Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Особенность обменных процессов в сперме с.-х. животных 9
2.2. Хранение спермы хряка при плюсовой температуре 15
2.3. Анабиоз и его применение 17
3. Материал и методы проведения исследований 33
4. Результаты собственных исследований
4.1. Изменение физиологических свойств спермы хряка в процессе ее подготовки к замораживанию .. 36
4.2. Физиологическая полноценность половых клеток при различной продолжительности инкубации спермы хряка перед разбавлением средой 52
4.3. Влияние центрифугирования на физиологические показатели качества спермы 56
4.4. Оседание половых клеток во время инкубации спермы 61
4.5. Взаимосвязь метаболических процессов в сперме хряка во время подготовки к замораживанию с физиологическими функциями половых клеток 69
4.6. Применение бокса-термостата для снижения бактериальной загрязненности спермы хряков в период инкубации 81
4.7. Применение антибиотиков после осеменения свиноматок с целью повышения их оплодотворяемости.,86
5. Обсуждение результатов исследований 92
Выводы 102
Предложения производству 104
Список литературы 105
- Особенность обменных процессов в сперме с.-х. животных
- Хранение спермы хряка при плюсовой температуре
- Изменение физиологических свойств спермы хряка в процессе ее подготовки к замораживанию
- Физиологическая полноценность половых клеток при различной продолжительности инкубации спермы хряка перед разбавлением средой
Введение к работе
Актуальность темы. Важной проблемой улучшения питания населения является увеличение производства мяса и мясопродуктов. В успешном выполнении этой задачи большое значение придается свиноводству - наиболее скороспелой отрасли животноводства, что обуславливается биологической особенностью свиней, проявляющейся в высоком их многоплодии, скороспелости, большом убойном выходе. В мировом производстве мяса всех видов свинина занимает ведущее место, составляя 38%. К 1985 г. на промышленных комплексах планируется содержать и откармливать 31 млн. свиней, что составляет около 45% общего планируемого поголовья по совхозам и колхозам. В продовольственной программе СССР до 1990 г. записано: "Больше внимания уделять дальнейшему развитию свиноводства как наиболее скороспелой отрасли животноводства. Обеспечить производство свинины (в убойном весе) в 1885 г. в количестве не менее 6,5 млн. т, и в 1990 году 7-7,3 млн. т".
Главным направлением развития свиноводства является концентрация и специализация производства, перевод отрасли на промышлен -ную основу. К концу II пятилетки в республике будет действовать III государственных межхозяйственных, совхозных и колхозных комплексов по выращиванию и откорму 12, 24, 54 и 108 тыс. свиней в год общей мощностью 2,6 млн, свиней, В 1985 г. эти комплексы должны произвести около 200 тыс, т свинины, что составит 78% от общего объема производства ее в республике. Поэтому важнейшей задачей сейчас является освоение проектных мощностей построенных комплексов.
Одним из узких мест существующих промышленных технологий производства свинины является организация воспроизводства свиней, от которой зависит ритмичность производственного цикла и органи-
4 зация поточного производства продукции. Как показывает опыт работы крупных комплексов, решение этого вопроса крайне необходимо для достижения проектной мощности предприятий, ритмичного получения поросят.
Важным фактором успешного решения этой проблемы является усовершенствование отдельных элементов технологии искусственного осеменения свиней с целью повышения их продуктивности за счет улучшения племенных качеств животных промышленных стад.
В связи с широким практическим применением метода искусственного осеменения на промышленных комплексах большое значение приобретает возможность максимального использования лучших производителей за счет применения замороженной спермы. Однако метод глубокого замораживания спермы хряков мало применяется на практике из-за низкого выхода поросят. Для выявления причин изменения физиологических свойств замороженной сперш необходимо изучение метаболических процессов, происходящих в сперме во время технологической подготовки спермы к замораживанию, и разработать способы повышения оплодотворяемости свиноматок на промышленных комплексах. Углубление знаний физиологии спермы позволит разработать наиболее совершенные способы ее хранения.
