования факторов риска. Так, например, установлены факторы риска повышения РЭА (атипия клеток, инвазия, инфильтрация) и выявлено, что метастазирование не взаимосвязано с уровнем РЭА [157].
Используя коэффициенты корреляции иммунологических параметров с другими показателями гомеостаза, можно строить математические уравнения для определения уровня того или иного иммунологического параметра [96,22,126,139,141,142,143,167]. Корреляционные взаимодействия и их коэффициенты лежат в основе многочисленных уравнений для определения ряда иммунологических параметров, концентраций иммунокомпетентных клеток, индифферентных или чувствительных к различным испытуемым иммуномодуляторам, а также для определения активности экспрессии тех или иных рецепторов [2,135]. Изучены ассоциации изменения традиционных в медицине гемограмм для вычисления некоторых иммунологических критериев [18,23,48,52,64,65,67,73,103,104,105,111,113,114,128,138].
На основе изучения корреляционных взаимосвязей показано, что информативность уровней активности метаболических процессов (снижение активности оксидоредуктаз, определяющих интенсивность энергетических процессов, ингибирование рибозо-5-фосфат- и НАДФН- зависимых пластических процессов, снижение активности реакции восстановления глутатиона) лимфоцитов гораздо более значима, чем количественные изменения содержания иммунокомпетентных клеток [118].
Математические модели применяются в иммунологии с первых лет её существования. Американский журнал иммунологических методов (J.Immunol.Meth) с 1971 года регулярно публикует статьи по математическому моделированию в иммунологии. Количественная оценка взаимосвязей и их соотношения позволяют создавать все новые и новые статистические и компьютерные модели иммунологических методов, начиная с фиксации комплемента, реакций преципитации до современных методов иммунного анализа структуры белка, секвенирования генов и полимеразной цепной реакции [174].
На основе теории функциональных систем П.К. Анохина исследованы межсистемные мультипараметрические отношения показателей ряда ведущих функциональных систем гомеостатического уровня. Установлено, что под влиянием комплекса неблагоприятных для организма человека факторов (иономагнитные, радиационные, токсические, температурные) резко усиливаются и усложняются внутрисистемные и межсистемные взаимосвязи. Установлены указанные процессы относительно нейрогуморальной регуляции, поддержания гормонального гомеостаза, иммунных реакций, функционального состояния сердечно-сосудистой системы, системы кроветворения, системы органов дыхания, органов пищеварения [16,29,33,34,50,53,58,68,69,70,72,76,77,78,79,80,81,93,123].
Взаимосвязи положены в основу способов параметрической количественной оценки функционального состояния организма, что позволяет выявить и оценить количественно тенденции в изменении функционального состояния, прогнозировать как дальнейшее течение заболевания, так и возможные отклонения, осложнения, отслеживать влияние лечебных, физиологических, экологических воздействий на организм с учетом состояния различных органов и систем [10, 71, 92, 93,107].
Краткая характеристика используемых в работе признаков, характеризующих состояние иммунной системы
Среди значительного числа жизнеобеспечивающих систем у человека система иммунитета выполняет защитную роль. Уникальность иммунной системы обеспечена ее функциональным многообразием: многочисленностью механизмов защиты, факторов резистентности, многоликостью реакций. Некомпенсируемые изменения в системе -количественные, качественные, нарушения баланса и взаимодействия приводят к истощению резервных возможностей и развитию патологии. Болезней без каких-либо отклонений в иммунной системе не может быть.
