Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль синаптическои пластичности в процессах обучения и памяти .
1.1. Теоретические представления 14
1.2. Экспериментальные модели длительных пластических перестроек 14
1.3. Изменение активности нейронов гиппокампа в результате обучения 15
1.4. Модификация пороговых и пластических свойств нейронов гиппокампа в разных поведенческих ситуациях 22
14.1 Пороговая интенсивность раздражения 22
1.4.2. Амплитуда популяционного спайка 22
1.4.3. Зависимость амплитуды популяционного спайка от интенсивности тестирующего раздражения в срезах гиппокампа крыс разных групп 23
1.4.5. Зависимость амплитуды популяционного спайка от длительности сенсорной стимуляции 25
1.4.6. Влияние соотношения светового и электрокожного раздражений 27
1.4.7. Роль фактора сочетаний УС и БС 28
1.4.8. Фасилитация при парной стимуляции в срезах гиппокампа крыс разных групп 33
1.4.9. Зависимость амплитуды популяционного спайка от эффективности обучения 37
1.4.10. Низкочастотная фасилитация в срезах гиппокампа обучившихся животных 43
1.4.11. Электрофизиологические свойства срезов гиппокампа крыс через неделю после обучения 47
1.4.12. Появление ранних форм обучения зависит от постнатального созревания разных механизмов пластичности в гиппокампе крыс 50
ГЛАВА 2. Внутриклеточные механизмы синаптической пластичности .
2.1. Природа внутриклеточного Са2+сигнала 61
2.1.1. Кальциевые каналы 61
2.1.2. Высвобождение из внутриклеточных депо 62
2.2. Са2+-зависимые пластические процессы 63
2.2.7. Роль Са2-зависимых протеинкиназ в модификации эффективности межнейронных взаимодействий 63
2.2.2. Мембранный потенциал митохондрий как показатель величины кальциевого сигнала. АТФ-зависимые пластические процессы 67
2.2.3.Связь с активностью ферментов энергетического метаболизма 71
2.3. Участие ферментов энергетического метаболизма в процессах обучения и памяти 78
2.3.1. Влияние сенсорного притока на активность сукцинатдегидрогеназы 78
2.3.2. Соотношение изменений активности СДГ и свойств синаптической передачи в срезах гиппокампа при функциональной нагрузке 80
2.3.3. Корреляция активности сукцинатдегидрогеназы и пластических свойств нейронов гиппокампа 83
2.3.4. Влияние ЭКР на изменение реакций нейронов гиппокампа и активности сукцинатдегидрогеназы под действием сенсорных раздражителей 86
2.3.5. Длительные изменения энергетического метаболизма клеток гиппокампа в результате обучения 88
2.3.6. Влияние обучения на изменение реакций нейронов гиппокампа и активности сукцинатдегидрогеназы под действием сенсорных раздражителей 90
2.3.7. Влияние обучения на изменение реакций нейронов гиппокампа и активности NADH-дегидрогеназы под действием сенсорных раздражителей 91
2.3.8. Множественная корреляция изменений амплитуды ответа и активности ферментов энергетического метаболизма 94
ГЛАВА 3. Системные механизмы регуляции пластичности
3.1. Дивергентно-конвергентный характер распространения возбуждения в ЦНС 104
3.2. Модулирующие системы и гиппокамп 105
3.2.1 Влияние норадреналина на распространение афферентного сигнала вгиппокампе 105
3.2.2. Вазопрессинергическая система и гиппокамп 107
3.2.3. Роль серотонина в морфо-функциональных перестройках афферентных связей гиппокампа 109
3.2.4. Другие медиаторные системы 112
3.3. Функции неспецифических систем мозга в поведении 113
3.4. Проблема локализации длительных пластических перестроек 116
3.5.1. Изменение чувствительности к норадреналину под действием побуждающего стимула при выработке условного рефлекса двустороннего избегания 119
3.5.2. Влияние вазопрессина на срезы гиппокампа обучившихся крыс 123
3.5.3. Следовые эффекты серотонина в гиппокампе 126
3.5.4. Влияние серотонина на величину низкочастотных перестроек реакций нейронов поля СА1 гиппокампа крыс 127
3.5.5. Длительность сохранения следовых эффектов серотонина при разных условиях стимуляции 129
3.5.6. Сходство эффектов обучения и аппликации серотонина на электрическую активность переживающих срезов гиппокампа крыс 130
Обсуждение результатов 132
Заключение 136
Выводы 144
Список литературы 147
- Изменение активности нейронов гиппокампа в результате обучения
- Низкочастотная фасилитация в срезах гиппокампа обучившихся животных
- Роль Са2-зависимых протеинкиназ в модификации эффективности межнейронных взаимодействий
- Роль серотонина в морфо-функциональных перестройках афферентных связей гиппокампа
Введение к работе
Интегративная деятельность мозга обеспечивается системой нейрохимических механизмов. В соответствии с принципом системной детерминации ни один из факторов, в том числе нейрохимических, не обладает детерминирующей силой сам по себе, но приобретает такую силу в сочетании с другими факторами в их системе. Методологический принцип таких исследований -детальные физиолого-биохимические сопоставления [Крутиков, 1989].