Известна исключительная роль энергообразующих ферментов (сук-цинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы) в обеспечении жизненных функций спермиев (Н.П.Шергин, 1945; Е.М.Платов, 1973 и др.).
В доступной литературе есть данные отечественных и зарубежных авторов о положительной связи активности указанных ферментов в сперме с.-х. животных с показателями ее качества и оплодотворяющей способностью спермиев (Н«П»Шергин, 1940 ; н.A.Lardy, P.H.Phillips , 1941 ; В.Г.Семаков, 1961; В.В.Прокопцев, 1969; Л.Г.Мороз и др., 1976). Однако эти исследования были проведены,
5 в основном, на сперле быка, барана и жеребца. Мало изученной является сперла хряка. Отсутствуют данные об активности этих ферментов при разбавлении и хранении спермы. Недостаточно изучена также их активность в зависимости от способов хранения спермы.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлась разработка методов и приемов, обеспечивающих наиболее высокую оплодотворяющую способность спермы хряков и плодовитость свиноматок, содержащихся в условиях промышленных комплексов.
Для достижения указанной цели нами решались следующие задачи:
1. Определить:
изменение физиологических свойств спермы хряка в процессе ее подготовки к замораживанию ;
оптимальное время инкубации спермы при комнантной температуре перед разбавлением средой ;
необходимость центрифугирования спермы перед разбавлением средой ;
скорость оседания спермиев и ее взаимосвязь с качеством эякулятов.
2. Изучить:
влияние концентрации глицерина в разбавителе и длительности выдержки разбавленной спермы перед замораживанием;
влияние способов замораживания и оттаивания на биологическую полноценность спермы.
3. Усовершенствовать:
- метод глубокого замораживания спермы хряков ;
- технологию искусственного осеменения свиноматок.
Новизна исследований: I. Впервые изучались метаболические
процессы в сперме хряков во время подготовки ее к замораживанию, позволившие сделать научно обоснованные предложения о продолжи-
тельности инкубации спермы при комнатной температуре перед разбавлением средой.
Впервые установлено, что в процессе инкубации спермы перед разбавлением имеет место неодинаковая оседаемость (РОС) спермиев в различных эякулятах, зависящая от вязкости спермы, концентрации половых клеток и активности окислительных ферментов.
При разработке метода глубокого замораживания впервые определена скорость адаптации половых клеток к внешним условиям, влияние интенсивности аэрации на оплодотворяющую способность спермиев хряка, а также участие отдельных фракций фосфолипидов в метаболизме при аэробных и анаэробных условиях хранения спермы.
Практическая ценность работы. Разработаны способы, способствующие повышению оплодотворяющей способности спермы хряков, выхода поросят и живой массы поросенка при опоросе путем инкубации спермы в течение 1-2 часов перед разбавлением средой ГХЦС, что способствует повышению оплодотворяемости на 13%, увеличению многопло -дия на 1,8 поросенка.
- Даны предложения по повышению эффективности использования
спермы хряков за счет снижения ее потерь и повышения стерильнос
ти в процессе технологической ее обработки на комплексах с исполь
зованием для инкубации спермы бокса-термостата с автоматической
регуляцией температуры, позволившего снизить бактериальную заг
рязненность спермы на 16,2% и увеличить выживаемость спермиев
на 7%.
- Для оценки качества спермы хряков предложен показатель реак
ции оседания спермиев (РОС) с целью выявления эякулятов с высокой
оседаемостью (редкие эякуляты) и частичное их использование пос-
7 ле седиментации, что особенно необходимо в период недостатка спермы на комплексах.
- Рекомендована санация родополовых путей неоветином после
искусственного осеменения свиноматок с целью увеличения выхода
поросят.
Реализация результатов исследований. Предложенные нами разработки внедрены в совхозах-комбинатах им.бО^летия БССР Борисовского района Минской области и "Сож" Гомельского района Гомельской области производительностью 108 тыс.свиней в год; совхозах "Новый" и "Буцевичи" Минского района Минской области производительностью 24 тыс.свиней в год ; ОПХ "Будагово" Смолевичского района Минской области производительностью 12 тыс. поросят в год.
