Содержание к диссертации
Введение
1. Нервно-мышечный аппарат моллюсков 10
1.1. Типы мышц и мышечных волокон моллюсков 10
1.2. Морфология и ультраструктура нервно-мышечного синапса моллюсков 12
1.3. Физиологические свойства мышечных волокон моллюсков 15
1.4. Медиаторы нервной и мышечной тканей моллюсков 18
1.4.1. Ацетилхолин 18
1.4.2. Серотонин 20
1.4.3. Октопамин 23
1.4.4. Дофамин 26
1.4.5. Нейропептиды семейства FMRFaMHfla 28
1.4.6. Гамма-аминомасляная кислота 30
1.4.7. Глутаминовая кислота 31
1.5. Нейронные механизмы мышечных сокращений моллюсков 34
1.6. Особенности строения мускулатуры lymnaea stagnaus (l.) 36
1.7. Поведенческий репертуар дорсальной продольной мускулатуры 38
1.7.1. Оборонительный рефлекс 38
1.7.2. Локомоция 40
1.7.3. Пищевое и половое поведение 41
2. Материал и методика 42
2.1. Объект исследования 42
2.2. Исследование нейрональной организации управления и топографии иннервации ДПМ 42
2.2.1. Исследование топографии нейронов, посылающих свои аксоны в нижний и верхний цсрвикальные нервы 42
2.2.2. Исследование топографии иннервации ДПМ 44
2.3. Иммунохимическое маркирование медиатор-специфичных нервных элементов ДПМ и ЦНС прудовика 46
2.3.1. Иммуногистохимическое выявление серотонина 46
2.3.2. Иммуногистохимическое выявление нейропептидов семейства FMRF-амида 49
2.3.3. Иммуногистохимическое выявление холинацетилтрансферазы 49
2.3.4. Иммуногистохимическое выявление ГАМК 50
2.3.5. Иммуногистохимическое выявление глутаминовой кислоты 53
2.3.6. Иммуногистохимическое выявление октопамина 54
2.3.7. Двойное мечение 55
2.4. Гистохимическое выявление присутствия ацетилхолинэстеразы В ДМП 56
2.5. Электронно-микроскопические исследования 58
2.6. Исследования физиологии и фармакологии нервно-мышечной передачи 58
2.6.1. Препарат 58
2.6.2. Раздражение нерва и регистрация сокращений мышцы 59
2.6.3 Состав физиологических растворов 60
2.6.4.Исследуемые вещества 60
2.6.5. Ход экспериментов 61
2.7. Электрофизиологические исследования 63
2.8. Статистическая оценка 64
2.9. Объем экспериментального материала 64
3. Результаты исследования 65
3.1. Неирональная организация управления и иннервация ДПМ 65
3.1.1. Состав волокон нижнего цервикального нерва и структура нервно-мышечного соединения 65
3.1.2. Нейрональная организация управления ДПМ 69
3.1.3. Топография иннервации ДПМ 77
3.2. Идентификация неиротрансмиттеров в нервно-мышечном соединении 83
3.2.1. Серотонин-иммунореактивные нервные элементы в составе ЦНС и ДПМ 83
3.2.2. FMRF-амид иммунореактивные нервные элементы в составе ЦНС и ДПМ 85
3.2.4. ГАМК-иммунореактивные нервные элементы в составе ЦНС и ДПМ 91
3.2.5. Иммунореактивность волокон нижнего цервикального нерва к глутаминовой кислоте 94
3.2.6. Иммунореактивность волокон нижнего цервикального нерва к холинацетилтрансферазе 94
3.2.7. Иммунореактивность нервных элементов в составе ЦНС к октопамину 94
3.3. Локализация ацетилхолинэстеразы в нервных элементах ДМП 97
3.4. Физиологические характеристики сокращений ДПМ 101
3.5. Влияние химических веществ на амплитуду мышечных сокращений, вызванных раздражением нерва 101
3.5.1. Блокирующее влияние ионов магния и кобальта на вызванные сокращения 101
3.5.2. Влияние серотонина и его антагонистов на вызванные сокращения 104
3.5.3. Влияние ацетилхолина и его антагонистов на вызванные сокращения 108
3.5.4. Влияние октопамина на вызванные сокращения 111
3.5.5. Влияние глутаминовой кислоты на вызванные сокращения 112
3.5.6. Влияние ГАМК на вызванные сокращения 115
3.5.6. Влияние FMRFaMHfla на вызванные сокращения 117
3.5.7. Исследование влияния медиаторов на сокращения мышцы, вызванные прямой стимуляцией 117
3.6. Электрофизиологические корреляты моторного пути нейрона Rpea4 119
4. Обсуждение результатов 121
Выводы 140
Список литературы 142
- Морфология и ультраструктура нервно-мышечного синапса моллюсков
- Особенности строения мускулатуры lymnaea stagnaus (l.)
