Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Строение гиппокампа и зубчатой фасции 9
2.2. Роль гиппокампа в процессах, обеспечивающих пространственное обучение и память животных 15
2.3 Использование метода картирования с помощью экспрессии ранних генов и других неинвазивных методов для оценки функций гиппокампа 38
2,4. Пространственное обучение у полевок и других мышевидных грызунов 62
3. Эксперимент 1А и 1Б. Пространственное обучение в модифицированном «открытом поле» с контролируемыми зрительными стимулами 71
3.1. Методика 71
3.2. Результаты 76
3.3. Обсуждение 91
4. Эксперимент 2А и 2Б. Обучение в модифицированном радиальном лабиринте, с возможностью выхода в домашнюю клетку 95
4.1. Методика 95
4.2. Результаты 98
4.3. Обсуждение 103
5. Общее обсуждение 105
6. Выводы 112
7. Список литературы 113
8. Таблицы и иллюстрации 134
- Строение гиппокампа и зубчатой фасции
- Роль гиппокампа в процессах, обеспечивающих пространственное обучение и память животных
- Методика
- Методика
Строение гиппокампа и зубчатой фасции
Гиппокамп представляет собой плотную ленту клеток, которая тянется в дорзовентральном и рострокаудалыюм направлениях. В гиппокампальную формацию объединяют несколько связанных структур: собственно гиппокамп (или Аммонов рог), зубчатую фасцию, субикулярный комплекс и свод. Морфологические исследования Лоренте де Но (Lorente de No, 1934, цит. по Гамильтон, 1984) позволили выделить четыре основных подразделения в гиппокампе - полей СА1, СА2, САЗ, СА4. Цитоархитектоника гиппокампа была изучена Рамоном-Кахалом (Ramon у Cajal, 1955, 1968, цит. по Гамильтон, 1984). По его данным, выделяют несколько слоев: молекулярный слой {Stratum molecalare) (содержит много нервных волокон и мало клеточных тел), лакунарный слой {Stratum lacunosiim) (содержит нерегулярно расположенные клетки и большое количество волокон), радиальный слой {Stratum radiatum) (имеет более рыхло расположенные клетки, содержит много дендритных ветвей пирамидных клеток), пирамидный слой {Stratum piramidale) (содержит три четыре ряда пирамидных клеток), stratum oriens (содержит дендритное древо направленное к глубинным слоям), слой белого вещества {Stratum alveus) (образован аксонами глубинных пирамид). В поле САЗ выделяют дополнительный слой Stratum lucidum, сформированный аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции, образующих синапсы на пирамидных клетках поля САЗ (мшистые волокна).
Клеточная структура зубчатой фасции насчитывает три слоя: молекулярный {Stratum moleculare) (апикальные дендриты гранулярных клеток), гранулярный {Stratum granulosam) (плотно расположенные гранулярные клетки), полиморфный {Stratum polymorphe) (аксоны гранулярных клеток и несколько типов не гранулярных клеток) (O Keefe et al.5 1978).
Афференты гиппокампа и зубчатой фасции для каждого поля можно разделить на четыре группы: от клеток того же поля, от клеток другого поля или зубчатой фасции, коммиссуральные связи от контралатералыюго гиппокампа, афферепты от клеток структур, лежащих за пределами гиппокампа. К афферентами первого типа относятся возбуждающие и тормозные волокна корзинчатых (реже пирамидных) клеток поля САЗ, направленные на пирамидные клетки того же поля (O Keefe, Nadel, 1978). Кроме того, часть аксонов пирамидных клеток поля САЗ образуют продольный ассоциативный пучок, который связывает пирамиды поля САЗ, расположенные на различных уровнях вдоль продольной оси гиппокампа (Amaral, Witter, 1989). Аналогичный пучок образуется и клетками полиморфного слоя зубчатой фасции, который оканчивается в молекулярном слое зубчатой фасции, расположенной на другом рострокаудальном уровне (Hjorth-Simonsen, Laurberg 1977; Laurberg 1979; Laurberg, Sornsen 1981). Внутригиппокампальные связи представлены несколькими путями. Основные из них: мшистые волокна и коллатерали Шаффера. Мшистые волокна являются аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции. Инфра- и интрапирамидпые мшистые волокна заканчиваются на базальных дендритах пирамидных клеток поля САЗ, тогда как супрапирамидные волокна - на апикальных дендритах пирамидных клеток Lorente de No, 1934 цит. по O Keefe, Nadel, 1978, Schwegler et al., 1989, 1995). Коллатерали Шаффера отходят от аксонов пирамидных клеток поля САЗ и заканчиваются на пирамидных клетках поля СА1 (Bayer, 1985). Комиссуральные связи представлены дорзальной и вентральной комиссурой гиппокампа. Через них клетки полей СА1, САЗ и зубчатой фасции посылают свои аксоны в аналогичные поля контралатерального гиппокампа (O Keefe, Nadel, 1978).
