Содержание к диссертации
Введение
Общая характеристика работы 4
1. Обзор литературы 8
1.1. Значение белков в организме животных и методы определения их количества 8
1.2. Внешнесекреторная функция поджелудочной железы кур и её адаптация к количеству протеина в рационе и биологически активным добавкам 18
1.3. Балансирование рационов животных по уровню протеина 31
2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Метод получения чистого панкреатического сока кур 39
2.2. Методика проведения физиологических опытов 40
2.3. Методика проведения балансовых опытов . 41
2.4. Биохимические методы исследований 42
2.5. Математические методы исследований 49
3. Результаты исследований 51
3.1. Определение содержания пищевых белков, жиров и углеводов в продуктах и кормах методом ферментно-субстратного анализа 51
3.2. Физиологическое обоснование использования ферментного препарата в составе белковой добавки на основе гороха и рапса 57
3.3. Влияние лимитирующих аминокислот на экзокринную функцию поджелудочной железы кур на фоне белковых культур гороха и рапса 62
3.4. Внешнесекреторная функция поджелудочной железы кур при добавлении в рацион разного количества КБД 69
3.5. Переваримость протеина корма при использовании КБД в рационах кур
4. Обсуждение результатов исследований 89
5. Выводы 104
6. Рекомендации для практического применения 106
7. Список основной использованной литературы
- Внешнесекреторная функция поджелудочной железы кур и её адаптация к количеству протеина в рационе и биологически активным добавкам
- Методика проведения балансовых опытов
- Физиологическое обоснование использования ферментного препарата в составе белковой добавки на основе гороха и рапса
- Переваримость протеина корма при использовании КБД в рационах кур
Внешнесекреторная функция поджелудочной железы кур и её адаптация к количеству протеина в рационе и биологически активным добавкам
Протеиновая недостаточность приводит к ухудшению функций пищеварительной, выделительной, эндокринной, кроветворной и других систем организма, атрофии мышц. Особенно ухудшается работа печени и поджелудочной железы, нарушается усвоение других питательных веществ кормового рациона, что сопровождается соответствующими осложнениями, например, гиповитаминозами, остео-дистрофическими изменениями и другими заболеваниями. Снижается сопротивляемость к инфекциям, замедляются процессы выздоровления, заживление ран после операций и травм [64, 72, 76, 147, 165, 181].
Белок необходим животным и человеку как источник незаменимых и заменимых аминокислот, а значение протеина кормов определяется в основном их составом. Отсутствие в рационе любой из них приводит к гибели животного, недостаток — к низкой продуктивности и болезням [131].
Для нормального протекания процессов образования белка в растущем организме, восстановления белков тканей взрослого животного, в поступающем с пищей белке должны присутствовать одновременно все необходимые для синтеза аминокислоты в определенных соотношениях. Дефицит одной или нескольких аминокислот ограничивает биосинтез белков, ведет к нарушению азотного обмена. При условии недостатка одних и избытка других аминокислот последние не могут быть использованы для синтеза и дезаминируются, а продукты их обмена накапливаются в организме и служат причиной нарушения белкового обмена [131].
Белки - незаменимая часть пищи. Они не могут синтезироваться из других веществ в организме и должны постоянно поступать с пищей, в отличие от жиров и углеводов [5]. Синтез белка тела животного и продукции происходит из аминокислот, поступающих с протеином кормов и образующихся в процессе обмена [152]. В свою очередь, аминокислоты, входящие в состав протеина кормов, неравнозначны для животных разных видов. Часть аминокислот должна обязательно поступать с кормами, так как они не могут синтезироваться в организме животных. К ним относят лизин, метионин, триптофан, гистидин, лейцин, изолейцин, треонин, валин, аргинин, фенилаланин. Эти аминокислоты получили название незаменимых. Отсутствие или недостаток незаменимых аминокислот, особенно критических, в протеине кормов приводят к нарушению обмена веществ в организме, отрицательному азотистому балансу, прекращению регенерации белков, потере аппетита, патологическим изменениям в нервной системе, органах внутренней секреции и другим последствиям. В результате этого у молодых животных задерживается или совсем прекращается рост, у взрослых животных ухудшается общее состояние здоровья, нарушается репродукция, снижается продуктивность [64, 72, 76, 147, 165, 181].