Публикация результатов исследований.Основные положения диссертации изложены в I информационном листке и 14 статьях, опубликованных в сборниках и журналах.
Апробация исследований.Предлагаемый способ инкубации спермы хряка перед разбавлением средой рассмотрен и одобрен на коллегии МСХ БССР и рекомендован для внедрения на комплексах Белоруссии, а также внесен в новую "Инструкцию по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению с.-х. животных", Колос, М., 1981, с.73.
Основные разработки диссертации доложены, обсуждены и одобрены на:
Всесоюзном совещании - семинаре "Опыт организации воспроизводства и искусственного осеменения свиней в колхозах и межхозяйственных предприятиях" (г. Тернополь, ноябрь 1981).
Координационном совещании (г. Москва, ВИЖ, март 1982).
Расширенном заседании отдела воспроизводства с.-х. животных Белорусского научно-исследовательского института животно-
8 водства (июль, 1983).
- Ученом совете Белорусского научно-исследовательского института животноводства (май, 1984).
Объем работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собствен ных исследований, выводов, рекомендаций производству, списка литературы, который включает 206 источников, в том числе 66 на иностранных языках, содержит 32 таблицы и 8 рисунков.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Особенность обменных процессов в сперме с.-х. животных
В основе жизненных функций растительных и животных организмов лежит метаболизм, характеризующийся двумя противоположными процессами - ассимиляцией и диссимиляцией. Для половых клеток характерен односторонний обмен веществ, а именно - диссимиляция (катаболизм). Спермин животных вне организма не могут усваивать питательные вещества из внешней среды, накапливать энергию и размножаться. Эякулированные спермин способны энергично двигаться. Их движение осуществляется за счет трех биохимических процессов: дыхания, гликолиза и распада аденозинтрифосфата. Дыхание и гликолиз освобождают энергию из питательных веществ, а распад аденозинтрифосфата имеет вспомогательное значение. С одной стороны, он является передатчиком фосфорной кислоты, необходимой для процессов гликолиза и дыхания, а с другой - передатчиком энергии на двигательный аппарат спермиев. Источником энергии, необходимой для жизнедеятельности спермиев, является аденозинтрифосфат (АТ), находящийся в спермиях. Количество его поддерживается на определенном уровне путем ресинтеза из ДЦФ неорганического фосфора. Энергию, необходимую для ресинтеза, спермии получают в процессе дыхания (аэробный процесс) и гликолиза (анаэробный процесс). В анаэробных процессах для движения спермиев необходимы сахара, в аэробных условиях движение происходит при их отсутствии. При наличии Сахаров интенсивность дыхания выше, в этих условиях наряде с дыханием происходит гликолиз.
По характеру обмена веществ сперму сельскохозяйственных животных разделяют на два типа. К первому относят сперму с сильно выраженным гликолизом благодаря большому содержанию в ней угле водов (бараны, быки, козлы, олени), ко второму - сперму хряков, жеребцов, собак. В сперле этих животных мало углеводов поэтому заметный гликолиз отсутствует. Образование энергии для движения спермиев у них происходит в основном в результате дыхания (Н.П.Шер-гин, 1938, 1967 ; И.И.Иванов, 1940 ; H.A.Lardy , P.H.Phillips , 1944;Иида Кун, 1959). ї.мапп ;(I945J, H.M.Dott ,(I958Jустановили, что спермии из эпидидимиса способны расщеплять фруктозу анаэробно, но получаемой энергии недостаточно для осуществления движения спермиев.
В анаэробных условиях хранения сперта хряка клетки также могут расщеплять фруктозу с выделением молочной кислоты, но этот процесс протекает медленнее, чем в сперме быка и барана.
Процессы гликолиза в сперме сельскохозяйственных животных и в мышцах протекают аналогично (И.И.Иванов и С.А.Бурнашева,1943). Они характеризуются расщеплением углеводов ; легче расщепляется глюкоза, затем фруктоза, мальтоза, манноза и в меньшей степени -галактоза и сахароза ( H.A.Lardy , P.H.Phillips , 1941). Конечным продуктом гликолиза является молочная кислота. А.Д.Бернштейн (1933), изучая обменные процессы в сперме быков,заметил, что при ее хранении уменьшается содержание редуцирующих Сахаров и увеличивается количество молочной кислоты. Автор доказал преобладание в ней анаэробного гликолиза. Позже было установлено, что при гликолизе 88-90% фруктозы расщепляется до образования молочной кислоты (Н.П.Шергин, 1956).