В настоящее время одним из наиболее распространенных является предположение о том, что в основе ассоциативного обучения и памяти лежит длительное изменении эффективности синаптической передачи [Voronin, 1983; Eccles, 1986; Lynch, Staubli, 1991; Bliss, Collingridge, 1993; McNaughton, 1993; Barnes et al., 1994; Tsien et al., 1996; Martin et al., 2000]. Представление о существовании модифицирующихся синапсов было создано на основании априорных соображений и широко использовалось в теоретических работах [Hebb,1949; Griffith, 1966; Brindley, 1967; Marr, 1971]. Очевидно, что, регуляция клеточных функций направлена на поддержание внутриклеточного гомеостаза и кажется маловероятным, что длительные пластические перестройки могут осуществляться по неким формальным правилам. Думается, наиболее существенные и длительные изменения должны происходить в условиях, затрагивающих жизненно-важные функции клетки, такие, например, как энергетический метаболизм.
Роль митохондрий в пластических процессах не ограничивается их участием в обеспечении энергетических нужд для поддержания ионных градиентов, синтеза предшественника медиатора, обратного захвата, упаковки в везикулы и др. Связь метаболизма глутамата, одного из главных возбуждающих нейротрансмиттеров в ЦНС, с энергетическим метаболизмом может оказывать влияния на величину запаса медиатора [Siesjo, 1978; Hertz et al, 1988], а конкурентное взаимодействие реакций, лежащих в основе синтеза АТФ и депонирования Са2+ определяет участие дыхательных ферментов в Са2+-зависимых пластических процессах [Bernardi, Petronilli, 1996; Ichas et al., 1997; Bindokas et al., 1998; Brustovetsky, Dubinsky, 2000; Nicholls, Budd, 2000].
При исследовании механизмов обучения и памяти не менее важной является проблема локализации длительных пластических перестроек. Нейрохимические механизмы интегративной деятельности мозга осуществляются при тесном взаимодействии разных медиаторных систем [Кругликов, 1986; Котляр, 1986]. Разными медиаторными системами обеспечиваются информационная, побуждающая и подкрепляющая функции [Симонов, 1987]. Полагают, что только динамическая конвергенция разнородных влияний может обеспечить адаптацию к условиям внешней среды [Батуев, Соколова, 2001].
Важная роль не только "информационных", но и так называемых неспецифических, прежде всего моноаминергических систем мозга в подкреплении [Poshel, Ninteman, 1963; Kety, 1967; Громова, 1980] и обучении [Кругликов, 1986; Harrington et al., 1988] делает их полноправными кандидатами при исследовании локализации длительных пластических перестроек и механизмов хранения. Более того, есть мнение о биологической нецелесообразности длительных пластических перестроек в синаптических переключениях, лежащих на пути специфических сенсорных проекций [Сторожук, 1986].
Сигналам, поступающим от так называемых неспецифических систем мозга чаще всего отводят хотя и важную, но все же второстепенную роль нейромодуляторов, санкционирующих длительные пластические перестройки межнейронных взаимодействий, обеспечивающих непосредственную связь сенсорных и моторных центров при формировании моторных программ. Между тем, модулирующие системы по своим свойствам способны занять центральное положение в функциях управления интегративной деятельностью мозга, оказывая избирательное, возбуждающее или тормозное влияние на прохождение сигнала и извлечение моторных программ, причем такая избирательность может формироваться на основе предшествующего опыта.
Цель исследования
С помощью электрофизиологических, нейрохимических и фармакологических методов проследить ход пластических перестроек в гиппокампе при выработке условного рефлекса двустороннего избегания и выявить факторы, определяющие их индукцию на разных этапах обучения.
Задачи исследования
1. Сравнить характеристики суммарных моносинаптических реакций нейронов поля
СА1 на разных стадиях выработки условного рефлекса двустороннего избегания и через неделю после обучения.
2. Сравнить возможности выработки условного рефлекса двустороннего избегания в
периоды не созревших или частично созревших разных механизмов длительных пластических перестроек в гиппокампе крысят разного возраста
3. Провести корреляционный анализ взаимоотношения модификаций свойств
синаптической передачи и активности ферментов начального звена электрон-транспортной цепи митохондрий в гиппокампе крыс под влиянием обучения.
4. Сравнить эффекты разных нейромедиаторов, участвующих в организации
оборонительного поведения (норадреналин, вазопрессин, серотонин) на срезах гиппокампа контрольных и обучившихся крыс.
Научная новизна работы.
На примере оборонительного поведения впервые детально, с учетом возможных действующих факторов исследованы модификации реакций нейронов поля СА1 гиппокампа крыс в процессе перехода от простого ассоциативного обучения (условнорефлекторный страх) к формированию адекватных поведенческих актов.
Впервые сравниваются возможности обучения в зависимости от созревания разных механизмов пластичности в гиппокампе крыс в разные периоды онтогенетического развития.
Впервые показано, что появление инструментальных условных реакций при выработке условного рефлекса двустороннего избегания, а также в процессе онтогенетического развития зависит от величины депрессии реакций нейронов поля СА1 гиппокампа крыс.
Фаза потенциации реакций нейронов поля СА1 наблюдается на стадии формирования эмоционально-негативных условных реакций, а период созревания механизмов длительной потенциации в гиппокампе характеризуется способностью к выработке условнорефлекторного страха, но не инструментальных компонентов оборонительного поведения.
Впервые обнаружено, что после процедуры обучения изменяются частотные характеристики пластических перестроек в гиппокампе. Этот эффект сохраняется через неделю. Изменения амплитудных характеристик суммарных
моносинаптических реакций нейронов поля СА1 не сохраняются через неделю после обучения, а воспроизводятся в ответ на обстановочные, а главным образом сигнальный раздражители.