- Гистохимическое выявление присутствия ацетилхолинэстеразы В ДМП
- Иммунореактивность нервных элементов в составе ЦНС к октопамину
Введение к работе
Исследования последних десятилетий позволили распространить на нервно-мышечные взаимоотношения принцип множественности химических сигналов, отражающий многообразие медиаторных систем мозга. У позвоночных животных химический плюрализм характерен, главным образом, для механизмов управления гладкой мускулатурой, иннервация которой может осуществляться нейронами, выделяющими различные нейротрансмиттеры или их сочетания (Holzer, 1989; Lecci et al., 2002; Ноздрачев, 1996). Недавние исследования показали присутствие и возможность выделения в синаптическую щель нескольких веществ также и из двигательных окончаний позвоночных (Маломуж и др., 2001). Регуляция сокращений мышц большинства исследованных в этом отношении беспозвоночных животных осуществляется по полинейрональному и полифункциональному механизму нейронами, выделяющими различные медиаторные вещества. Спектр соединений, предполагаемых для этой функции, включает ацетилхолин, группы моноаминов (серотонин, октопамин), аминокислот (глутаминовая и ГАМК) и нейропептидов (например, FMRF-амид или SCP). Некоторые из них выступают как ко-медиаторы, характеризующиеся совместной локализацией и высвобождением, а также общей клеткой-мишенью при выполнении одной и той же моторной программы. В другом случае медиаторы выделяются разными нервными клетками и оказывают на иннервируемый орган функционально различное действие. И, наконец, модуляторы изменяют нервно-мышечную передачу по пре- или постсинаптическому механизму.
Исследования нервно-мышечной передачи у моллюсков весьма немногочисленны, хотя прогресс в этом направлении представляется чрезвычайно важным с позиций сравнительной и эволюционной физиологии. Сдерживающим фактором отчасти является то обстоятельство, что мышечная система моллюсков представлена большим скоплением мышечных пучков, расположенных беспорядочно. Лишь немногие мышцы моллюсков (такие как
7 аддукторы створок, ретракторы биссуса, мышцы сифонов и глотки, колумеллярная мускулатура, сердце) представляют собой дискретные единицы.
Фармакологические исследования некоторых из этих мышц выявили разнообразие химической природы медиаторов в периферических синапсах у моллюсков (Messenger et al., 1997; Zoran et al., 1989; Wright, Huddart, 2002; Keating, Lloyd, 1999; Wiens, Brownell, 1995). Даже в пределах одного органа мышечные пучки могут контролироваться различными веществами или их сочетаниями (Messenger et al., 1997; Keating, Lloyd, 1999; Fox, Lloyd, 1999).
Химический механизм синапсов двигательных мышц брюхоногих также изучен мало, хотя известно о важной роли серотонинергичной иннервации в регуляции локомоции этих животных (Сашке, 1988; Syed et al., 1988; Павлова, 1997; Pavlova, 2001).
Дорсальная продольная мышца (ДПМ) прудовика представляет собой хорошо дифференцированный парный орган, который может служить достаточно удобным объектом для изучения структурных и физиологических основ нервно-мышечной передачи у брюхоногих моллюсков. Настоящая работа направлена на выявление деталей нейрональной организации управления и выяснения возможных химических механизмов регуляции сокращений дорсальной продольной мышцы прудовика L. stagnalis. В качестве отправной точки послужила гипотеза о «трансмиттерзависимом» поведении Д.А. Сахарова (1990). Химическая природа передатчика может быть фактором, интегрирующим выходную активность целостной многоклеточной системы. У просто устроенных организмов речь может идти о реакции всей нервной системы на определенную медиаторную ситуацию, когда в общем ответе можно различить определенный фрагмент поведенческого репертуара.