Накопление молочной кислоты в сперме быка и барана способствует образованию самопроизвольного естественного анабиоза (В.К.Милованов, Х.Х.Хабибуллин, 1933), при котором жизненные процессы и движение спергаев замедляются. Однако чрезмерное накопление молочной кислоты губительно влияет на половые клет ки (Н.П.Шергин, Т.Н.Несмеянова, М.П.Кузнецов, 1941).
Наряду с анаэробным гликолизом в спермиях наблюдается довольно интенсивный процесс аэробного гликолиза - дыхания (Н.П.Шергин, 1938 ; И.И.Иванов, 1940 ; H.A.Lardy , P.H.Phillips, 1944; J.White, P.Handier , D.stetten , 1954 ; А.И.Коротков, 1952). Дыхание характеризуется более глубоким расщеплением веществ и освобождением большого количества энергии, чем во время гликолиза (Ф.Б.Штра-уб, 1963). При доступе кислорода в сперме протекает так называемое эндогенное дыхание, при котором происходит окисление углеводов, жиров, белков. В спермиях наиболее легко окисляются углеводы, в частности, фруктоза (И.И.Иванов, 1936), липиды расходуются меньше, а белки почти не расходуются (Н.П.Шергин, 1956). При истощении запасов углеводов епермии используют для производства энергии липиды, главным образом, фосфатиди - производные лецитина (И.И.Иванов, 1931; 1936 ; В.А.Белицер, Е.Г.Цыбакова, 1939 и др.).
Как уже указывалось, сперма хряка, жеребца и собаки почти не содержит Сахаров, поэтому в естественных условиях гликолиз в ней отсутствует, а выделение энергии происходит за счет дыхания. Однако при добавлении Сахаров к сперме хряка и жеребца можно вызвать гликолиз, что способствует увеличению выживаемости половых клеток этих животных в анаэробных условиях (И.И.Иванов, 1931).
Дыхание спермиев - это сложный биохимический процесс, характеризующийся расщеплением энергетических субстратов в присутствии кислорода. Дыхание протекает при участии целого ряда окислительных ферментов: дегидрогеназ, в частности, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы. Поэтому важнейшие функции половых клеток (подвижность и оплодотворяющая способность) находятся в зависимости от активности ферментов, осуществляющих эти процессы (Н.П.Шергин, 1942 ; В.Г.Семаков, 1961 ; J.D.Roussel , O.T.Stallcup,
1965 и др.). Наиболее активной является сукцинатдегидрогеназа, а из ферментов терминального окисления - цитохромоксидаза, откры-тая в 1926 году и названная "дыхательным ферментом" (о.Warburg, 1926). Цитохромоксидаза в сперме млекопитающих была исследована многими авторами (Н.П.Шергин, 1940 ; c.A.Zittle , B.J.Zittla, 1942 ; J.Macleod , 1943 ; Е.А.Мамзина, 1968 ; А.Г.Хавинзон, 1967). В частности, Н.П.Шергин (1940) установил, что цитохромоксидаза наиболее активна в сперме хряка. По мнению А.Г.Хавинзона (1967), активность этого фермента в сперме хряка в 6,5 раз выше, чем в сперме быка.
Хранение спермы хряка при плюсовой температуре
Для хранения спермы хряка вне организма при плюсовой температуре необходимы условия, способствующие созданию кислотного анабиоза за счет ослабления дыхательного и усиления гликолитическо-го процессов. Обратимая кислотная инактивация спермиев достигается введением органических и неорганических кислот в сочетании с понижением температуры. Такой метод сохранения спермиев наиболее близок к условиям в эпидидимисе. Из исследований т.Машг (1954) известно, что сперлий хряка теряют подвижность при отсутствии кислорода. Однако подвижность восстанавливается после продувания воздуха через сперму ( C.Polge , 1956; H.Dott , 1958).