Существуют белки и корма, которые могут восполнить недостаток необходимых аминокислот. Это корма, содержащие все незаменимые аминокислоты, называются полноценными. К ним относятся животные белки (молоко, мясо, яйца). В большинстве растительных белков (рожь, пшеница, овёс, кукуруза, горох) некоторые незаменимые аминокислоты отсутствуют или находятся в очень малом количестве. Такие белки не обеспечивают всех потребностей животного организма, и они называются неполноценными. Поэтому при составлении рациона для животных и птиц обязательно нужно учитывать аминокислотный состав кормов [69].
Роль отдельных аминокислот в организме животных неоднозначна и безусловно все имеют огромное значение. Однако, три из незаменимых аминокислот -лизин, метионин и триптофан, являются лимитирующими (критическими). Из них наиболее дефицитными являются лизин и метионин [167].
Лизин в организме животных участвует в синтезе тканевых белков, триптофан - в обновлении белков плазмы крови [64, 72, 76, 89, 147, 165, 181]. Лизин участвует в синтезе гемоглобина, меланина перьевого покрова. При недостатке в комбикорме лизина отмечаются плохой аппетит, замедленный рост молодняка, понижение яйценоскости, недостаточная прочность скорлупы и костей, депигментация оперения, параличи, анемия и истощение птицы [179].
Метионин необходим в процессах переаминирования для образования новых органических соединений, что приводит к образованию новых соединений: холина (витамина В4), креатина, адреналина, ниацина (витамина В5) и др. Метио-нин регулирует обмен белков и углеводов. Отсутствие в протеине корма метио-нина приводит к нарушению обмена веществ, сопровождаемого морфологическими и функциональными изменениями в организме животных. Наравне с холином метионин является основным фактором регуляции жирового обмена, особенно в печени. Поэтому рационы животных при болезнях печени, атеросклерозе, ожирении и многих других заболеваниях необходимо обеспечивать достаточным количеством метионина как липотропного вещества [64, 72, 76, 89, 147, 165, 173, 181]. При недостатке метионина в рационе отмечается плохой аппетит, замедляется рост молодняка, наблюдается снижение яйценоскости у несушек, жировое перерождение печени, анемия и истощение птицы [164].
Другие незаменимые аминокислоты, например, аргинин ускоряет процесс синтеза мочевины в почках, креатина белка мышц, фермента поджелудочной железы - инсулина, участвует в образовании спермы. Аминокислота гистидин принимает участие в энергетическом обмене организма, используется для синтеза гемоглобина и эритроцитов крови. Фенилаланин, тирозин и триптофан определяют физиологическую активность ферментов пищеварительного тракта, окислительных ферментов в клетках и ряда гормонов. Триптофан также участвует в обновлении белков плазмы крови [64, 72, 76, 147, 165, 181]. Триптофан обуславливает нормальное функционирование гемоглобина, никотиновой кислоты, половой системы и др. При его недостатке замедляется рост молодняка, снижается яйценоскость, повышаются затраты кормов на продукцию, возникает слепота, понижаются оплодотворённость и выводимость яиц [164]. Тирозин используется для синтеза гормона щитовидной железы тироксина и гормона надпочечников адреналина. Серосодержащие аминокислоты (метионин, цистин и цистеин) являются в обмене частично взаимозаменяемыми. Цистин используется для синтеза глютатиона, активирует инсулин, а вместе с триптофаном участвует в синтезе в печени желчных кислот, необходимых для всасывания продуктов переваривания жиров из кишечника [64, 72, 76, 147, 165, 181].
Методика проведения балансовых опытов
Ц.Ж. Батоевым и С.Ц. Батоевой (1970) была разработана принципиально новая методика изучения внешнесекреторной функции поджелудочной железы птиц [10]. Она основана на пересадке протока поджелудочной железы, желчевы-делительной системы в изолированный отрезок кишечника и образовании пан-креадуоденального анастомоза по Д.С. Жилову (1935) (приложение 11) [66].