Гематологические исследования включали определение общего содержания лейкоцитов в венозной крови и леикограмму для последующей оценки концентраций фенотипов лимфоцитов. Количество клеток гемограммы, моноцитограммы, лимфоцитограммы подсчитывали в мазках крови, окрашенных по методу Романовского-Гимза. Моноцитограмму определяли по методике О.Н. Григоровой (1958) [35], лимфоцитограмму учитывали по методу И.А. Кассирского, Г.А. Алексеева (1962) [66] и Н.А. Федорова (1976) [128]. Интерпретация велась с учетом рекомендаций Л.К. Добродеевой (1987). Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли с помощью тест-набора химической компании "Реакомплекс" (г. Чита). Среднее содержание сегментов ядра нейтрофилов (ССЯН) учитывалось на 100 клеток, среди которых подсчитывалось количество нейтрофилов с 1,2,3,4 и 5 сегментами и делилось на 100.
Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini C.V, et al., 1965) [170]. При данной методике использовались антисыворотки научно исследовательского института эпидемиологии и микробиологии, а также предприятия "Биомед" им. И.И. Мечникова (г. Новгород). Содержание IgE в сыворотке крови определял] cm иммуноферментным способом с диагностичскими наборами производства "Hoffmann-La Roch", Швейцария, реакция оценивалась с помощью фотометра "MULTISKAN MS" фирмы LABSYSTEMS (Финляндия). Антитела классов IgG к кардиолипину определялись твердофазным иммуноферментным методом с помощью набора ImmuLisa Anti-Cardiolipin Antibody (АСА). Антитела к двухспиральной ДНК определялись с помощью Bio-Rad Anti-ds DNA Test. Тест основан на твердофазном иммуносорбентном анализе, при котором аналит является показателем цветной реакции конъюгата фермента.
Цитокины определяли методом «конкурентного» иммуноферментного анализа с реактивами ВСМ Diagnostics и CytEHsa производства США и оценкой результатов на фотометре серии Мультискан производства Финляндии. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови проводилось с помощью тест-набора химической компании "Реакомплекс" (г. Чита). Выделение мононуклеаров из периферической крови производился по методу A. Boymn (1976) [149]. Для фенотипирования лимфоцитов использовалась непрямая иммуноперокси-дазная реакция с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли» (НПО "Диагно Тех", г. Новгород и Онкологический центр, г. Москва).
Иммунная система, как и любая иная система человека, состоит из центральных (тимус, красный костный мозг, бурсозависимый орган) и периферических (селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные образования) органов. Структурной единицей иммунной системы является лимфоцит; популяция лимфоцитов функционально неоднородна. В процессах созревания и дифференцировки лимфоцитов идет изменение рецепторного аппарата. Наличие на поверхности лимфоцита соответствующих молекул, дифференцирующих маркеров (Cluster Differentiation - CD), позволяет различать фенотипы лимфоцитов.
CD2 рецептор присутствует на поверхности всех циркулирующих Т-клеток, естественных киллерах (NK), является рецептором для связывания эритроцитов барана при Е-розеткообразовании. Принимает участие в альтернативной активизации Т-клеток путем адгезивных взаимодействий с комплементарным гликопротеином (CD58, LEA-3) на поверхности клетки-мишени. CD3 принимает участие в распознавании антигена, ассоциированного с детерминантами главного комплекса гистосовместимости класса 2 на антигенпредставляющих клетках, и способствует передаче сигнала активации в цитоплазму. Может быть использован для идентификации зрелых активированных Т-клеток. CD4 экспрессируют Т-клетки (хелперы / индукторы), составляющие 45% лимфоцитов периферической крови; в периферической крови до 5% клеток несут одновременно маркеры CD4 и CD8, слабая экспрессия молекулы CD4 наблюдается на клетках макрофагально - моноцитарного ряда. CD5 при альтернативной стимуляции клеток под действием адгезивных взаимодействий CD5 является лигандом CD72 - антигена В-лимфоцитов. CD5 выявляется на поверхности всех зрелых Т-клеток. CD7 самый ранний маркер Т-клеточной дифференцировки, экспрессируется pro-Т-клетками еще до миграции предшественников в тимус; CD7 является FC - рецептором для IgM.