Дорсальная продольная мускулатура прудовика вовлечена в осуществление нескольких форм поведения: оборонительное поведение (Cook, 1975) и локомоция (Syed, Winlow, 1989; Winlow, Haydon, 1986) (основной компонент) и различные фазы пищевого (Elliot, Susswem, 2002) и полового поведения (Hermann et al., 1994) (дополнительный компонент). Так как каждый тип
8 поведения имеет различное функциональное значение для животного, а моторные требования для каждого из типов поведения различны, то можно предположить, что такая «поведенческая полифункциональность» этой мышцы может достигаться большим набором нейротрансмиттеров, контролирующих и регулирующих сокращения дорсальной продольной мышцы L. stagnalis.
Таким образом, целью экспериментальной части данной работы было определить достоверность предположения о множественном химическом контроле сокращений дорсальной продольной мускулатуры прудовика Lymnaea stagnalis (L.) в связи с участием последней в нескольких, функционально различных, формах поведения. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1) Изучить характер и режим вызванных сокращений дорсальной продольной мускулатуры, осуществляющей втягивание тела L, stagnalis в раковину;
Исследовать нейрональную организацию управления и топографию иннервации дорсальной продольной мышцы L. stagnalis. Выявить особенности ультраструктурной организации нервно-мышечного соединения;
Исследовать влияние повышения содержания в физиологическом растворе ионов магния и кобальта на амплитуду мышечных сокращений, вызванных непрямой стимуляцией с целью получения основания для суждений о природе нервно-мышечной передачи;
Установить присутствие иммунореактивности к нейротрансмиттерам в нервно-мышечном соединении и идентифицировать соответствующие нейроны в ганглиях центральной нервной системы;
Исследовать влияние аппликации растворов ряда нейротрансмиттеров и их антагонистов на вызванные мышечные сокращения с целью обнаружения присутствия химически-зависимых паттернов регуляции сокращения.
9 НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые был проведен комплексный анализ морфологических, ультраструктурных, физиологических и иммунопатологических особенностей нейрональной организации управления
ДПМ прудовика L. stagnalis. Нами впервые было обнаружено присутствие сразу нескольких химических веществ в нервно-мышечном соединении прудовика. Результаты работы в целом позволили заключить, что * поведенческая полифункциональность этой мышцы может достигаться набором из нескольких медиаторных систем.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ: Показана возможность применения антеро- и ретроградного внутриклеточного транспорта флуоресцентного декстрана (гидрофильного полисахарида, связанного с различными флуоресцентными метками) в качестве удобного маркера нервных элементов гастропод. В то же время показана возможность применения у моллюсков сразу нескольких типов красителей, обычно используемых при ? исследовании анатомии нервной системы беспозвоночных и позвоночных животных. При этом анализ различных паттернов иннервации дает возможность предложить красители типа «биотин-авидин» в качестве наиболее идеального маркера для выявления топографии нейронов с длинными аксонами. Исследованная модель «полифункциональной регуляции» мышечных сокращений позволит продвинуться в понимании того, как сложные поведенческие акты могут осуществляться в мозге высших животных и человека.
Морфология и ультраструктура нервно-мышечного синапса моллюсков
Тип моллюсков, включающий более ста тысяч видов, представляет собой обширнейшую группу животных, уступающую по количеству видов только типу членистоногих (Скоробовичук, 1974). Для многих моллюсков характерно наличие раковины, что в значительной степени определяет строение тела животных, в частности расположение и строение мускулатуры. (Hoyle, 1964). Мышцы раковины включают так называемую дорсовентральную мускулатуру или педальные ретракторы, различные аддукторные системы (в основном у двустворчатых моллюсков) и мантийные ретракторные системы в различных классах типа. Моллюскам свойственны разнообразные формы мышечной активности: устойчивые тонические сокращения при запирании раковины, слитая медленная локомоция при ползании и внезапные резкие сокращения при плавании (Скоробовичук, 1974),