Впервые проанализированы биохимические возможности переключения механизмов пластичности на завершающих стадиях выработки условного рефлекса двустороннего избегания и их связь с перестройками респираторной активности митохондрий.
Впервые при любом типе сенсорных воздействий обнаружена тесная корреляция между модификациями реакций нейронов гиппокампа и активности ферментов начального звена электрон-транспортной цепи.
Впервые обнаружено, что активация сукцинатдегидрогеназного комплекса в зависимости от длительности сенсорных воздействий описывается асимптотической функцией. В условиях биологически значимой стимуляции наблюдается ограничение прироста активности сукцинатдегидрогеназы, что приводит к увеличению доли участия NADH-дегидрогеназного комплекса в восстановлении протонного градиента митохондрий.
Впервые обнаружено, что как при сочетанном, так и при несочетанном предъявлении эффекты условного и безусловного стимулов неаддитивны и наблюдается дополнительный прирост активности сукцинатдегидрогеназы и это коррелирует с увеличением эффективности основного афферентного входа поля СА1.
Впервые выявлена решающая роль ограничения активности сукцинатдегидрогеназного комплекса в пластических перестройках, происходящих в гиппокампе на завершающих стадиях обучения при формировании адекватного приспособительного поведения.
Впервые обнаружено, что после процедуры обучения происходит изменение эффективности модулирующего влияния серотонина, норадреналина и вазопрессина на амплитудные, частотные и пластические свойства реакций нейронов поля СА1. Модификация эффектов норадреналина и вазопрессина наблюдается уже на ранних стадиях выработки, еще до появления адекватных условных реакций.
Научно-теоретическое и практическое значение работы
Теоретическое значение работы заключается в дальнейшем развитии представлений о роли системных и внутриклеточных механизмов в пластических перестройках межнейронных взаимодействий при обучении. Работа вносит вклад в понимание роли разных механизмов пластичности в адаптивных функциях мозга.
Сравнение изменений, обнаруженных в гиппокампе на разных стадиях обучения позволило выявить разную направленность пластических перестроек е период идентификации условного стимула в качестве сигнала и при формировании и воспроизведении адекватной моторной программы, что сопровождается модификацией эффективности влияния модулирующих систем и тесно связано с активностью митохондрий. Исследование интегративных функций в период их становления дало возможность оценить долю участия разных механизмов в обеспечении пластических процессов, лежащих в основе приспособительного поведения. Анализ собственных и литературных данных позволил разработать концепцию о взаимодействии разных медиаторных систем и роли митохондрий в индукции пластических перестроек в момент образования или воспроизведения ассоциативных связей.
Научно-практическое значение работы, прежде всего, связано со сформулированными в ней новыми представлениями о механизмах взаимодействия разных медиаторных систем в пластических перестройках при обучении. Эти представления могут иметь дифференциально-диагностическое значение и могут быть использованы для оценки и выбора правильной тактики коррекции и профилактики разных вариантов мнестических расстройств. Выявленные закономерности развития пластических процессов на разных этапах обучения и воспроизведения позволяют выделить показатели, которые могут быть использованы для оценки эффективности лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Направленность модификаций, лежащих в основе изменения эффективности распространения афферентного сигнала в гиппокампе, специфична при использовании разных видов памяти в ходе выработки оборонительного условного рефлекса. Потенциация суммарных моносинаптических реакций нейронов СА1 наблюдается в фазе выработки классического (условнорефлекторный страх), но не инструментальных оборонительных
рефлексов. Выбор и реализация адекватных оборонительных реакций тесно связаны с депрессией, развивающейся после потенциации синаптической передачи САЗ-СА1. Аналогичные закономерности наблюдаются и в раннем онтогенезе.
2. Модификация эффективности межнейронных взаимодействий в гиппокампе,
обнаруженная при выработке условного рефлекса двустороннего избегания, не сохраняется через неделю после обучения. Повторная индукция пластических перестроек происходит во время воспроизведения под действием сигнальных раздражителей, роль сигналов при этом выполняют не только условный стимул, но и обстановочные раздражители.
3. Модификация нейронных реакций при выработке оборонительного условного
рефлекса тесно связана с изменением активности митохондрий. Перераспределение потоков в высокодинамичной системе «энергетический метаболизм - метаболизм глутамата - Са гомеостаз» может быть одной из причин изменения пластических свойств синаптической передачи в процессе обучения и воспроизведения.
4. После процедуры обучения меняется эффективность и частотные характеристики
не только основных афферентных, но и ряда модулирующих входов поля СА1 гиппокампа. Длительное изменение эффективности модулирующих входов рассматривается в качестве ключевого фактора, создающего предпосылки для дифференцированного влияния на пластические свойства клеток и обеспечивающего восстановление характеристик межнейронных взаимодействий при воспроизведении пространственного и временного паттерна активности нейронов, необходимого для реализации приспособительного поведения.
Изменение активности нейронов гиппокампа в результате обучения
В настоящее время не существует единой точки зрения на функции гиппокампа в процессах обучения и памяти. Общепризнанной считается роль гиппокампа в пространственном обучении, причем рядом авторов подчеркивается скорее информационное, нежели "навигационное" значение активности нейронов гиппокампа [Olton et al., 1979; Jarrard, 1980; Rusakov et al., 1997; Hampson et al., 1999; Wood et al., 1999]. Предполагают участие гиппокампа и в некоторых других видах памяти, таких как сенсорный опыт, обогащенная [Green, Greenough, 1986; Foster et al., 1996], обедненная [Xu et al., 1998] или новая среда обитания [Foster, Dumas, 2001], кратковременная и рабочая память [Sakurai, 1990], ассоциативное обучение [Bergeretal., 1983; Thompson, Kim, 1996; McEchron, Disterhoft, 1997;
Desmedt et al., 1998; Garcia et al., 1998]. В то же время, определенные компоненты некоторых из них, а также ряд других форм памяти считаются гиппокампнезависимыми [Bliss, Richter-Levin, 1993; Jarrard, 1993; Thompson, Kim, 1996; Desmedt et al., 1998].