Н.П.Шергин (1940) хранил сперму хряка в стеклянном цилиндре и обнаружил дыхание, в основном, только в поверхностном слое. Интенсивность его зависела от концентрации спермы. В нижних слоях дыхание не наблюдалось из-за отсутствия кислорода. Скопление большого количества С0г в нижних слоях сосуда вызвало анабиотическое состояние мужских половых клеток, в результате, подвижность уменьшилась и даже прекратилась, но при взбалтывании значительная часть клеток возобновила движение.
Т.М.Козенко (1940) наблюдал в сосудах с разной поверхностью аэрации более длительную выживаемость половых клеток хряка при ограниченной аэрации. Вследствие усиленных окислительных процессов в поверхностном слое сосуда спермин быстро теряли отрицательный заряд, разрушалась их функциональная целостность и наступала агглютинация (склеивание), в результате, спермин теряли оплодотворяющую способность.
По данным В.К.Миловансва(1977), активная аэрация вредна для спермиев хряка, т.к. она вызывает усиление метаболизма фосфоли пидов, при котором в сперме образуется и накапливается лизоле-цитин - продукт действия лецитиназы, который представляет собой токсин, разрушающий биологические мембраны и вызывающий гемолиз эритроцитов.
В опытах В.Кононова (1976) при аэробном хранении сперш хряка перед замораживанием терялась ее оплодотворяющая способность из-за отсутствия простагландина Е (биологически активного вещества, вызывающего моторику матки и ускоряющего продвижение спермиев к месту оплодотворения). Анаэробная же обработка сперш позволила повысить результативность осеменения замороженной спермой до уровня, получаемого при осеменении свежей спермой (70-80%).
Анабиотическое состояние спермиев при анаэробном хранении К.Н.Кржишковский и Т.Н.Павлов (1924) объясняли проникновением в цитоплазму клетки угольной кислоты. Авторы пишут: "Вероятно, что эффект производится, главным образом, задержанием СОп ; если дать улетучиться ей из спермы,последняя приобретает неблагоприятную щелочность". В дальнейшем стали применять двуокись углерода для насыщения сред перед разбавлением спермы (А.И.Архи-повец 1959, I960; ; K.Wettke , D.Rohloff , 1964). Медленное снижение рН достигалось также введением в среды аскорбиновой, молочной, борной и других кислот (А.И.Архиповец, 1962 ; В.М.Прокопцев, 1963 и др.). Для обратимой кислотной инактивации рекомендовали ЭДГА (Н.Т.Плишко, 1965 ; М.Т.Садовникова, 1966). Двунатриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДГА) подавляет метаболизм (в первую очередь дыхание) за счет глубокой кислотной инактивации, а также смягчает холодовой удар и является антимикробным средством.
Для разработки физиологически-обоснованных рекомендаций длительности инкубации спермы перед разбавлением средами необходимо дальнейшее исследование биохимических и физиологических пока зателей спермы при аэробном и анаэробном хранении, что позволит выявить условия, способствующие повышению оплодотворяющей способности спермы хряка.
Анабиоз (гр. anabiosis - оживление) - это такое "явление в физиологии, когда животный или растительный организм, не проявляющий никаких признаков жизни, при благоприятных условиях восстанавливает нормальную жизнедеятельность" (П.И.Бахметьев, 1900). Остановка жизненных функций при анабиозе не исключает минимальных процессов обмена (Л.К.Лозина-Лозинский, 1937 ; Э.Я.Граевский, 1948).
Л.К.Лозина-Лозинский (1942) указывал на общность причин возникновения анабиоза при высушивании и замораживании. В основе его лежит дегидратация, т.е. уменьшение количества воды в живом веществе (споры, семена растений, насекомые, позвоночные и др.), поэтому решающим фактором выживаемости при анабиозе является количество и структура воды в протоплазме клеток.