Классификация мышечных волокон моллюсков основана на особенностях их строения, различимых в световой микроскоп. Они могут быть разделены на 4 типа: поперечнополосатые, косоисчерченные (правильные и неправильные) и гладкие мышечные волокна. У многих изученных брюхоногих моллюсков поперечнополосатые мышечные волокна были обнаружены в сердце и в буккальной массе (Неуег et al., 1973; Nisbet, Plummer, 1968). Мышечные волокна, близкие по структуре к поперечнополосатым, обнаруживаются также в быстрой части аддуктора Lima scarba, в парусе Pecten varius, в респираторных мышечных септах Cuspidaria arctica. У некоторых видов брюхоногих моллюсков поперечнополосатыми являются мышцы терки и ретракторы щупалец. У Pteropoda (планктонных плавающих брюхоногих) мышцы "крыльев" могут быть либо спиральными, либо поперечнополосатыми (Скоробовичук, 1974). У Lymnaea stagnalis такие мышечные волокна были обнаружены только в сердце (в предсердии, желудочке и аорте) (Heyer et al., 1973). При наблюдении в световой микроскоп и при использовании дифракционного метода обнаруживается некоторое сходство этого типа мышечных волокон с поперечнополосатыми мышцами позвоночных (Hoyle, 1968). Однако у ряда моллюсков (главным образом аддукторы пластинчатожаберных) встречается другой, менее четкий тип поперечной полосатости волокон. Волокна этой группы иногда называют вернъеровидными. Главное, что отличает эти волокна от истинных поперечнополосатых - это строение и расположение Z-линии. Она состоит из отдельных фрагментов (плотных телец), и может быть расположена более косо по отношению к продольной оси волокна. Важно, что наличие поперечной полосатости коррелирует со способностью мышц к осуществлению быстрых сокращений. Примером такого типа мышц может служить фазный аддуктор Anomia squamuia (Nicaise, Amsellem 1983). Косоисчерченные мышечные волокна по скорости сокращения несколько уступают поперечнополосатым и встречаются в фазных аддукторах ряда представителей двустворчатых моллюсков (устрицы, беззубки и др.) (Лапицкий, 1998). Примером могут служить также фазные аддукторы, например Crassostrea gigas, Anodonta cygnea, Cyprina islandica, Serripes groenlandicus (Nicaise, Amsellem 1983). Мышечные волокна буккальной массы и глотки L. stagnalis также относят к косонсчерченньш (Plesch, 1911 а). В этой группе объединены мышцы, относящиеся, по крайней мере, к двум разным типам. К первому типу относятся мышцы, волокна которых имеют истинную косую исчерченность, обусловленную смещением толстых протофибрилл друг относительно друга. Ко второму типу относятся волокна, являющиеся по сути гладкими, так как их миофиламенты не организованы в диски, а впечатление косой исчерченности создается за счет спирального расположения фибрилл по периферии волокна. Такой тип волокон характерен для многих мышц головоногих моллюсков (Скоробовичук, 1974; Kier, Curtin, 2002). Особый тип мышечных волокон был обнаружен у двустворчатых моллюсков - это мышцы с двойной косой исчерченностью. Их основной особенностью является медленное сокращение и длительное пребывание в сокращенном состоянии (Неуег et al., 1973). Наиболее распространенным типом мышечных волокон для всех моллюсков являются гладкие волокна (Скоробовичук, 1974). Из них состоит вся стенка тела и большинство мускулатуры внутренних органов. Эти волокна были обнаружены, в частности, у L. stagnalis, Helix pomatia, Achatina fulica и др. Для этого типа волокон характерно высокое содержание белка парамиозина (белка идентичного тропомиозину А). Причем функционально гладкие мышцы, содержащие около 32% парамиозина, как правило, самые медленные из мышц моллюсков, обычно способные к очень длительному удержанию напряжения (белые части аддукторов Mytilus edulis, Ostrea edulis, Pinna miricata и др.). Интересно, что количественные различия содержания миофиламентов, митохондрий и цистерн саркоплазматического ретикулума позволяют дополнительно выделять несколько типов гладкой мускулатуры у гастропод. Все перечисленные выше типы мышечных волокон представляют собой вытянутые клетки, суженные к концу. Ядро расположено либо в центре (у крупных клеток), либо ближе к боковой стенке (у клеток меньшего размера). Диаметр мышечных клеток моллюсков варьирует от 1,5 до 15 мкм (Неуег et al., 1973).
Особенности строения мускулатуры lymnaea stagnaus (l.)