Основные афферепты от внешних структур представлены проекциями из энторинальной коры, ствола мозга, области перегородки и таламуса. Основные волокна из энторинальной коры объединены в перфорантный путь, который заканчивается на гранулярных клетках зубчатой фасции. Поскольку в энторинальную кору поступают проекции из теменной, цингулярной, височной и фронтальной областей коры, то через перфорантный путь гиппокамп получает информацию из ассоциативных областей новой коры (Bayer, 1985, Burwell et al., 1998, Witter et al, 2000). Афференты из таких областей как ядра шва, медиальная перегородка, маммилярные тела приходят в первые два слоя поля CAI (молекулярный и лакунарный) через систему волокон свода (O Keefe, Nadel, 1978). Кроме того, недавно было показано, что в дорзальную часть поля СА1 поступают волокна и из субикулярной области (Commis et al,, 2002).
Основной эфферентный путь из гиппокампа образован аксонами пирамидного слоя поля СА1, которые через бахрому достигают области перегородки, таламуса и маммилярных ядер. Кроме того, аксоны поля СА1 дают прямые проекции в субикулярный комплекс и энторинальную кору. Аксоны пирамидных клеток вентральной части поля САЗ так же напрямую связаны с энторинальной корой (O Keefe, Nadel, 1978, Bayer, 1985).
Таким образом, гиппокамп имеет обширные связи, как с областями новой коры, так и с «подкорковыми» образованиями, такими как таламические ядра, маммилярные тела, перегородка, ядра шва и другие области. Кроме того, необходимо отметить связи вентрального гиппокампа со стриарной системой, в частности с прилежащим ядром переднего мозга (Gasbarri et al. 1993).
Ранние работы по морфологии гиппокампа были проведены на фронтальных срезах. Именно так было предложено деление гиппокампа на поля и выявлена его цитоархитектоническая структура. Но уже эти (Lorente de No, 1934 цит. по Small, 2002) исследователи отмечали, что гиппокамп может быть разделен и вдоль рострокаудальной оси. Одной из первых теорий о продольной организации гиппокампа была ламеллярная теория, предложенная Андерсеном с коллегами (Andersen et al., 1971). Свои исследования Андерсен проводил на дорзальном гиппокампе кролика. Показано, что стимуляция энторинальной коры в одной точке вызывала активацию 4 проводящих путей в самом гиппокампе - перфорантного пути, мшистых волокон, коллатералей Шаффера и выходных аксонов поля СА1, расположенных только на уровне точки стимуляции (так называемую ламеллу). На основе этих данных Андерсен выдвинул предположение о том, что весь гиппокамп состоит из параллельных, независимо функционирующих ламелл, которые могут оказывать влияние на соседние ламеллы. В дальнейшем эта теория подверглась существенной критике (Amaral, Witter, 1989, Small, 2002). В своем обзоре Амарал и Уиттер (1989) приводят последние данные о строении гиппокампа, и его особенностей в продольном протяжении, не согласующиеся с теорией Андерсена. Так было показано, что проекции из энторинальнои коры в зубчатую фасцию через перфорантный путь имеют неодинаковые размеры вдоль продольной оси гиппокампа. Так, существуют локальные проекционные поля (которые соответствуют ламеллярной гипотезе), сигнал от которых передается на участок зубчатой фасции небольшой протяженности. В то же время, в энторинальнои коре отмечены и области, проекции от которых были представлены на большом протяжении зубчатой фасции. Так, у кошек точечная стимуляция верхних слоев энторинальнои коры вызывала ответ, по меньшей мере, половины зубчатой фасции вдоль её ростокаудалыюй оси (Va Groen, Lopes da Silva, 1985). To есть, ряд локусов энторинальнои коры имеют перекрывающиеся проекции в зубчатой фасции. Кроме того, в зубчатой фасции, существуют участки, получающие проекции от нескольких точек энторинальнои коры, расположенных в на разных уровнях рострокаудальной оси. Эти данные не согласуются с ламеллярной теорией, рассматривающей один уровень проекций в гиппокамп, как отдельную независимую функциональную единицу.