Понижение жизненных процессов в различных живых организмах под влиянием неблагоприятных условий внешней среды (холод, засуха) -широко распространенное в природе явление. Еще в 1701 г. известный голландский микробиолог Левенгук ( A.Lewenhock ) наблюдал, как коловратки, сморщенные и неподвижные в результате продолжительного высушивания, приобретали нормальный вид и начинали двигаться как только их опускали в каплю воды. Уже к 1776 г. накопилось немало исследований по охлаждению организмов. Л.Спаланцани открыл способность бабочек и яиц шелковичного червя переносить температуру - 17С на открытом воздухе и -24С в лабораторных условиях. G.Rahm (1923, 1926) обнаружил способность коловраток, тихоходок, спор, семян, бактерий и др. переносить очень низкие температуры (-196).
Глубокое изучение анабиоза было проведено П.И.Бахметьевым (1900, 1902, 1912, 1913), затем Л.К.Лозина-Лозинским (1937, 1948, 1952, 1955), Э.Я.Граевским (1948) и др.
П.И.Бахметьев (1860-1913) доказал, что оживление насекомых при анабиозе, вызванном охлаждением, наступает только при переохлажденном состоянии тканевых жидкостей, а при полном замерзании они погибают вследствие образования кристалликов льда, вызывающих необратимые изменения в клетках и тканях. Исследованиями Н.А.Максимова (1913, 1938) установлено, что растительные клетки также гибнут, в основном, из-за кристаллизации воды, содержащейся в живых тканях. Кристаллы льда, образующиеся в протоплазме, разрывают тонкую оболочку клетки. Морозостойкость растений зависит от концентрации растворенных в клеточном соке веществ ; растворы глюкозы и глицерина повышают холодостойкость. Н.А.Максимов (1908) впервые установил защитное свойство глицерина для растений при их охлаждении.
Во время понижения температуры в зонах от нуля градусов до абсолютного нуля структура воды в организмах может приобретать различное состояние: переохлаждения, кристаллического и стекловидного замерзания.
Изменение физиологических свойств спермы хряка в процессе ее подготовки к замораживанию
Разнообразие методов и технологий замораживания, нестабильность получаемых результатов не позволяют применять на практике замороженную сперму хряков. В литературе широко обсуждается вопрос состава разбавителей и оптимума концентрации глицерина в средах для замораживания спермы хряков. Для каждого состава среды предлагается различный оптимум.
В своих исследованиях мы взяли за основу глюкозо-хелато-цит-ратно-сульфатно-желточную среду. Необходимо было выявить оптимальную концентрацию глицерина, время его внесения в разбавитель и продолжительность выдержки спермы в глицериновой среде, а также определить физиологическое состояние половых клеток в этих условиях хранения.
Исследования провели на 18 еякулятах. После глазомерной оценки каждый эякулят делили на 10 частей и разбавляли средой ГХЦС,содержащей от 0 до 5,0% глицерина. Разбавленную сперму сохраняли при температуре -ь2 - -»4С в течение 4 ч, затем замораживали.
Установлено (табл. I, рис. I), что еще до замораживания подвижность спермиев при концентрации глицерина от 0,5 до 1% повышалась до 7,3 - 7,48 балла, без глицерина была 7 баллов. Значительное понижение их подвижности наступало в образцах спермы при разбавлении средой, содержащей 2,5 ; 4,0 и 5,0% глицерина.
Во время замораживания спермы наблюдалась несколько иная картина. Самая низкая подвижность спермиев после оттаивания была в среде без глицерина - 1,5 балла, примерно такая же - при содержании 0,5% глицерина, при увеличении его до 1-1,5% подвижность спермиев возросла до 3,1-3,5 балла; оптимальная подвижность (4 балла) отмечена при содержании в разбавителе 2% глицерина. В данном варианте устойчивость спермиев к замораживанию была наивысшей - 56%. Таблица I. Влияние концентрации глицерина в среде на устойчивость спермиев к замораживанию ( n = 18) Концентрация глицерина, % о : о,5:1,о -1,5:2,0 )2,5-3,0 :з,5 :4,о:5,о І " Показатели ; і L Подвижность спермиев до замораживания, ЧІаллн 7,0 7,3 7,48 6,9 7,1 6,5 7,3 7,3 6,7 6,8 Подвижность спермиев после оттаивания, баллы 1,5 1,7 3,1 3,5 4,0 3,0 3,3 2,9 2,5 2,7 Устойчивость спермиев к заморажива- _ нию, % 21,4 23,2 41,4 50,0 56,0х 46,1 47,9 39,7 37,3 39,2 Примечание: ххх - Р 0,001, хх - Р 0,01, х - Р 0,05. При концентрации глицерина в оттаянной сперме 4-5% подвижность половых клеток была 2,5 и 2,7 балла.