Операции по вживлению протоков поджелудочной железы у птиц происходят довольно успешно. Однако бывают случаи когда происходит сращение протоков и прекращение выделения сока примерно у 20% оперированных птиц [10].
При помощи внешнего анастомоза, соединяющего канюли, мы могли получать чистый панкреатический сок только во время опытов, а в остальное время секрет поджелудочной железы поступал в кишечник [10, 66].
Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что через 7-10 дней после операции количество панкреатического сока и активность его ферментов достигает нормального уровня, характерного для здоровой птицы [10, 66].
Физиологические опыты выполняли на курах-несушках породы Ломан Браун в возрасте 1 года с хронической фистулой, оперированных по выше описанному методу (приложение 12) [10]. После операции в течение 7 - 10 дней птиц выхаживали и постепенно переводили на обычный рацион, приучали к фиксации в станке и обстановке эксперимента. Сначала проводили пробные опыты, а после полного восстановления секреторной функции поджелудочной железы – основные.
В задачу наших исследований входило изучение влияния добавок ферментного препарата и аминокислот на фоне гороха и рапса, а так же разных доз КБД (комплексной белковой добавки) на пищеварительную функцию поджелудочной железы кур по сравнению с соевым жмыхом.
Для изучения влияния белковых добавок использовали метод периодов с обратным замещением в соответствии с методическими рекомендациями Ткачёва Е.З., Мошкутало И.И. (1988) [74]. Было проведено по три серии опытов для каждой из добавок на десяти фистулированных курах. В состав основного корма входили: пшеница, ячмень, отруби, премикс и ракушка – 1%. В первые 10 дней курам давали контрольный комбикорм, в который помимо основного входила добавка соевого жмыха. В следующие 10 дней - опытный комбикорм, в котором соевый жмых заменяли на различные добавки в соответствии с задачами исследований.
Для выявления динамики секреторной функции поджелудочной железы кур собирали панкреатический сок в течение 3 часов с 30 минутными интервалами, всего 6 порций. В каждой порции фиксировали объём сока, определяли активность амилазы, протеаз и липазы. Опыты начинали утром в состоянии натощак, после 12-часовой голодной диеты. Курам давали корм только после первых 30 минут эксперимента в количестве 30% от дневной нормы в сухой, рассыпной физической форме. Панкреатический сок продолжали собирать с интервалом в 30 минут в течении ещё 2,5 часов и изучать секреторную функцию поджелудочной железы кур [10].
Животных содержали согласно правилам и нормам гуманного отношения к животным, прописанным в Федеральном Законе «Об ответственном обращении к животным», законопроект 458458-5 от 1.07.2010 года.
В задачу определения перевариваемости питательных веществ комбикорма входило определение азотистого баланса у кур (перевариваемость протеина корма) проводили балансовый опыт, для которого подбирали трёх кур в возрасте 1 года породы Ломан Браун. Птиц содержали в клетках, специально оборудованных для тщательного учёта потреблённого корма и выделенного помёта. Полы в клетках делали из сетки. Под сетчатый пол устанавливали выдвижной противень (помётный лист). Кормушку и поилку располагали с наружной стороны [76].
Опыт делили на два периода. Первый - предварительный период длился 5-7 дней. Цель этого периода – приучить птицу к новым условиям содержания и исключить влияния предшествующего кормления. Второй период (опытный) длился от 3 до 5 дней. Он следует сразу же за предварительным [76].
Распорядок кормления птицы в балансовых опытах такой же, как и в производственных условиях. Перед началом опытного периода кормушки освобождали от остатков корма, а помётный лист тщательно очищали от помёта. В этот период проводят тщательный учёт потреблённого корма, воды, выделенного помёта, снесённых яиц и живую массу птицы [76]. В опытный период помёт собирали ежедневно в одно и тоже время (утром и вечером), взвешивали и растирали в ступке. При каждом сборе помёта на анализ брали приблизительно 50% помёта и помещали в банку с притёртой пробкой. Для фиксации аммиака каждую пробу помёта заливали 0,1 н. раствором щавелевой кислоты из расчёта 4мл кислоты на 100 г помёта (количество добавленной щавелевой кислоты учитывали и исключали её из расчёта при определении первоначальной влаги в помёте) [76].