Классификация разных форм памяти способствует более глубокому пониманию роли гиппокампа при запоминании, хранении и воспроизведении [Thompson, Kim, 1996]. Наиболее убедительной представляется гипотеза об участии гиппокампа в организации эксплицитной памяти, когда фиксируются существенные связи между объектами [Cohen, 1984; Squire, 1987; Schacter, 1987; Desmedt et al., 1998; Eichenbaum, 1999]. Характерной особенностью эксплицитной памяти, в отличие от имплицитной, является то, что соответствующий навык может быть использован в совершенно новой ситуации, активироваться широким классом афферентных сигналов и осуществляться с помощью различных моторных программ, тогда как не зависящие от гиппокампа формы памяти строго привязаны к ситуации и определенному набору стимулов [Cohen, Squire, 1980; Tulving, Schacter, 1990]. Полагают, что в гиппокампе формируется когнитивная карта, на основе которой осуществляется выбор стратегии целенаправленного поведения [O Keefe, Nadel, 1978]. Животные с нарушениями декларативной памяти обучаются не хуже контрольных [Eichenbaum et al., 1991], однако воспроизведение навыка затруднено при незначительном изменении обстановки, сопровождающей выработку [Cohen, Squire, 1980; Tulving, Schacter, 1990]. Таким образом, экстрагиппокампальные виды памяти характеризуются жесткой привязанностью к ситуации и отсутствием способности переноса навыка. Те же закономерности наблюдаются и у людей с амнезиями, вызываемыми нарушениями функций гиппокампа [Eichenbaum et al., 1991; Squire, 1992].
Ассоциативное обучение традиционно относят к имплицитной памяти [Thompson, Kim, 1996]. Однако целый ряд фактов дает основание полагать, что определенные компоненты ассоциативного обучения, может быть за исключением самых простых форм, могут иметь отношение к эксплицитной памяти [Berger et al., 1986; Jeffery, Morris, 1993]. При этом в гиппокампе происходит фиксация не столько моторных, сколько эмоциональных [Thompson, Kim, 1996] или "понятийных" [Rescorla, 1988; Desmedt et al., 1998; Eichenbaum, 1999; Munera et al., 2001] компонентов условной реакции. Так, например, условный рефлекс может вырабатываться у людей с нарушенной функцией гиппокампа, однако они не в состоянии описать этого события. Эта функция гиппокампа, по-видимому, до некоторой степени развита и у высших позвоночных животных, в частности у крыс.
С этих позиций любопытно проследить ход пластических перестроек при распространении сигнала в гиппокампе. Активность нейронов гиппокампа меняется в зависимости от предшествующего опыта, в том числе в результате ассоциативного обучения [Olds et al., 1972; Segal, 1973; Berger et al., 1976; Best, Best, 1976; Sideroff, Bindra, 1976; Deadwyler et al., 1979; Lopes da Silva et al., 1990; Jarrard, 1993; Moser, 1995]. Практически любая естественная активация неассоциативного характера ведет к усилению реактивности нейронов гиппокампа на последующие тестирующие раздражения [Sharp et al., 1985; Green, Greenough, 1986; Foster, Dumas, 2001]. При этом увеличивается связывание АМРА-рецепторов [Foster et al., 1996; Gagne et al., 1998], шипиковый аппарат дендритов [Juraska et al., 1985; Moser et al., 1994]. Более того, в зубчатой фасции растет число вновь образующихся нейронов [Kempermann et al., 1997,1998; Gould et al., 1999; van Praag et al., 1999].
Такого рода перестройки по всей вероятности связаны с усилением афферентного притока к нейронам, тем более что блокада синаптической передачи препятствует развитию потенциации [Foster et al., 1996]. Секретируемые при этом медиаторы могут выполнять трофическую функцию [Thoenen, 1995; Bonhoeffer, 1996; Gomez-Pinilla et al., 1998; van Praag et al., 1999; Schinder et al., 2000; Wong, Wong, 2001; Kovalchuk et al., 2002]. К сожалению, такого рода изменения, вероятно, трудно определить морфологическими методами, поскольку, как полагают, усиливается не только рост, но и ретракция нейритов [Scott, Luo, 2001].
Полагают, что в этих изменениях находит отражение процесс фиксации новой информации [Moser et al., 1994; Foster, Dumas, 2001]. Однако использование в качестве новой ситуации сенсорной депривации ведет к длительной депрессии реакций нейронов поля СА1 [Xu et al., 1998], хотя заметная депрессия развивается только в ранее потенциированных синапсах. Этот факт, в свою очередь свидетельствует в пользу гипотезы о трофической роли сенсорных факторов.