Представленные данные свидетельствуют о том, что половые клетки хряка лучше выживали после замораживания-оттаивания, если в разбавителе содержалось 2% глицерина. Такую концентрацию мы брали во всех последующих опытах.
Результаты замораживания спермы хряков зависят не только от концентрации глицерина, но и от времени его введения в разбавитель, В этой связи нами определялось влияние глицерина на качест во спермы хряка при разном времени введения его в разбавитель, выявлялось оптимальное время инкубации сперш хряка, разбавленной средой с содержанием 2% глицерина, при температуре 2-4С.
Чтобы определить оптимальное время внесения глицерина в разбавитель нами был проведен специальный опыт. Полученный эякулят делили на две части, одну - разбавляли средой ГХЦС, другую -ГХЦСП. Затем разбавленную сперму делили еще на две части, в одну из них добавляли глицерин в момент разбавления спермы, в другую - вносили его непосредственно перед замораживанием.
При добавлении глицерина в момент разбавления спермы средой ГХЦС абсолютный показатель выживаемости спермиев после оттаивания составил 8,38 + 0,75, при внесении глицерина перед замораживанием - 7,68+1,24; средой ГХЦСП соответственно 13,40+1,98 и 11,72 + 0,93 единиц. Самая высокая выживаемость спермиев после оттаивания была в глюкозо-хелато-цитратно-сульфатной среде с полиглюкином, если глицерин вводили в момент разбавления спермы средой. По-видимому, половым клеткам необходимо адаптация с глицерином.
Во втором опыте выявляли оптимальную продолжительность времени выдержки спермы в среде с глицерином. Для этого эякулят (после оценки и 2-часовой выдержки при температуре +18С и центрифугирования) разбавляли глюкозо-хелато-цитратно-судьфат-ной средой, содержащей 2% глицерина. Разбавленную сперму разделяли на три части и выдерживали в холодильнике (+2 - +4С) в течение 3, 4 и 4,5 ч, затем расфасовывали по 20 мл в полиэтиленовые пакеты и замораживали на поверхности жидкого азота.
Установлено, что инкубация спермы в среде с глицерином при температуре +2, +4С также повлияла на подвижность спермиев после оттаивания (табл. 2).
Физиологическая полноценность половых клеток при различной продолжительности инкубации спермы хряка перед разбавлением средой
По данным большинства исследователей, при замораживании спермы хряков значительно снижается оплодотворяющая способность половых клеток и уменьшается выход поросят на один опорос (Н.Го-лышев, В.Кононов, Э.Хачапуридзе, 1977; Н.П.Ющенко, 1980; Ь.Johnson et al. 1981). В наших опытах оплодотворилось лишь 33% свиноматок, осемененных замороженной спермой. Для выяснения причин снижения физиологической полноценности замороженной спермы необходимо было исследовать в какой момент оно происходит. По большинству методик перед замораживандам свежеполученный эякулят выдерживают в неразбавленном виде при комнатной температуре в течение 2 ч (С.Сердюк, А.Зверева, Л.Россоха, 1980 ; Я.Козумп- -лик, Э.Кудлач, 1983), после выдержки отделяют плазму от половых клеток центрифугированием ( В.СгаЪо , S.Einarsson 1971) и разбавляют осадок средой, содержащей криопротектор.