Контроль мышечных сокращений у моллюсков бывает моно - и поли -нейронным. Например, мышечные волокна колумеллярной мышцы Н. trivolvis иннервированы одним возбуждающим нейроном (Kater et al., 1971). Но в то же время циркулярная мышца кальмара Loligo sp. иннервируется двумя типами возбуждающих нейронов, каждый из которых может содержать различные нейротрансмиттеры. Одни вызывают медленные сокращения, другие - быстрые. Сходную иннервацию получают ретрактор мантии и верхний аддуктор створки раковины моллюска Муа. Полинейрональная иннервация характерна и для супралатерального ретрактора радулы P. comcusy где сокращения мышцы контролируются комплексом из 8 мотонейронов (Brace, Quicke, 1980). Индивидуальные мышечные волокна могут быть иннервированьт более чем двумя возбуждающими нейронами. Например, одно мышечное волокно в мышце глотки аплизии генерирует возбуждающий потенциал концевой пластинки (ПКП) в ответ на стимуляцию двух мотонейронов (причем один холинергический, а другой нет). Сходные данные были получены о мышце переднего ретрактора биссуса мидии (Kater et al., 1971). Однако мышечные волокна моллюсков электрически связаны и, возможно, сигналы, регистрируемые в одном мышечном волокне, отражают ответы, вызванные в соседних волокнах (Muneoka, Twarog , 1983). При изучении нервномышечных препаратов ряда моллюсков обнаружено существование периферического тормозного механизма. К примеру, в нервно-мышечном соединении пластинчатожаберного моллюска М. edulis непрямая электрическая стимуляция приводит к снижению тонуса гладкой мускулатуры (Banks, 1975). Механизм периферического торможения предполагается для запирательной мышцы P. various и мышцы ноги Н. pomatia (цит. по Скоробовичук, 1974). Тормозные ПКП в ответ на стимуляцию мотонейрона удалось зарегистрировать в мышечных клетках буккальной массы глотки А. califomica (Kater et al., 1971; Banks, 1975). К. Уайс с коллегами (Weiss et al., 1975) установил, что парные серотонинергичные нейроны церебральных ганглиев A. califomica контролируют буккальную мускулатуру как через моносинаптические контакты с мотонейронами буккальных ганглиев, так и образуя синапсы непосредственно на мышечных клетках. Не менее важен и интересен нервно-гум оральный контроль работы миокарда сердца моллюсков. Отдельные нейроны, непосредственно связанные с сердцем, были обнаружены в абдоминальном ганглии аплизии (Журавлев, 1999). В частности, в абдоминальном ганглии у аплизии были найдены два возбуждающих и два тормозных кардиорегулирующих мотонейрона. На данный момент, в сети таких нейронов аплизии насчитывают более 10 тысяч мотонейронов. Исследования на полуинтактном препарате улитки рода Helix показали, что более 35 % центральных нейронов отвечают на химическую и механическую стимуляцию миокарда. Дальнейшие исследования позволили выделить сеть из 22 нейронов, участвующих в регуляции сокращений миокарда. Тормозные сердечные рефлексы сохраняются и после обрыва интестинального нерва вблизи ганглия. Было высказано предположение, что в осуществлении таких рефлексов принимают участие периферические нейроны, расположенные по ходу нерва. У гигантской африканской улитки рода Achat ina в висцеральном, правом париетальном и церебральном ганглиях было обнаружено около семи нейронов, вызывающих положительный хронотропный эффект в сердце моллюска (Журавлев, 1999). Анатомические и гистологические исследования стенки тела L. stagnalis позволили выделить 6 хорошо выраженных групп мышц: 1) круговая мускулатура; 2) диагональная мускулатура; 3) дорсальная продольная мускулатура; 4) нижний щупальцевый ретрактор; 5) колумеллярная мускулатура; 6) горизонтальная мускулатура ноги (Plesch et al., 1975; Plesch, 1977a). Мышечные волокна круговой мускулатуры обнаружены в дорсальной и вентральной части ноги, в верхней части столбика, а также в губах и в мантии. Эта группа мышц образует тонкие пучки, лежащие сразу под эпителием. Волокна диагональной мускулатуры расположены по внутренней стороне края мантии, вокруг столбика, а также проходят через всю дорсальную и латеральную часть ноги, включая губы и щупальца. Дорсальная продольная мускулатура обнаруживается в верхней части ноги, в мантии, в ткани легких. В той части стенки тела, которая участвует в движении, этот тип мышц развит особенно хорошо. Отдельные мышечные волокна могут быть собраны в толстые пучки. Комплекс мышц под названием "нижний щупальцевый ретрактор" представляет собой небольшую систему, ограниченную вентральной частью щупалец, мышечные волокна которой идут вдоль щупалец мелкими пучками. Колумеллярная мускулатура развита особенно хорошо. Она начинается как толстый ствол мышечных