В то же время, эта функция, вероятно, теряет свое значение по ходу распространения сигнала в гиппокампе. Так, например, белок c-kit, участвующий в росте нейритов, неравномерно распределен в разных областях гиппокампа [Katafuchi et al., 2000]. Наибольшее его содержание обнаружено в поле САЗ. Дефицит c-kit приводит к подавлению длительной потенциации в САЗ, но не в СА1, что сопровождается ухудшением обучения [Katafuchi et al., 2000]. Ассоциативное обучение неизбежно заключает в себе перестройки, связанные с дополнительной активацией афферентных входов [Alkon et al., 1982; Gomez-Pinilla et al., 1998; Gould et al., 1999; Шерстнев с соавт., 2001]. Потенциация реакций нейронов зубчатой фасции по характеру мало различается в ситуациях ассоциативного [Weisz et al., 1984; Skelton et al., 1987; Tocco et al., 1991; Thompson, Kim, 1996; Rusakovet al., 1997; McKernan, Shinnick-Gallagher, 1997; Gomez-Pinilla et al., 1998; O Malley etal., 1998; Gould etal., 1999] или неассоциативного обучения [Sharp et al., 1985; Juraska et al., 1985; Green, Greenough, 1986; Moser et al., 1994; Kempermann et al., 1997, Gagne et al., 1998; Gould et al., 1999; van Praag et al., 1999; Foster, Dumas, 2001]. Зависимость потенциации от условий и длительности стимуляции дает основание полагать, что она в большей степени является следствием не самой процедуры обучения, а скорее усиления афферентного притока [Sideroff, Bindra, 1976; Best, Best, 1976; Winson, Abzug, 1978; Fox, Ranck, 1979; Sharp et al., 1985; Green, Greenouugh, 1986; Moser et al., 1993].
Низкочастотная фасилитация в срезах гиппокампа обучившихся животных
Низкие амплитуды популяционного спайка в гиппокампе крыс, декапитированных через неделю после обучения, которые были обнаружены в представленной выше серии экспериментов, могут свидетельствовать в пользу предположения о том, что хранение информации осуществляется в виде набора синапсов разной эффективности, причем большинство синапсов, по-видимому, должны находиться в низкоэффективном состоянии. Однако нельзя было исключить влияния обстановочных сигналов. Поэтому в дальнейших экспериментах выработку условного рефлекса и декапитацию проводили в разных помещениях. Эксперименты этой серии включали 3 группы крыс, обученных за 1 неделю до приготовления среза. Крысы первой группы (п=10) находились в домашней клетке вплоть до момента декапитации и не подвергались дополнительным воздействиям. Крыс второй группы (п=10) перед декапитацией помещали в экспериментальную камеру для выработки условного рефлекса двухстороннего избегания и предъявляли 15 условных стимулов (15 вспышек света по 5 сек каждая) без подкрепления. В третьей группе (п=10) проводили повторную выработку до критерия 5 правильных реакций из 6. Во второй группе крыс не было обнаружено условных реакций на свет ни в одном эксперименте. В третьей группе достаточно было 1-3 сочетаний для воспроизведения выработанной ранее условной реакции.
Зависимость амплитуды популяционного спайка от интенсивности тестирующего раздражения в гиппокампе крыс, не подвергавшихся через неделю после обучения дополнительным воздействиям (первая группа), по своим характеристикам ближе всего к группе пассивного контроля, хотя в среднем амплитуда ответов несколько меньше (Рис. 24). Однако меньшие амплитуды популяционного спайка вряд ли являются достаточным основанием полагать, что это связано с длительным сохранением изменений, происходящих в гиппокампе при обучении, учитывая тот факт, что через неделю после выработки характерные для обучившихся крыс свойства САЗ-СА1 реакций восстанавливаются под действием обстановочных сигналов, если крыс декапитировать в тех же условиях, при которых происходила выработка (Рис. 24). Вероятно, даже когда через неделю после выработки крысу берут из клетки и выносят из вивария, уже эти и другие сопутствующие им сигналы достаточны для начала воспроизведения ассоциативных перестроек. Если же таким крысам предъявить всего лишь несколько УС (вторая группа), форма зависимости амплитуды ПС от интенсивности тестирующего раздражения КШ достоверно изменялась (Рис. 25), приближаясь к той, которая была обнаружена сразу после выработки. Эффект еще более выражен в третьей группе крыс после воспроизведения условной реакции после лишь 1-3 сочетаний (критерий коллатералей Шаффера было обнаружено более раннее появление низкопороговых ответов в третьей группе крыс по сравнению со второй и, в особенности с первой группой (0.08±0.02 мВ - без напоминания, 0.47±0.05 мВ - после напоминания, 0.56±0.08 мВ - после воспроизведения УР). При интенсивности стимуляции 20 V наблюдалось обратное соотношение: амплитуда популяционного спайка в срезах гиппокампа контрольных крыс составила 2.13±0.13 мВ, без напоминания -1.31 ±0.13 мВ, после напоминания - 0.82±0.08 мВ и 0.73±0.05 мВ - после воспроизведения условной реакции. Такая форма зависимости может свидетельствовать об ограничении общего числа активных связей, имеющих в то же время большую эффективность. Кривая зависимости амплитуды популяционного спайка от интенсивности стимуляции коллатералей Шаффера в срезах гиппокампа второй группы крыс занимала промежуточное положение.
Взятые вместе, эти факты дают основание полагать, что изменение эффективности синаптической передачи происходит по мере предъявления обстановочных и условных сигналов, причем, по-видимому, при условии воспроизведения (вспоминания) фиксированной ранее информации.
Разные сроки созревания медиаторных систем и ряда внутриклеточных механизмов дают возможность оценить их участие в формировании разных видов памяти.