Материал и методика исследования
Для изучения корреляционных взаимосвязей в системе иммунитета произведен анализ обследования 509 практически здоровых на момент исследования жителей взрослого и 244 человек детского населения Архангельска и Архангельской области. Все взрослые были практически здоровы и не имели хронической патологии на момент обследования. Среди обследованных взрослых в возрасте от 18 до 50 лет 282 женщины и 227 мужчин. Среди детей - 148 девочек и 96 мальчиков от 8 до 10 лет. Все дети на момент обследования были практически здоровы и не имели в анамнезе хронической патологии (1-2 группы здоровья).
Проведен сравнительный анализ частоты регистрации иммунных дисбалансов у 1000 взрослых людей работоспособного возраста при различной хронической патологии: Аутосенсибилизация (282 чел.), Ишемическая болезнь сердца (55% псориаз (77), злокачественные новообразования (154), доброкачественные новообразования (149), холецистэктомия (97), хронические воспалительные заболевания яичников (186 чел.)
Также были проведены исследования уровня и качества корреляционных взаимосвязей у 65 лиц, подвергающихся стрессовым нагрузкам в силу тяжелых семейных обстоятельств (смерть близких людей).
Фотопериодичность, в отличие от сезонных и климатических параметров, не подвержена резким колебаниям, является стабильным признаком северных территорий, оказывает очень резкое влияние на уровень иммунологической реактивности. В связи с этим, представляло интерес изучение характеристики коррелятивных отношений в зависимости от фотопериодики; время сравниваемых исследований - июнь и октябрь.
В качестве источника материала был использован банк данных обследований отдела экологической иммунологии Института физиологии природных адаптации УрО РАН.
Определяли содержание в периферической крови лейкоцитов, лимфоцитов, Т- клеток, В- лимфоцитов, лимфоцитов с рецепторами CD4 (хелперы/индукторы), CD8 (супрессоры/киллеры), CD3 (зрелые лимфоидные клетки), CD5 (общая популяция Т- клеток), CDllb (клетки с рецептором для интегрина), CD16 (естественные киллеры), CD10, (клетки с рецепторами, отражающие лимфопролиферацию), CD25 (с рецептором к интерлейкину-2), CD71 (с рецептором к трансферину), HLA-DR (активированные Т-, В- клетки), CD22 (В- клетки), CD95 (клетки, меченные к апоптозу), сывороточных иммуноглобулинов А, М, G, Е, содержание интерлейкина-2, концентрации ФНО-а, аутоантител к кардиолипину, к двухспиральной ДНК и рибонуклеопротеиду.
Выделение мононуклеаров из периферической крови проводилось по методу A. Boymn (1976). Для получения лейкоцитарной взвеси венозная кровь, взятую в асептических условиях в пробирку с гепарином в количестве 5-10 мл из расчета 20 ед.на 1 мл крови, выдерживалась при комнатной температуре в течение 1,5 часа для оседания эритроцитов, после чего плазма с элементами белой крови отсасывалась в стерильную пробирку и центрифугировалась 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Надосадочная жидкость удалялась и вместо нее наливался раствор Хенкса без ионов кальция и магния в том же объеме. После смывания клеток со дна и стенок пробирок проводилось дважды дополнительное центрифугирование отмытых форм. Осадок клеток ресуспендировался в среде 199 с 10% бычьей сывороткой, концентрация доводилась до 105/мл. Полученная клеточная взвесь использовалась для постановки реакции розеткообразования и непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли».
Определение количества Т- и В- лимфоцитов проводили в реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана и мыши (M.YondoI, 1972). Реакции спонтанного розеткообразования с 0,5% взвесью эритроцитов и указанной концентрации мононуклеаров в объеме ОД мл каждого ингредиента выдерживали при 37С 15 мин, затем центрифугировали 5 мин. при 1000 оборотах в минуту, оставляли в холодном месте на 45 мин. После добавления ОД мл 2,5% раствора глютаральдегида оставляли при комнатной температуре на 15 мин. Подсчет розеток проводили с помощью камеры Горяева микроскопией с увеличением в 900 раз; за РОК принимали клетки, несущие 4 и больше эритроцита.