волокон, идущий под мантийным эпителием от начала головной части туловища вниз к ноге. С точки зрения гистологии, эта система необычна тем, что мышечные волокна очень большие, и между ними находится много соединительной ткани. Кроме дорсальной продольной и колумеллярной мускулатур, подошва ноги имеет и дополнительную мышечную систему - горизонтальную мускулатуру ноги. Она состоит из индивидуальных пучков мышечных волокон, которые простираются в горизонтальном направлении. Слои наружной круговой и внутренней дорсальной продольной мускулатуры являются общими для всех видов моллюсков. В отличие от них, диагональная мускулатура была обнаружена только у L. stagnalis, Н. pomatia, Aplysia californica (Plesch et al., 1975). Причем интересно, что небольшая часть колумеллярной мускулатуры у Helix сходна в строении и расположении с дорсальной продольной мышечной системой L. stagnalis. На основании этого многие ученые считают эти две системы гомологами. Кроме мускулатуры стенки тела существует и мускулатура внутренних органов. К ней относят мышцы буккальной массы, комплекса пениса, а также мускулатуру сердца и аорты. Буккальная мускулатура - это система из сорока шести мышечных пучков, которые служат основой для работы ротового аппарата (одонтофор и радула). Сюда же входят и мышцы глотки, представляющие собой два больших пучка мышечных волокон, каждый из которых состоит из трех дорсальных продольных и трех круговых тяжей. Мышцы комплекса пениса образуют круговой и дорсальный продольный пучки, которые входят в мышечную стенку за правым щупальцем. Вероятно, они помогают высвобождению пениса из тела во время акта копуляции. Внешняя сторона мускулатуры сердца представлена круговыми мышечными волокнами, а внутренняя - продольными дорсальными. Аорта также имеет в своем составе мышечные волокна, представляющие собой тонкую стенку из круговыьтх пучков. Сократительный аппарат мышечных клеток L. stagnalis состоит из толстых, миозин-парамиозиновых филаментов и тонких, актиновых, филаментов. Сарколемма мышечного волокна образует впячивания, которые формируют «суб-поверхностную» тубулярную систему, напоминающую систему Т-трубочек позвоночных. С тубулярной системой граничат диады cap ко плазматического ретикулума (Plesch, 1977а).
Гистохимическое выявление присутствия ацетилхолинэстеразы В ДМП
Локализация ацетилхолинэстеразы определялась гистохимическим методом с использованием световой микроскопии. В качестве субстрата гистохимической реакции применяли ацетилтиохолин Йодид. Локализацию фермента определяли на срезах мышцы, предварительно фиксированных в 4% растворе параформальдегида (реакция Жеребцова) (Мандельштам, 1983). После проведения гистохимической реакции в местах расположения АХЭ образовывается осадок тиохолината меди, который окрашивается в коричневый цвет при контакте ткани с сульфидом аммония. Окрашивание выполняли по прописи, модифицированной для нервном ышеч ного препарата прудовика, как в работе М. Штенгл и др. (Stengl et al., 1990). ДПМ, включая нижний цервикальный нерв, выделяли в охлажденном до 4 С фиксаторе (4% раствор параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4). Затем фиксировали в течение суток при температуре 4 С. После фиксации препараты промывали в 0,1 М растворе фосфатного буфера (2 смены по 10 минут). Затем заливали в 5% раствор агарозы (Biomol, Hamburg, Germany). После чего, материал ориентировали относительно сагиттальной, фронтальной или горизонтальной плоскостей, и готовили срезы толщиной 70 мкм на микротоме Leica Polycut Е.(Germany). После промывки в 0,1 М фосфатном буфере (2 смены по 15 минут) и в буфере с добавлением тритона-Х 100 до концентрации 1% (4 смены по 15 минут) срезы выдерживали в 0,1 М Трис-малеат буфере (Trizma Maleate buffer, Sigma Co.) в течение 10 минут (рН 6,0). Затем материал инкубировали в растворе Трис-малеат буфера с добавлением 10 мг ацетилтиохолина йодида (Sigma Co.), 100 мМ цитрата натрия, 30 мМ сульфата меди и 5 мМ калия ферроцианида. Инкубацию проводили в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. После появления АХЭ- специфически - коричневого окрашивания реакцию прерывали промыванием в 0,1 М Трис-малеат буфере (3 серии по 10 минут). После окончательной промывки в фосфатном буфере (3 раза по 15 минут) препараты заключали в глицерол (разведенный 1:1 на фосфатном буфере). Края покровных стекол герметизировали лаком. Использовали стандартный метод трансмиссионной электронной микроскопии. Фиксацию материала осуществляли в два этапа. Для префиксации использовали 2,5% глютаральдегид на 0,05 М Na-какодилатном буфере (рН 7,4). Префиксацию проводили в течение 2 часов при температуре 4 С.