Мы изучали влияние продолжительности инкубации спермы хряка перед разбавлением средой ГХЦС на физиологическую полноценность половых клеток. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение различных сроков. Полученную сперму после общей оценки делили на четыре равные части. Одну разбавляли средой ГЩС через минут после получения эякулята (контроль), а три другие разбавляли такой же средой через I, 2, 3 ч. В каждом образце определяли рН, активность сукцинатдегидрогеназы и выживаемость при +38С, затем разбавляли средой и проводили осеменение. Для осеменения подбирали свиноматок-аналогов. Животных опытных групп осеменяли спермой после I, 2, 3 часовой инкубации, контрольный после 20-30-минутной инкубации (по инструкций). Осеменение проводили по методу ВЙЖа, в дозе содержалось 3-5 млрд. подвижных спермиев при объеме вводимой спермы 100-120 мл. Результаты осеменения учитывали по опоросам.
Данные опыта показали, что время разбавления эякулята средой ГЩС с момента его получения оказывает существенное влияние на оплодотворяющую способность спермиев (табл. 8).
Самой низкой (63,2%) она была в контроле при 30-минутной инкубации и наивысшей (89,4%) - при 3-часовой. Этот срок выдержки спермы перед разбавлением средой показал лучшие результаты. На высоком уровне сохранялась оплодотворяющая способность спермы также и при I и 2-часовой инкубации - соответственно 78,9 и 73,6%. Хотя при 3-часовой инкубации были получены лучшие результаты (89,4%), однако в условиях промышленного комплекса на боль шом поголовье применение 3 часовой инкубации малоприемлемо из-за трудностей, связанных с технологическим процессом осеменения свиноматок и распорядком дня. Поэтому при массовом осеменении мы рекомендуем 1-2-часовую инкубацию.
Производственная проверка на 162 свиноматках показала, что выдержка спермы при комнатной температуре в течение 1-2 ч перед разбавлением средой увеличивает оплодотворяемость свиноматок на 13%, многоплодие на 1,8 поросенка. При этом получено на 149 поросят больше, чем в контроле (табл. 9). Различия статистически достоверны (Р 0,05). В пересчете на 100 маток дополнительно получено 180 поросят.
Эта закономерность отмечена во все сезоны года (табл. 10), однако в весенний и осенний периоды разница между опытной и контрольной группами была более значительной. В опытной группе получено поросят больше, чем в контрольной, осенью-на 63 головы, весной - на 35, зимой - на 31 и летом - на 20 голов. Увеличение количества поросят было в основном за счет более высокой оплодотворяющей способности сперш, особенно осенью, весной и зимой. Детом получено в опытной группе на 20 поросят больше, чем в контрольной. Результаты проведенных опытов свидетельствуют о благоприятном влиянии на оплодотворяющую способность половых клеток хряка выдержки свежеполученного эякулята при комнатной температуре в течение 1-2 ч с последующим разбавлением средой ГХЦС. В опытах не подтвердилось мнение о том, что оплодотворяющая способность спермы может снизиться еще до замораживания во время инкубации ее в неразбавленном виде за счет накопления продуктов метаболизма. Во время инкубации спермы, по-видимому, наступает адаптация половых клеток к новым внешним условиям, способствующая увеличению их жизнеспособности, что необходимо учитывать в производственных условиях на промышленных комплексах, где применяют искусственное осеменение свиноматок.
Экономическая эффективность инкубации сперш перед разбавлением средой была проверена в совхозе-комбинате им.бО-летия БССР Борисовского района Минской области. При искусственном осеменении свиноматок спермой после инкубации получено дополнительно 184 головы приплода на 100 свиноматок со средней массой одного поросенка при рождении 1,2 кг и дополнительно в количестве 2,2 ц (184 головы х 1,2 кг = 220 кг, или 2,2 ц)свинины}. Реализационная цена I ц свинины за 1982 г. составила 201 руб. Следовательно, от 100 свиноматок (с учетом двух опоросов в год) получено 884 руб. (201 х 2,2 ц х 2 опороса = 884 руб.). Экономический эффект от предлагаемого метода инкубации спермы хряка перед разбавлением средой ГХЦС составил 884 руб. на 100 осемененных свиноматок.