Субпопуляции Т- лимфоцитов определялись методом непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенная капля», производства Онкологического центра (г.Москва) и НПО «ДиагноТех» («DiagnoTech» Ltd), (г.Новгород).
После выделения в градиенте фикол-верографин 0,5 млн. лейкоцитов, наносилась капля на предметное стекло, которое помещалось на 20мин в бытовой холодильник при 4С. Таких капель на стекле может быть несколько. По завершении инкубации остатки жидкости высушивались при комнатной температуре. На высушенную каплю наносилось 20 мкл 0,3% раствора перекиси водорода (1мл. 3% аптечной перекиси +9 мл дистиллированной воды) на 10 мин. при комнатной температуре для блокады эндогенной пероксидазы. Промывалась капля 5 раз по 100 мкл аптечного физраствора. Наносилось 20 мкл хорошо перемешанного раствора моноклонального антитела, проводилась инкубация 1 час при комнатной температуре под чашкой Петри на влажной бумаге или салфетке. Наносилось 20 мкл хорошо перемешанного пероксидазного конъюгата. Инкубация составляла 1 час. После окончания инкубации наносился раствор хромогена; (10 мл. аптечного физраствора + 1 таблетка ДАБ и после полного ее растворения + 100 мкл аптечной 3%- ой перекиси водорода), по 200 мкл на на каплю. Инкубация проводилась от 1 до 10 мин. под визуальным контролем до появления окрашивания. Отмывались указанным ранее способом, докрашивались ядра гематоксилином или аптечным раствором бриллиантового зеленого. Подсчитывалось число клеток с коричневатой зернистостью, опустив объектив микроскопа 90 в глицерин.
Корреляционные взаимосвязи иммунных параметров при некоторых иммунных дисбалансах
Представляло интерес сравнение уровня и качества корреляционных взаимосвязей у 65 лиц, подвергающихся стрессовым нагрузкам в силу тяжелых семейных обстоятельств (смерть близких людей). Особенностью иммунного статуса таких людей является высокие концентрации CD 16 и CD22 (соответственно 1,25 ± 0,28 109 и 0,74 ± 0,12 109 кл/л; р 0,01 -0,001) на фоне дефицита содержания CD3 и CD5 (соответственно 0,56 ± 0,27 и 0,62 ± 0,12 109 кл/л; р 0,05 - 0,01) и активности фагоцитов (32,2874 ± 5,83 %; р 0,01). Установлено, что в этих условиях уровень регистрируемых корреляций значительно выше, количество связей больше и часто регистрируется изменчивость знака взаимосвязей. Появляются сильные прямые взаимосвязи (г = 0,84 - 0,89) между содержанием хелперов (CD4), нормальных киллеров (CD16) и В-клеток (CD22). Регистрируются разнонаправленные связи между содержанием CD25 и количеством указанных клеток (в пределах г — 0,58 - 0,77). Выявляются впервые отрицательные связи содержания естественных киллеров и активности фагоцитоза, причем не только нейтрофильных лейкоцитов (г = -0,69), но и моноцитов (г = -0,84).
Наличие изменений уровня и качества корреляционных взаимосвязей иммунологических параметров при различных иммунных дисбалансах дает основание полагать, что подобные закономерности могут быть выявлены при дефектах иммунной защиты, сопряженных с манифестацией клинических проявлений.
Проведен сравнительный анализ частоты регистрации иммунных дисбалансов у 1000 взрослых людей работоспособного возраста при различной хронической патологии (табл. 4). В качестве источника материала был использован банк данных исследований отдела экологической иммунологии Института физиологии природных адаптации УрО РАН. Расположен материал в порядке убывания частоты регистрации того или иного отклонения.