Способность к длительной потенциации развивается в гиппокампе крыс достаточно рано [Bekenstein, Lothman, 1991; Harris, Teyler, 1984]. На ранних этапах созревания глутаматергических синапсов (15-16 постнатальные дни) их пластические возможности значительно (в наших экспериментах 380±18%, F=17.16, р 0.001) превышают те, которые обнаружены в гиппокампе взрослых крыс. Можно было предположить, что в течение этого периода постнатального онтогенеза могут возникать формы обучения, зависящие от созревания механизмов, лежащих в основе длительной потенциации.
Важными составляющими выработки рефлекса являются определение сигнального значения условного стимула, а также способность обнаружить и зафиксировать правильную реакцию в неблагоприятной ситуации. Как обнаружено, в онтогенезе они появляются не одновременно.
Выработка условного рефлекса двустороннего избегания практически невозможна в течение раннего периода развития (15-18 постнатальный день), несмотря на высокую способность синаптических связей гиппокампа к длительной потенциации. За все время выработки крысята (N=5) только несколько раз переходили в соседний отсек после включения условного стимула, что можно объяснить случайным совпадением. Такие реакции не сохранялись и, в отличие от взрослых крыс, их число не увеличивалось по мере сочетаний (Рис. 26).
Роль Са2-зависимых протеинкиназ в модификации эффективности межнейронных взаимодействий
Наиболее пристальное внимание с точки зрения участия в регуляции долговременных видов синаптической пластичности уделяют так называемым подвижным буферным системам [Kostyuk, Verkhratsky, 1994; Vissel et al., 2001]. Внутриклеточные буферные системы постоянно ограничивают уровень Са2+ не только во времени, но и в пространстве, не позволяя диффундировать далеко за пределы постсинаптической области [Vissel et al., 2001]. Эти системы представлены целым набором Са2+-связывающих белков и ферментов [Gamble, Koch, 1987; Kostyuk, Verkhratsky, 1994; Ghosh, Greenberg, 1995; Vissel et al., 2001], активирующихся при стимуляции клетки, что, в свою очередь, приводит к фосфорилированию многочисленных белков мишеней, многие из которых являются мембраносвязанными [Геннис, 1997; Ghosh, Greenberg, 1995]. Согласно современным представлениям эти системы участвуют в осуществлении ряда клеточных функций, хотя детали механизма их воздействия пока недостаточно изучены.
В активированном состоянии Са2+-связывающие ферменты могут действовать локально в синаптической области [Lisman, Goldring, 1988; Shen, Meyer, 1999] или опосредовать более универсальные изменения, активируя молекулярные процессы, связанные с регуляцией экспрессии генов [Teyler et al., 1994; Ghosh, Greenberg, 1995; Michaelis, 1998]. Киназы и фосфатазы действуют на множество субстратов, в том числе другие киназы и фосфатазы, рецепторы и структурные белки [Teyler et al., 1994].
Значительное число работ посвящено участию Са2+-зависимых протеинкиназ в формировании длительных пластических перестроек глутаматергической синаптической передачи в гиппокампе [Malinow et al., 1988; Nicoll et al., 1988; Malenka etal., 1989; Linden, Routtenberg, 1989; Teyler etal., 1994]. Увеличение активности протеинкиназы С обнаружено на ранних (до 5 мин) стадиях после индукции длительной потенциации [Alker et al., 1986; Huang et al., 1992]. Классическое обусловливание сопровождается активацией протеинкиназы С в нейронах поля СА1 [Bank et al., 1988]. Протеинкиназа С имеет, по-видимому отношение и к другим видам обучения [Olds et al., 1989]. Так, например, ее активность положительно коррелирует со способностью к обучению в водном лабиринте. Ингибирование кальций-кальмодулин-зависимой протеинкиназы II, протеинкиназы С и протеинкиназы А сопровождается нарушениями некоторых видов обучения и длительной потенциации в поле СА1 [Reymann et al., 1988; Malenka et al., 1989; Malinow et al., 1989; Silva et al., 1992; Ghosh, Greenberg, 1995].
Некоторые протеинкиназы фосфорилируют белки каналов, в том числе и каналы эндоплазматического ретикулума [Kostyuk, Verkhratsky, 1994], а также связанные с глутаматными [McGlade-McCulloh et al., 1993; Raymond et al., 1993; Wang etal., 1993; Ghosh, Greenberg, 1995; Michaelis, 1998], в частности NMDA-рецепторами [Tingley et al., 1993; Moon et al., 1994; Raymond et al., 1994; Wang, Salter, 1994; Lau, Huganir, 1995], усиливая их активность.
Кальций-кальмодулин-зависимая протеинкиназа фосфорилирует преимущественно АМРА-рецепторы [Tan et al., 1994; Yakel et al., 1995]. Еще одним свойством этих киназ является способность к аутофосфорилированию [Gamble, Koch, 1987; Ghosh, Greenberg, 1995; Геннис, 1997], так что они способны удерживать активное состояние и после прекращения кальциевого сигнала. Это свойство кальций-кальмодулин-зависимой протеинкиназы давало даже основание считать ее «молекулой памяти» [Ghosh, Greenberg, 1995]. Аутофосфорилирование кальций-кальмодулин-зависимой протеинкиназы в центральной нервной системе происходит при стимуляции, которая способна вызвать длительную потенциацию, в том числе и при активации NMDA-рецепторов [Ghosh, Greenberg, 1995]. Тем не менее, маловероятно, что усиление реакции по этой причине может сохраняться в течение длительного периода, который даже при самых благоприятных условиях ограничено временем жизни белка [Gamble, Koch, 1987; Shen, Meyer, 1999]. Нельзя не учитывать также тот факт, что уровень фосфорилирования мембранных белков находится под контролем не только протеинкиназ, период активации которых ограничен достаточно коротким интервалом, но и фосфатаз [Wyllie, Nicoll, 1994; Teyler et al., 1994; Wang et al., 1994; Vissel et al., 2001]. Последние способны дефосфорилировать мембранные белки после восстановления внутриклеточного баланса до состояния покоя. Все эти процессы замечательно приспособлены для формирования временного паттерна ответа на внешний раздражитель.