Роль гиппокампа в процессах, обеспечивающих пространственное обучение и память животных
Экспериментальное изучение пространственной памяти началось еще в 30-х годах прошлого века. Одну из первых методик предложил Шепард (Shepard, 1931) (цит. по Thinus-Blanc, 1996). Он обучал крыс находить пищевое подкрепление в простом лабиринте в виде замкнутого коридора. В дальнейшем исследования пространственного обучения в лабиринтах были продолжены Толменом. Он обучал крыс находить приманку в сложном разветвленном лабиринте, где короткий путь к приманке был перекрыт. После обучения крыс помещали в тот же лабиринт, но перегородки, закрывающей прямой путь к приманке не было. В этом случае крысы сразу безошибочно шли по более короткому пути. На основании этих и последующих данных Толмен в 1948 г. предложил гипотезу существования у животных так называемой когнитивной карты. Суть ее заключалась в том, что у животного образуется мысленная схема («когнитивная карта») окружающего его пространства, позволяющая оптимально перемещаться в нем (Tolmen, 1948). В дальнейшем эта гипотеза была развита другими исследователями (O Keefe, Nadel, 1978), предположившими, что нейронным субстратом такой когнитивной карты является гиппокамп. Основой для такого вывода послужило открытие в 1971 г. в пирамидном слое дорзального поля СА1 гиппокампа "клеток места" (place-cells), которые разряжались, когда животное находилось в определенном месте пространства (O Keefe, Dostrovsky, 1971). Позднее появилось много работ посвященных функционированию таких клеток (см. напр. Poucet et al., 1994а; Knierim et al., 1995; Bures etal., 1997; Save etal., 1998; Best ct ah, 2001; Hollup et al., 2001). В большинстве этих исследований крыс высаживали в арену различной формы (круглую, Т- или У-образную и др.) с контролируемыми пространственными стимулами. Активность клеток гиппокампа регистрировали во время передвижения животного. В одном из таких исследований (O Keefe, Conway, 1976) авторы обучали крыс в Т-образном лабиринте, занавешенном непрозрачным занавесом с расположенными на нем стимулами (лампочка, вентилятор, источник шума, белая карточка). Животных обучали посещать все рукава. Было показано, что у животных формировались клетки места, и их рецептивные поля (место пространства, где активировались данные клетки) были постоянны относительно стимулов расположенных на занавесе и не зависели ни от расположения системы во внешнем пространстве, ни от физических свойств собственно рукава.
В дальнейшем появилось много исследований, посвященных участию гиппокампа в процессах различных форм пространственного обучения и памяти. Особая роль здесь принадлежит Д. (Элтону, разработавшему одну из самых популярных методик для исследования способности животных к пространственному обучению - радиальный лабиринт (Olton, Samuelson, 1976). Лабиринт состоял из центральной платформы и отходящих от нее 8 рукавов, в конец которых помещали пищевую приманку. Крыс обучали поиску приманки, при этом повторный заход в рукав, где приманка уже была съедена, рассматривали как ошибку рабочей памяти. Крысы, как лабораторные, так и первое поколение от диких особей, успешно решали предложенную задачу, совершая в среднем 7.8 правильных визитов за первые 8 посещений. При анализе последовательности посещенных рукавов не было выявлено какого-либо правила их посещения. Для оценки возможного использования запаховых меток, лабиринт поворачивали, сохраняя направления рукавов относительно дистантных стимулов. В этом случае не было выявлено предпочтения использования меток для ориентации. Таким образом, было показано, что животные ориентируются в радиальном лабиринте, используя именно дистантные стимулы. Далее (Элтон провел эксперименты для выяснения, какие мозговые структуры в большей степени ответственны за пространственную рабочую память. Основываясь на работах других исследователей (O Keefe, Nadel, 1978), Олтон предположил, что такой структурой должен быть гиппокамп. Крыс предварительно обучали в радиальном лабиринте до достижения стабильного уровня обучения, после чего удаляли гиппокамп или структуру, связанную с ним (энтор и пальную кору, систему бахромы и свода, перегородку), или участок новой коры. Показано, что животные с удаленным гиппокампом хуже обучались в радиальном лабиринте, чем контрольные и с разрушением новой коры (Olton et al., 1978, 1979).