Если после окончания учётного периода в кормушке оставался не потреблённый корм, то при расчётах обязательно учитывали количество питательных веществ в этих остатках [76].
Собранный помёт хранили в холодильнике, не замораживая. После окончания учётного периода, в собранном помёте определяли содержание первоначальной влаги, высушивая его при 60 – 700С до постоянной массы. Полученную массу тщательно размалывали до порошкообразного состояния, помещали в банку с притёртой пробкой и хранили для анализа. Птицу после опыта так же взвешивали [76].
Физиологическое обоснование использования ферментного препарата в составе белковой добавки на основе гороха и рапса
Баланс азота - соотношение между количеством поступившего азота с кормом и выделенного с помётом, куда входит азот кала и мочи, плюс азот, отложенный в мясе и яйцах. При положительном балансе азота его больше потребляется с кормом (азот птица может получить только с кормом), чем выделяется с продукцией и помётом, при отрицательном балансе из организма его выделяется больше, чем поступает с кормом [145].
Переваримость корма - свойство питательных веществ корма переходить под воздействием пищеварительных соков в растворимое состояние и становиться доступными для всасывания стенками пищеварительного тракта птицы [145].
При пищеварении часть питательных веществ корма обеспечивает жизнедеятельность микроорганизмов желудочно-кишечного тракта. Благодаря их деятельности образуется бактериальный белок из простейших азотистых и углеводных соединений, происходит синтез водорастворимых витаминов и другие процессы [117]. Питательные вещества (белки, жиры и углеводы), после изменения в пищеварительном тракте и распада их на более простые соединения, усваиваются организмом и относятся к переваримой части корма. Другая часть – не переваренные вещества. Они не усваиваются организмом животного и удаляются в виде кала [117, 118].
Количество переваренных веществ определяется по разности между валовым составом корма и непереваренными остатками и веществами, выделяемыми в кале.
Известно, что при стимуляции функции поджелудочной железы усиливаются процессы переваривания корма [16, 20, 21, 157]. Для подтверждения данного положения мы выполнили балансовый опыт на курах с целью изучения белкового обмена. Эксперименты проводились согласно рекомендациям по кормлению птицы [74].
Для эксперимента по определению перевариваемости питательных веществ комбикорма выполняли балансовый опыт. Брали трёх кур в возрасте 1 года. Опыт делился на первый - предварительный период (5 дней), цель которого – адаптация птицы к новым условиям содержания и исключить влияния предшествующего кормления. Второй - учётный период (3 дня). В этот период опыта птицу взвешивали, вели тщательный учёт количества потреблённой и оставшейся воды, корма и помёта.
Для контрольного периода приготавливали комбикорм, содержащий комбикорм и 5% соевого жмыха. А для опытного периода соевый жмых заменяли на комплексную белковую добавку в таком же количестве.
Куры в контрольный период получали комбикорм, содержание сырого протеина в котором составляло 19,0% (5% соевого жмыха), а в опытный период – 14,7% (5% комплексной белковой добавки). Результаты переваримости кормов представлены в таблица 12 (данные отражены в публикациях) [40]. Таблица 12- Переваримость корма при использовании 5% КБД
Из данной таблицы видно, что переваримость белка в контрольном периоде, при использовании в рационе кур соевого жмыха в количестве 5% от массы корма, составила 87%. В опытном периоде, при введении в комбикорм комплексной белковой добавки (КБД) в таком же количестве, показатель перевариваемости белка повысился до 93,5% (данные отражены в публикациях) [32].
Таким образом, корм, содержащий КБД, усваивается организмом птиц на 6,5% лучше, чем корм, содержащий соевый жмых.
Качество протеина корма оказывает влияние, главным образом, на перева-риваемость и усвоение белка организмом птицы. Более сбалансированный по аминокислотному составу белок, содержащийся в корме, усваивается лучше.