Постфиксацию после быстрой отмывки глютарового фиксатора в нескольких порциях 0,1 М Na-какодилатного буфера осуществляли в течение 1 часа при комнатной температуре в 2% растворе четырехокиси осмия (OsCXt) на 0,05 М Na-какодилатном буфере, рН 7,4. Материал обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и в пропиленоксиде (Merc), а затем заливали в аралдид (Serva). Часть материала, в виде срезов толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим и использовали для светооптического изучения, а большую часть материала нарезали на ультратонкие срезы 40-60 нм (ультрамикротомом), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Готовые препараты просматривали на электронном микроскопе (Zeiss Carl № 902, transmission electron microscope).
Препарат состоял из ноги и краев мантии моллюска. При удалении висцеральной части тела и окологлоточного кольца ганглиев, нижний цервикальный нерв, иннервирующий ДПМ, оставляли на максимально возможную длину.
Исследования производили в экспериментальной ванночке объемом около 4 мл, изготовленной из органического стекла (см. приложение). Отведение сигнала при сокращении мышцы осуществляли с помощью датчика, изготовленного из пары проволочных тензосопротивлений, наклеенных на противоположные стороны полоски гибкой пленки (Блаттнер и др., 1985). Сопротивление тензодатчика изменялось при деформации пленки, вызванной натяжением лески, прикрепленной с помощью металлического крючка к исследуемой мышце. Исходное натяжение лески устанавливали вручную винтом манипулятора. Тензосопротивления (RT) включали в схему мостика Уитстона, с которого электрический сигнал подавали на вход усилителя постоянного тока. Усилитель, изготовленный на базе микросхем К284УД1, имел два фиксированных коэффициента усиления 20 и 1000. Усиленный сигнал поступал на осциллограф С1-67 и чернильный автоматический потенциометр К-201 (Германия). Непрямую стимуляцию исследуемой мышцы осуществляли электростимулятором ЭСЛ-2 одиночными электрическими импульсами (длительность 2 мс), либо их сериями. Импульсы раздражающего напряжения подавали на хлорсеребряный электрод, вмонтированный в трубочку всасывающего электрода, диаметр стеклянного наконечника которого соответствовал диаметру стимулируемого нерва. Второй хлорсеребряный электрод помещали в физиологический раствор в экспериментальной камере. Прямую стимуляцию мышцы осуществляли электродом-присоской, наконечник которого диаметром около 0,2 мм был изготовлен из пластиковой трубочки, либо двумя медными электродами, введенными в ткань мышцы на расстоянии около 8 мм друг от друга. Параметры стимуляции: частота 0,1 сек"1, длительность импульса 2 мс, амплитуда до 5 В. Каждый сеанс раздражения состоял из пяти стимулов.
Иммунореактивность нервных элементов в составе ЦНС к октопамину
Сложность и пластичность синаптических связей в центральной и периферической нервных системах создают физический субстрат поведения. Поэтому знание медиаторов, участвующих в функционировании того или иного синапса, и механизма их действия является центральным моментом для понимания механизмов генерации поведенческих паттернов (Никколс и др., 2003). Одним из главных подходов, используемых для визуализации нейронов, которые синтезируют и высвобождают какие-либо медиаторы, является картирование их распределения в ЦНС с помощью методов гистологии или иммуногистохимии. Применение антеро- и ретроградного внутриклеточного транспорта флуоресцентного декстрана (гидрофильного полисахарида, связанного с различными флуоресцентными метками) в качестве маркера нервных элементов в последнее время получило широкое распространение (Carr et al., 1994; Kloppenburg, Hoerner; 1998; Seaver, Shankland, 2001). Краситель этого типа - декстран тетраметилродамин - обладает достаточно хорошей водной растворимостью, низкой токсичностью, относительной инертностью и показал себя подходящим маркером для быстрой идентификации нейронов беспозвоночных животных. Его применение подтвердило, что нейроны ЦНС прудовика, посылающие свои отростки в нижний и верхний цервикальные нервы, располагаются почти во всех ганглиях окологлоточного нервного кольца но, главным образом, сконцентрированы в педальных (41,5 %), плевральных (30,5 %) и церебральных (18,5 %) ганглиях. Тот факт, что в эти нервы проецируются в большинстве своем аксоны нейронов педальных и плевральных ганглиев неудивителен, т.