В то же время, биологические свойства мембран находятся под контролем рецепторов, связанных с аденилатциклазами и фосфатидилинозитольной системой [Wang et al., 1991; Schoepp, Conn, 1993; Raman et al., 1996]. Это не только взаимодействие, но и взаимная регуляция, поскольку кальций-кальмодулин-зависимые протеинкиназы в свою очередь модулируют работу аденилатциклаз [Ghosh, Greenberg, 1995]. Протеинкиназа С - это ключевой фермент системы передачи сигнала, запускаемого быстрым расщеплением фосфатидилинозитолов. Этот фермент локализован преимущественно в цитозоле до момента появления там диацилглицерола и Са2+, после чего он связывается с плазматической мембраной и активируется [Wolf et al., 1986; Shearman etal., 1988; Геннис, 1997; Michaelis, 1998]. Агонисты, стимулирующие аденилатциклазы, активируют сАМР-зависимую протенкиназу (протеинкиназу А). Эта протеинкиназа способна фосфорилировать не только АМРА-, но и NMDA-рецепторы, усиливая NMDA-зависимый ток. Это означает, что активация рецепторов, связанных с фосфатидилинозитольной системой способна потенциировать функции NMDA-рецепторов во время обучения или длительной потенциации.
Вместе с тем, фосфорилирование рецепторов протенкиназами С и А играет решающую роль в десенсибилизации и интернализации фосфорилированного рецептора путем эндоцитоза [Геннис, 1997; Gereau, Heinemann, 1998; Snyder et al., 2001]. Обнаружено, что высокая концентрация глутамата приводит к интернализации АМРА-, но не NMDA-рецепторов [Craig, Boudin, 2001]. Тот факт, что длительная потенциация, а также сопровождающее ее увеличение активности АМРА рецепторов [Davies et al., 1989], подавляется при ингибировании протеинкиназы С [Lovinger et al., 1987; Reymann et al., 1988; Malenka et al., 1989; Malinow et al., 1989; Huang et al., 1992], как будто, не дает основания подвергать сомнению гипотезу о том, что фосфорилирование АМРА рецепторов может лежать в основе увеличения синаптических реакций [Gamble, Koch, 1987]. Тем не менее, нельзя исключить, что эти два процесса протекают параллельно, хотя могут иметь и общую причину. Более того, интенсивная синаптическая «бомбардировка», вполне вероятно, может приводить к естественной в этих условиях десенситизации рецепторов [Trussell, Fischbach, 1989; Zorumski et al., 1996; Геннис, 1997] и, соответственно, к снижению клеточных реакций, что, кстати, часто наблюдается сразу после частотной стимуляции синаптических входов, по времени совпадая с фазой активации протеинкиназы С. Не исключено, что развитие длительной потенциации лишь маскирует эту фазу клеточной реакции. Тот факт, что ингибирование протеинкиназы С не оказывает влияния на фоновую синаптическую активность [Lovingeret al., 1987; Reymann et al., 1988; Malinow et al., 1989; Malenka et al., 1989], свидетельствует о более сложных взаимоотношениях между биохимическими последствиями частотной стимуляции.
Роль серотонина в морфо-функциональных перестройках афферентных связей гиппокампа
Число серотонин-содержащих аксонов в высших отделах ЦНС в среднем на порядок больше, чем норадренергических [Beaudet, Descarries, 1978]. Часть аксонов серотонинергических нейронов формируют «классические» (по морфологическим признакам) синапсы [Milner, Veznedaroglu, 1993]. Однако большая часть окончаний остается в виде варикозетов [Maeda et al., 1989]. Те и другие окончания могут быть образованы одним и тем же волокном [Steinbusch, 1981; Кратин, Сотниченко, 1987]. В гиппокампе наибольшая плотность серотонин-содержащих терминалей обнаруживается в области ветвления апикальных дендритов пирамидных нейронов поля СА1 и Зубчатой фасции [Moore, Halaris, 1975]. Серотонинергические волокна иннервируют также тормозные интернейроны поля СА1, образуя до 40 синаптических контактов на одной клетке.
Характерной особенностью серотонинергической системы является высокая степень гетерогенности рецепторов [Саченко, Хоревин, 2001]. В настоящее время идентифицировано 14 подтипов 5-НТ рецепторов, по крайней мере, 8 из них обнаружены в гиппокампе. Эти рецепторы реализуют свои эффекты через разные системы вторичных посредников. Большинство серотониновых рецепторов относятся к метаботропным и опосредуется G-белками [Узбеков, Пигарева, 1979; Andrade, Nicoll, 1987; Harrington etal., 1988; Emeritetal., 1990; Саченко, Хоревин, 2001]. 5HTi рецепторы тормозят активность аденилатциклазы и угнетают синтез цАМФ [Daly, 1976; Marsden et al., 1989]. 5HT2 рецепторы повышают активность фосфолипазы, а 5НТ4, 5НТб и 5НЇ7 рецепторы активируют аденилатциклазу [Barbaccia et al., 1983]. В отличие от других серотониновых рецепторов, 5НТ3 рецепторы относятся к ионотропным. 5HTIA и 5НТг рецепторы расположены преимущественно на дендритах, а бНТ в рецепторы - на аксонных терминалях. 5НТІА рецепторы обнаружены и на астроцитах [Whitaker-Azmitia et al., 1993]. 5HTi рецепторы индуцируют медленную гиперполяризацию, тогда как 5НТ2,5НТ3 и 5НТ4 рецепторы индуцируют медленную деполяризацию [Саченко, Хоревин, 2001].