Животным для нормального, правильного роста и развития, сохранения здоровья и репродукции необходимо постоянно получать с кормами определенное количество белка в сочетании с источниками энергии - жирами и углеводами, а также минералами и витаминами. Поэтому при организации правильного протеинового питания необходимо соблюдать физиологические нормы потребностей в протеине и аминокислотах [5, 40, 63, 69, 71, 104, 131, 147, 165].
Для оптимизации рационов животных, необходимо использовать современные методы определения содержания в ингредиентах корма белков, жиров и углеводов. Однако известные методы имеют существенные недостатки и требуют совершенствования. Они не позволяют обеспечить необходимую точность определения количественного содержания пищевых белков и требуют более сложного оборудования, реактивов и больших затрат времени [8, 22, 110, 121, 146].
Исходя из этого, первой задачей нашей работы стала разработка способа количественного определения пищевых белков, жиров и углеводов для исследования кормов растительного и животного происхождения.
Наш способ основан на использовании химических реакций с участием ферментов и проявлении их субстратной специфичности. Для его разработки из существующих методов определения белка за прототип брали «Способ определения переваримости белков», разработанный Савич И.М. и Жолдаспаевой Г.М. (патент на изобретение № RU 2022021 С1 от 30.10.1994), а аналогами были «Метод определения переваримости белков», разработанный Похиленко Л.И, Левицким А.П., (патент на изобретение № SU 1247750 A1 от 30.07.1986), «Метод определения расщепляемости сырого протеина», разработанный Игловиковым В.Г., Усаткиным Н.С., Григорьевым Н.Г. и др. (патент на изобретение № 28075-89 от 29.03.1989) [31, 110, 113, 114, 115, 116, 146].
Суть нашего метода заключается в последовательном проведении смешивания опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37С, центрифугирование ферментативно-субстратного комплекса, проведение биохимических анализов и определение количественного содержания пищевых белков, жиров и углеводов расчетным путем [115].
Данные исследований дают основание сделать вывод, что указанный метод «Способ определения содержания пищевых белков» (патент на изобретение № 2473699 C2 от 06.04.2011) в отличие от существующих методов, позволяет определить то количество питательных веществ, которое способно усвоиться организмом. Проводя сравнительный анализ полученных результатов с известными данными в научной литературе можно сделать вывод, что метод даёт достоверные результаты (таблица 13) и прост в использовании [115].
Переваримость протеина корма при использовании КБД в рационах кур
Таким образом, комплексная белковая добавка (КБД) в дозе 5% от массы корма стимулирует функцию поджелудочной железы кур, увеличивая активность амилазы и липазы. Количество панкреатического сока существенно не изменилось. Протеолитическая активность осталась на прежнем уровне, несмотря на то, что в опытный период количество сырого протеина в корме меньше по сравнению с контрольным кормом.
С целью выявления оптимальной дозы КБД мы повышали её количество в комбикорме. Поэтому вторым этапом исследований явилось изучение секреторной функции поджелудочной железы при введении в рацион кур КБД в дозе 10% от массы корма [33].
Проведённые исследования позволяют сделать вывод, что увеличение дозы КБД в рационе кур до 10% от массы корма стимулирует внешнесекреторную функцию поджелудочной железы кур. Количество панкреатического сока при введении в рацион КБД повышается на 25% в сравнении с контрольным периодом. Активность протеазы в 1 мл панкреатического сока возрастает на 39%, липазы на 50%, протеаз - на 46%, по сравнению с контролем. Причём активность панкреатических ферментов увеличивается как в период до дачи корма, так и в слож-норефлекторной и гуморальной фазах регуляции секреции [33].
Следующим шагом в выявлении оптимальной дозы КБД стало повышение её количества в комбикорме до 15%.