к. указанные нервы берут свое начало именно от дорсальной или вентральной области педально-плевральной коннективы. Известно, что церебральный ганглий один из главных центров нейрональной интеграции у гастропод (цит. no Sonetti et al., 1982), поэтому окрашивание в нем нейронов также вполне объяснимо. Характерная разбросанность тел нервных клеток по ганглиям ЦНС представляет собой особенность, которая отличает сеть нейронов, участвующих в иннервации ДПМ от других подобных систем моллюсков. Роль синхронизатора электронной активности в этой широко разбросанной нейронной сети играют электрические синапсы, которыми между собой соединяются большинство клеток, и, таким образом, активация одного нейрона приводит к возбуждению других (Ferguson, Benjamin, 1991). Полученные нами карты топографии нейронов ЦНС меченых декстраном принципиально согласуются с результатами Г. Фергюсона и П. Бенжамина (Ferguson, Benjamin, 1991), где для заполнения клеток использовали раствор хлористого кобальта. В то же время, применение для ретроградного окрашивания комплекса «биотин-авидин», конъюгированного с одним из карбоциановых флуоресцентных красителей, обнаружило отличия в картах топографии, которые главным образом касались количества окрашиваемых клеток в кластерах. Известно, что некоторые широко используемые красители, такие как люцифер желтый (м.в.=457) и биоцитин (м.в.=286), обладая относительно низким молекулярным весом, могут легко диффундировать через плотные контакты между клетками. Применение таких красителей может приводить к окрашиванию не только тех нервных элементов, которые располагаются в месте введения раствора, но и других, окружающих клеток (Carr et al., 1994). Нейробиотин также имеет низкий молекулярный вес (м.в.=372). Однако по сравнению с другими маркерами такие качества нейробиотина как растворимость и способность к длительному ретро- и антероградному транспорту намного выше (Lapper, Bolam, 1991). В нашем случае, применение нейробиотина для идентификации нервных элементов ЦНС позволило выявить тела клеток диметром менее 30 мкм, которые имеют отростки в составе нижнего и верхнего цервикальных нервов, а также описать топографию нейронов церебрального и педального ганглиев. Дополнительно, использование комплекса «биотин-авидин» обнаружило преимущества при выявлении тел нейронов, которые располагаются на значительном расстоянии 123 от места выхода заполняемых красителем нервов. Мы также не исключаем возможности диффузии нейробиотина в клетки, соседствующие с окрашиваемым. Эта особенность применения нейробиотина учитывалась при составлении карт топографии, где преобладающими факторами «истинности нейрона», по отношению к окрашиваемому нерву, являлись морфология и путь его аксона. Дополнительно, вариации в форме и расположении индивидуальных нейронов могут зависеть не только от специфики применяемого красителя, но также от таких факторов как генетическая однородность особей L. stagnalis, выбранных для проведения экспериментов и стадия индивидуального развития моллюсков. Основная часть окрашиваемых клеток имеет тела относительно небольшого размера. Только клетки "А" кластера педального ганглия, задней части дорсального отдела церебрального ганглия, а также несколько нейронов плеврального и висцерального ганглиев имеют диаметр более 70 мкм. Известно, что некоторые из них выполняют функцию мотонейронов ДПМ (Ferguson, Benjamin, 1991). Исследование морфологии нейронов церебрального ганглия показало, что как типичные мотонейроны большинства гастропод (Dorsett, 1986) эти клетки имеют один крупный аксон, который берет начало от сомы. Интересен факт образования экстенсивной арборизации коллатералей аксона при прохождении последнего через область нейропиля плеврального ганглия. Возможно, такие коллатерали могут играть роль сенсорных входов для зрительных или тактильных рецепторов, стимуляция которых может приводить к возбуждению церебральных мотонейронов ДПМ и, таким образом, вызывать втягивание тела в раковину во время оборонительного рефлекса. Однако установление нейрональной геометрии остальных окрашиваемых нейронов не дает оснований для однозначной оценки их функциональной роли. Известно, что некоторые крупные нейроны моллюсков могут быть вовлечены в центральные звенья сразу нескольких рефлексов, и выполнять более чем одну функцию (Zhuravlev et al., 2001). Можно лишь сказать, что общая схема нейрональной организации указывает на возможное участие этих нейронов в 124 различных аспектах двигательного поведения моллюска, но только электрофизиологические эксперименты могли бы объяснить функцию отдельно взятой клетки.