Роль гиппокампа в процессах пространственного обучения была подтверждена и выявленными корреляциями между морфометрическими показателями гиппокампа и характеристиками поведения. Так, было показано (Wimer et al., 1971) , что мыши с большим объемом гиппокампа менее активны в открытом поле. Позднее стали использоваться другие, более точные морфометрические показатели. Так, например, Швеглер с соавторами (Schwegler et al., 1990, 1991, 1994) провели работу по изучению корреляции между соотношением размеров площадей проекций интра-инфрапирамидных и супрапирамидных мшистых волокон и обучением в радиальном лабиринте. Работу проводили на нескольких линиях мышей, различающихся строением гиппокампа (в частности, разным размером площадей интра-инфрапирамидных мшистых волокон). Использовали различные варианты радиального лабиринта. В первом был обычный радиальный лабиринт с подкреплением в каждом из восьми рукавов. Второй был оснащен дверками, которые отделяли центр лабиринта от его рукавов и закрывались при выходе животного из рукава на 5 секунд, для того, чтобы исключить стереотипное посещение соседних рукавов один за другим. В третьем случае посещенные рукава отмечались тем, что дверки в них оставались открытыми, то есть обучение в таком лабиринте не являлось пространственной задачей. В четвертом подкрепляли четыре рукава из восьми, что позволяло оценить ошибки, как рабочей памяти, так и референтной памяти. Ошибками рабочей памяти считали повторные заходы в рукава, где приманка была уже съедена, а ошибками референтной памяти -заходы в другие 4 рукава, в которых приманки никогда не было. Авторы не обнаружили корреляции между соотношением размеров площадей интра- и инфрапирамидных мшистых волокон и количества ошибок только в случае непространственной задачи (третий вариант), во всех остальных найдены значимые отрицательные корреляции. То есть животные с большими площадями волокон лучше обучались в радиальном лабиринте.
Другая группа исследователей (Barnes et al., 1980) обучала крыс по другой методике, которая отличалась как по характеру подкрепления, так и по структуре установки. Животных обучали находить выход с платформы. Для этого в приподнятой и ярко освещенной платформе было 18 отверстий, из которых только одно было открыто и вело в затемненную камеру. Обучение проводили в течение 12 последовательных дней (по одной попытке в день), после этого отверстие для выхода перемещали на 135 и проводили переделку в течение 6 попыток. Перед каждой попыткой платформу поворачивали, что бы исключить ориентацию по обонятельным стимулам. В своей работе Варне сравнивала обучение молодых и старых крыс. В исследовании было показано, что старые животные обучаются значительно хуже. В дальнейшем Варне с соавторами (McNaughton et al.,1989), используя разработанную методику, изучала эффект разрушения гранулярного слоя зубчатой фасции. Обнаружено, что животные с разрушенной зубчатой фасцией значительно хуже обучаются запоминать место выхода.