Как видно из представленных данных, наиболее частым вариантом дисбаланса являются дефицит фагоцитарной защиты за счет снижения активности фагоцитов в сочетании с нейтропенией, а также функциональная недостаточность Т-клеток. В случаях нейтропении дефицит фагоцитарной защиты регистрировали у 387 человек, т.е. в 89,17 %. Коррелятивные взаимосвязи в этой группе обследованных становятся очень сильными: г=0,92 между активностью фагоцитоза и абсолютным содержанием нейтрофильных лейкоцитов и г=0,83 с количеством CD5. Между уровнем интенсивности фагоцитоза (фагоцитарное число) и % активных фагоцитов регистрируется отрицательная зависимость выявлено (г = - 0,67).
Лимфоцитоз, характерный для северян, прямо взаимосвязан с активностью спонтанной бласттрансформации и отрицательно коррелирует с уровнем индуцированной бласттрансформации Т-лимфоцитов (г - 0,81 и г — - 0,92); зависимости от активности РБТЛ В-клеток не выявлено (г = 0,21). Следовательно, увеличение содержания лимфоцитов в периферической крови отражает лимфопролиферативную реакцию, возможно, связанную со снижением способности Т-клеток отвечать на антигены (митогены) реакцией бласттрансф ормации.
Аутосенсибилизация (рис. 14) совмещается с повышенными концентрациями цитотоксических Т-лимфоцитов и нормальных киллеров. В группе лиц с аномально высокими уровнями аутоантител (282 человека) выявляются 215 человек с увеличенными концентрациями CD8 и 234 - с повышенными концентрациями CD 16. И в общей, и в сокращенной группе с наличием аутосенсибилизации взаимосвязи величин указанных параметров достаточно велики (соответственно г — 0,67 и 0,69, а также 0,77 и 0,84). В меньшей степени тесные, но отрицательные зависимости наблюдаются между уровнями аутоантител и % активных фагоцитов (г = -0,59). В общую группу входят больные с диагнозами: системная красная волчанка (52), ревматоидный артрит (80), аутоиммунный тиреоидит Хошимото (150).
Представляло интерес выяснить характер корреляционных взаимоотношений при различных вариантах иммунных дисбалансов, а также установить взаимосвязь манифестных проявлений дефицита иммунной защиты с колебаниями уровней изучаемых параметров.
Иммунологической особенностью больных с ишемической болезнью сердца (рис. 15) является дефицит содержания в периферической крови Т-лимфоцитов (CD5 0,82 ±0,13; CD3 0,69 + 0,09 109 кл/л), высокие концентрации CD8 (0,85±0,09 109 кл/л), CD25, CD71, CD95, HLADR (соответственно 0,72±0,16; 0,98±0,13; 0,90±0,12 и 0,95 ±0,11 109 кл/л). У 90,5% больных отмечаются признаки аутосенсибилизации с активацией антитело-опосредованной цитотоксичности: повышенные концентрации антител к кардиолипину выявляли у 66,7 % при усредненных уровнях их содержания 32 ± 4,3 МЕ/мл. Аномально высокие уровни содержания ЦИК (в среднем 4,50 ±0,43г/л) выявили у 90,5% больных. Антитела к кардиолипину являются основным типом антител к фосфолипидам, их иммунные комплексы обладают выраженной прокоогулянтной активностью, активируют агрегацию тромбоцитов, обусловливают повреждение эндотелиальных клеток. Выявлены отрицательные корреляции содержания указанных антител с концентрациями тромбоцитов (г = -0,84), а также с активностью агрегации тромбоцитов с адреналином (г = -0,74) и с АДФ (г = -0,67) и положительная взаимосвязь с содержанием фибриногена (г = 0,63). Уровни антител к кардиолипину повышаются по мере увеличения содержания триглицеридов и ЛПНП. Итак, больные с концентрацией антител к кардиолипину 20 МЕ/мл и более имеют повышенный риск развития тромбозов, в том числе тромбозов аутовенозных шунтов.