Активация 5НТІА рецепторов в нейронах гиппокампа приводит к гиперполяризации, в основе которой лежит увеличение проводимости для ионов калия [Jansen, 1980; Colino, Halliwell, 1987; Segal, 1989], к снижению спонтанной [Segal, 1975] и вызванной активности [Jansen, 1980; Beck, Goldfarb, 1985]. Немаловажное значение для этого имеет внутриклеточное содержание Са2+ [Segal, 1990]. Имеются основания полагать, что именно с активацией 5НТ1А рецепторов на астроцитах, с последующим увеличением S100, связано трофическое влияние серотонина [Riad et al., 1994; Whitaker-Azmitia, Azmitia, 1994; Dinopoulos et al., 1997; Wilson et al., 1998]. Уменьшение плотности синаптических контактов [Chen et al., 1994] и белка S100p наблюдается после снижения содержания серотонина, даже локального, например, в гиппокампе, но не после снижения норадреналина [Haring et al., 1993; Azmitia et al., 1995; Wilson et al., 1998].
5HTIB рецепторы выявлены на пресинаптических аксонных терминалях глутаматергических, холинергических и серотонинергических нейронов [Marsden et al., 1989]. Их активация приводит к снижению высвобождения медиатора [Maura et al., 1986].
Методом гибридизации выявлены клетки, содержащие мРНК, кодирующую белок 5-HTIC рецептора. К ним относятся пирамидные нейроны вентральных отделов СА1, СА2 и САЗ гиппокампа, а также дофамин-, норадреналин- и серотонинсодержащие нейроны различных подкорковых ядер и структур [Molineaux et а!., 1989]. Связь этих рецепторов с обменом инозитоллипидов дает некоторые основания отнести их к типу 5НТ2 [Саченко, Хоревин, 2001].
5НТ2 рецепторы регулируют активность фосфолипазы и уровень инозитолфосфата [Marsden et al., 1989]. Результатом активации этих рецепторов является медленно развивающаяся деполяризация, за счет блокирования потенциалзависимого калиевого тока, и уменьшение следовой гиперполяризации [Colino, Halliwell, 1987; Segal, 1989], за счет блокирования кальций-зависимого калиевого тока. Вследствие этого увеличивается возбудимость нейронов и длительность спайковых реакций [Shen, Andrade, 1996].
5НТз рецепторы являются единственными серотониновыми рецепторами, непосредственно связанными с ионными каналами [Derkach et al., 1989; Jackson, Yakel, 1995]. Активация этих рецепторов приводит к развитию быстрой деполяризации [Derkach et al., 1989; Maricq et al., 1991]. В гиппокампе 5HT3 рецепторы выявлены на тормозных интернейронах [Acsady et al., 1993; Tecott et al., 1993; McMahon, Kauer, 1997]. Увеличение частоты спонтанных ТПСП при их активации [Ropert, Guy, 1990; McMahon, Kauer, 1997] обеспечивает постоянный тормозный фон в нейронах поля СА1, затрудняя распространение афферентного сигнала [Maccaferri, McBain, 1995]. Важным свойством этих рецепторов является их инактивация при больших значениях мембранного потенциала [McMahon, Kauer, 1997]. Это означает, что тормозный контроль может устраняться при совпадении афферентного сигнала из энторинальной коры с активацией септальных входов, гиперполяризующих тормозные интернейроны.
В гиппокампе и других лимбических структурах выявлены также 5НЇ4,5НТб и 5НТ7 рецепторы, которые положительно связаны с аденилатциклазой и стимулируют образование цАМФ [Саченко, Хоревин, 2001]. Под влиянием серотонина в присутствии антагонистов 5НТ1А рецепторов в нейронах гиппокампа наблюдается медленная деполяризация [Andrade, Chaput, 1991]. Это вероятно и определяет двойственность эффектов серотонина [Krnjevic, Phillis, 1963; Assaf, Miller, 1978; Finch, Babb, 1981; Отмахов, 1982; Кожедуб, 1985; Andrade, Nicoll, 1987], хотя первичной реакцией является преимущественно тормозная [Segal, 1975; Jahnsen, 1980; Beck, Goldfarb, 1985; Clarke et al., 1987].
В настоящее время нет достаточных оснований полагать, что серотонин, в отличие от норадреналина, оказывает существенное влияние на такие пластические процессы как длительная потенциация или длительная депрессия [Stanton, Sarvey, 1985]. С другой стороны, он мог бы действовать опосредовано через норадренергическую и другие медиаторные системы, препятствуя увеличению цАМФ при активации этих входов. И наоборот, снижение содержания серотонина при ряде воздействий увеличивает чувствительность р-адренорецепторов и образование цАМФ [Stockmeier et al., 1985]. Серотонин участвует также в регуляции секреции ацетилхолина [Maura et al., 1989; Consolo et al., 1994; Steckler, Sahgal, 1995; Erb et al., 1997] и норадреналина [Bobker, Williams, 1989], активирует синтез нейропептидов.