Методика
Животные: В эксперименте было 68 самцов мышей линии C57BL/6 (Эксперимент 1А), массой 18-21 г., полученных из питомника "Столбовая" и 56 рыжих полевок (40 самцов и 16 самок), массой 13-21 г. (Эксперимент 1Б). 13 полевок были выловлены на территории Торопецкого заказника «Чистый Лес» (Тверская область) в период с июля по сентябрь 2003г. 43 полевки были выловлены на территории Звенигородской биостанции МГУ (Московская область) в период с августа по сентябрь 2004г. Отлов производили живоловками Шермана в характерных местах обитания рыжих полевок. Всех грызунов содержали в стандартных клетках (40см х 20,5см х 15см) по 10 особей и кормили стандартным мышиным комбикормом с добавлением большого количества травы и овощей. Корм и воду предоставляли ad libitum. Перед началом эксперимента животных содержали в лабораторных условия не менее 14 дней. Данные о видовом составе и распределении животных на группы приведены в таблице 1.
Экспериментальная установка: Для оценки способности к ориентации грызунов тестировали в модифицированном открытом поле. Установка представляла собой круглую арену диаметром 150 см с высотой стенок 50 см, приподнятую над уровнем пола на 70 см. На полу арены был постелен линолеум диаметром 150 см, который мог свободно поворачиваться в горизонтальной плоскости. Поле освещали 8 матовых ламп, мощностью 25 Вт, закрепленных на верхнем краю стенки на высоте 120 см от уровня пола комнаты. Освещенность внутри арены на уровне дна составляла 140-160 люкс. На полу комнаты, под центром арены, был помещен источник белого шума -ненастроенное радио. Снаружи поле было окружено непрозрачным занавесом черного цвета, диаметром 250 см. Внутри к занавесу были прикреплены 3 ряда прозрачных папок формата А4 (210x297мм) по 24 штуки в одном ряду, куда во время основного эксперимента помещали стимулы - белые листы с напечатанными черными геометрическими фигурами (треугольники, кресты, круги) размером А4. Стимулы могли быть расположены асимметрично, в этом случае одна треть каждого ряда была заполнена только крестами, другая -кругами и третья - треугольниками, или симметрично - каждый ряд был представлен только одним типом фигур (см. Рис. 1). Сверху занавес был закрыт белой непрозрачной тканью с отверстием в центре для видеокамеры. Регистрацию поведения животного осуществляли с помощью автоматизированной системы состоящей из видеокамеры "Sony", расположенной на высоте 250 см от центра лабиринта, и персонального компьютера, оснащенного дополнительной платой видео ввода изображения Picolo. Программа Ethovision (Noldus, Нидерланды версии 1.96 и 3.0), позволяла сохранять траекторию перемещения животного в виде координат. Регистрацию координат проводили с частотой 5 кадра в секунду. Записанные треки конвертировали в программу Wintrack (www.dpwolfer.ch/wintrack, Wolfer et al., 2001), с помощью которой рассчитывали длину пройденного пути и время пребывания в различных зонах. Для анализа были выбраны центральная (диаметр 50 см) и пристеночная (15 см от стенки арены) зоны арены, а также 4 квадранта и их центральные зоны (30 или 50 см диаметром).
Процедура тестирования: Эксперимент 1А: Все мыши были предварительно ознакомлены с ареной закрытой занавесом. Для этого их в течение трех дней 2 раза в день выпускали из непрозрачного цилиндра у борта арены. Место выпуска варьировали от попытки к попытке. Длительность одной попытки составляла 10 минут, интервал между ними - 20 минут. Между попытками линолеум мыли водой, протирали насухо и поворачивали на случайный угол по или против часовой стрелки, чтобы избежать ориентации животных по запаховым меткам или другим стимулам внутри арены. Одновременно с началом предварительного этапа в домашнюю клетку животных помещали картонную коробочку-убежище (10X6X6 см).
Основной эксперимент проводили на 4-й день. Перед его началом животные были случайным образом распределены на 4 группы. Мышей из контрольной группы (п= 12) тестировали в условиях, аналогичных этапу приучения, т.е. в арене без дополнительных стимулов. Для опытных групп на внутреннюю часть занавеса помещали стимулы, а на пол арены, в центр одного из квадрантов (на расстоянии 20 см от борта), ставили коробочку-убежище из домашней клетки животного, в которую мышь могла зайти со стороны стенки арены. В группах с асимметричным (п=12) и симметричным (п=12) расположением стимулов на протяжении всего эксперимента коробочка находилась в одном и том же квадранте, относительно внешних стимулов, Для разных особей местоположение коробочки было различно. Для третьей опытной группы (п=12) стимулы располагали асимметрично, а местоположение убежища варьировали от попытки к попытке.