Испытания показали, что замена соевого жмыха в дозе 15% от массы корма на комплексную белковую добавку в таком же количестве (15% от массы корма), увеличивает количество панкреатического сока за опыт у кур на 57,4% по сравнению с контролем. Наибольшие изменения наблюдались в ферментативной активности. Так, в 1мл сока активность амилазы увеличилась на 65,0%, липазы на 66,6% по сравнению с контрольным периодом. В объёме сока за опыт ферментативная активность амилазы и липазы возрастает на 72,2%. Наблюдается динамика к повышению ферментативной активности протеаз, хотя существенных изменений нет. Качество корма отличается в контрольный и опытный периоды. Добавка 15% соевого жмыха обеспечивает рацион сырым протеином в количестве 6%, а добавка КБД - 3%, поэтому количество сырого протеина в рационе равно 18,6 единиц в контрольный период и 15 – в опытный, что указывает на снижение уровня сырого протеина на 3,6% в опытный период. Однако увеличение протеаз свидетельствует о наличии в рационе в опытный период более сбалансированного белка, чем в контрольный. Данные анализа динамики выделения панкреатического сока и ферментов в 1 мл секрета свидетельствуют, что корм является сильным стимулятором панкреатической секреции.
Таким образом, КБД в дозе 15% от массы корма оказывает положительное влияние на секреторную функцию поджелудочной железы, стимулируя её деятельность. Секреция панкреатического сока увеличивается на 57%, активность амилазы – на 65%, активность протеаз – на 17%, а липазы - на 67% по сравнению с контролем. Следовательно, добавка КБД в дозе 15% существенно не изменяет динамику выделения протеаз, однако наблюдается тенденция к увеличению активности.
Комплексная белковая добавка при её введении в рацион взамен соевого жмыха в количестве 5, 10 и 15% от массы корма стимулирует сокоотделение поджелудочной железой с 8 до 57%, повышает активность амилазы с33 до 65%, протеаз – с 17 до 46% и липазы - с 33 до 67% по сравнению с контролем. Наиболее существенные изменения отмечались при введении КБД в количестве 10% от массы корма.
КБД принципиально не изменяет динамику выделения панкреатических ферментов после приема корма, но уровень ферментативной активности превышает контрольный. Повышается базовая активность амилазы и липазы (до приема корма), что свидетельствует о долговременной адаптации пищеварительной системы кур к новой добавке. Отмечается увеличение уровня амилазы и липазы в сложнорефлекторный период регуляции секреции (на 90-120 минуте опыта), а также всех ферментов в нейрогуморальную фазу регуляции панкреатической секреции (180 минута опыта). Следовательно, наиболее оптимальной для введения в рацион кур комплексной белковой добавки (КБД) является доза 10% от массы корма.
Введение в рацион кур каждой из доз КБД (5, 10 и 15%) стимулировало эк-зосекрецию поджелудочной железы кур. Это объясняется тем, что за счёт добавки ферментного препарата, по-видимому, нейтрализуются ингибиторы протеаз, амилазы и другие антипитательные вещества. Сбалансированность аминокислотного состава корма за счёт добавки лизина и метионина, обуславливает повышение количества легкоусвояемого белка растительного происхождения. Также КБД содержит витамины и минеральные вещества. Благодаря такому составу подходит в качестве компонента для приготовления комбикормов. Добавленный к зерновым смесям в количестве 10-15% от общей массы, продукт обеспечивает физиологические потребности животных в белках, жирах, углеводах, витаминах и минеральных веществах [42, 47, 53, 58, 119, 129].
Следующей задачей нашего исследования стало проведение балансового опыта для определения азотистого баланса и переваримости протеина корма, так как данные по переваримости протеина кормов малочисленны, а с использованием в рационе кур комплексной белковой добавки (КБД) отсутствуют.
Питательные вещества (белки, жиры и углеводы) после изменения в пищеварительном тракте и распада их на более простые соединения, усваиваются организмом и считаются переваримой частью корма. Непереваренные вещества не усваиваются организмом животного и удаляются в виде кала [118].
Переваримость кормов определяют путем точного учета съеденного корма и выделенного кала, подвергнутых химическому анализу по схеме: вещества корма — вещества кала = переваримые вещества [118].
Бердников П.П. и Хакбердиев (1989) говорят о том, что переваримость корма у уток снижается при применении в рационе добавок с большим содержанием протеина [20, 21]. Однако различия между фактической переваримостью, установленной в балансовых опытах, и предсказанной с помощью уравнений, статистически недостоверны.