Процедура тестирования состояла из 6 последовательных попыток, проводимых в течение одного дня. Длительность одной попытки была 6 минут, интервал между попытками - 10 минут. Для того, чтобы протестировать, запоминают ли животные местоположение убежища, перед шестой попыткой коробочку убирали из арены. Для избежания ориентации мышей по запаху линолеум поворачивали и мыли водой после каждой попытки, так же как и на предварительном этапе. Таким образом, животные, которых тестировали при асимметричном расположении зрительных стимулов, могли запоминать точное расположение убежища относительно внешних зрительных ориентиров. После последней попытки мышь отсаживали в отдельную клетку на 45 минут, по истечении которых проводили декапитацию. Для оценки фонового уровня экспрессии были взяты интактные животные (группа пассивного контроля п=4). Их декапитировали непосредственно после взятия из домашней клетки.
Для иммуногистохимических исследований случайным образом было выбрано по 8 животных из каждой экспериментальной группы. Эксперимент IB: В связи с видоспецифическими особенностями рыжих полевок (высокий уровнень тревожности, склонность к замиранию, меньшая, чем у мышей, подвижность) процедура тестирования была несколько изменена. Во время предварительного этапа длительность попытки составляла 15 минут, интервал между ними - 30 минут. Во время основного эксперимента (4-й день) полевок тестировали в 4-х попытках (по 10 минут с интервалом 15 минут), перед последней - убежище убирали.
Нммуногистохітическая процедура: Сразу после декапитации извлекали мозг, который замораживали в парах жидкого азота. Образцы помещали в холодильник при температуре -70С не более чем на 14 дней. Далее из замороженных образцов приготовляли коронарные срезы толщиной 20 мкм на криостате "Microm Н-505" при температуре -16С - -18С. Срезы, выбранные на основании атласа мозга мышей линии C57BL/6 (Franklin, Paxinos 1984), начинали собирать на предметные стекла с момента появления гиппокампа (расстояние от брегмы -1,06 мм), и до уровня последних срезов, где была видна эта структура (расстояние от брегмы -3.8 мм). Их распределяли на две параллельные серии - для иммуногистохимической окраски и для контрольной окраски по Нисслю (крезил виолетом). Для гистологической обработки брали каждый 5-й срез.
Методика
Животные: В Эксперименте 2А использовали 12 самцов мышей инбредной линии C57BL/6, полученных из питомника «Столбовая», массой 18-21 грамм, а в Эксперименте 2Б - 16 обыкновенных полевок {Microlus arvalis), весом 16-24 грамм. Все полевки были выловлены на территории Торопецкого заказника «Чистый Лес» (Тверская область) в период с июля по сентябрь 2001 и 2002 гг. Отлов производили живоловками Шермана в характерных местах обитания обыкновенных полевок.
Мышей содержали в лабораторных условиях по 6 животных в стандартных клетках. Из-за повышенной внутривидовой агрессивности полевок содержали в индивидуальных клетках в виварии заказника и кормили стандартным мышиным комбикормом с добавлением большого количества свежей травы и овощей. Корм и воду все животные получали ad libitum.
Эксперименты проводили поздней осенью, когда полевки находились в нерепродуктивном состоянии. Для снижении влияния условий содержания на интенсивность экспрессии c-Fos, после отлова полевок содержали в виварии не менее 14 дней до начала эксперимента. Перед началом эксперимента, животные были случайным образом распределены на опытную и контрольные группы. Данные о видовом составе и разделении животных па группы приведены в Таблице 1.
Экспериментальная установка: Для оценки эффекта обучения новой пространственной задаче была разработана методика, включающая в себя элементы теста Варне (Barnes et al., 1980). Из этого теста была взята основная мотивация обучения - возможность возвращения из открытого пространства в домашнюю клетку. Однако, в отличие от установки Варне, чтобы избежать тигмотаксиса и четко контролировать направление движения животного, мы использовали структуру радиального лабиринта (Olton, Samuelson, 1976). Сходный дизайн экспериментов был использован и другими авторами, работавшими с крысами (Masuda et al., 1994 Григорьев Н.Р, 1998 ), но предложенный нами вариант позволял контролировать виутрилабиринтные стимулы и был адаптирован для быстрого обучения диких полевок.
Восьмирукавный радиальный лабиринт (длина рукава 32 см, диаметр центральной части 36 см, ее высота 45см) был размещен на вращающуюся площадку, приподнятую над уровнем пола на 82 см. Рукава лабиринта и центральная часть были из прозрачного пластика. В конце рукавов (на расстоянии 26 см от стенки центральной части) была установлена односторонняя непрозрачная дверь, закрывающая вход в отсек длиной 6 см, который соединялся с клеткой для содержания грызунов (25,5см х 18,5см х 13см). Во время эксперимента все двери были блокированы, за исключением одной (в целевом рукаве), которая могла быть свободно открыта грызуном. Выйдя через нее в конечный отсек, животное через трубку, отходящую от него, попадало в клетку, где находились опилки из домашней клетки. Чтобы избежать ориентации животных по запаху, такие же опилки были насыпаны и в другие клетки, к которым вели трубки заблокированных рукавов. Кроме того, после каждой попытки лабиринт поворачивали, сохраняя направление целевого рукава. Это направление для разных особей было разное, но оно не менялось от попытки к попытке. Установка была помещена в комнату, где также располагался компьютер, полки и другая мебель. На стенах комнаты были развешаны плакаты. Все эти объекты могли быть ориентирами для животных. Для мышей лабиринт ярко освещали (2 лампы по 250 Вт), чтобы усилить мотивацию выхода из него.
В экспериментах с полевками в установку были внесены незначительные изменения, облегчающие выход из лабиринта. В этом случае рукав соединялся с клеткой для содержания грызунов вертикальной трубкой длиной 11 см. Кроме того, для пугливых полевок эксперимент проводили при более слабом освещении (три лампы мощностью по 60 Вт, на высоте 2 м от пола, направленные вверх).
Регистрацию поведения животного осуществляли с помощью автоматизированной системы состоящей из видеокамеры "Sony", расположенной на высоте 170 см от центра лабиринта, и персонального компьютера, оснащенного дополнительной платой видео ввода изображения Picolo. Программа Ethovision версии 1.96 и .3.0 (Noldus, Нидерланды), позволяла сохранять траекторию перемещения животного в виде координат. Регистрацию координат проводили с частотой 5 кадра в секунду. Исходя из полученной траектории, с помощью программы Ethovision рассчитывали общую длину пути, латентный период выхода, частоту и латентный период захода в различные рукава.
Процедура тестирования: Животных опытной и группы активного контроля предварительно обучали в той же комнате, где и проводили основной эксперимент, что позволяло ознакомить животных со всеми компонентами обстановки опыта, за исключением самого лабиринта. Во время приучения грызунов вынимали из домашней клетки и помещали в рукав, отсоединенный от лабиринта. Они быстро обучались открывать носом одностороннюю дверку, переходить в конечный отсек и выходить через трубку в домашнюю клетку. Предварительное обучение проводили 6 раз в день с интервалом в 40 минут, в течение 5 последовательных дней. Каждый раз направления рукава относительно дистантных стимулов меняли.
На шестой день (основной эксперимент) животных из опытной группы обучали в лабиринте. Процедура обучения состояла из шести попыток с 15-минутным интервалом. Грызуна выпускали из непрозрачного цилиндра в центр лабиринта. С этого момента начинали регистрацию траектории перемещения животного. Попытка продолжалась до самостоятельного выхода из лабиринта (обычно 1-2 мин). Животных из группы активного контроля 6 раз с 15-минутным интервалом выпускали в рукав, отсоединенный от лабиринта (так же как и при предварительном обучении). После окончания обучения животное отсаживали в домашнюю клетку на 1,5 часа, по истечении которых проводили декапитацию.
Похожие диссертации на Изучение активации различных отделов гиппокампа после выполнения грызунами пространственных тестов
