Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Морфофизиологические, биохимические и биомеханические свойства эритроцитов периферической крови 8
1.2 Физиологические аспекты трансфузий эритроцитарных компонентов 18
1.3 Физиологическое обоснование выбора метода определения механической резистентности эритроцитов 32
2. Собственные исследования 44
2.1 Материалы и методы исследования 44
2.2 Физиологическая оценка популяционного состава и механической резистентности эритроцитов капиллярной и венозной крови доноров 55
2.3 Физиологическая оценка популяционного состава и механической резистентности эритроцитов донорской крови в различные сроки хранения 73
2.4 Физиологическая оценка популяционного состава и механической резистентности эритроцитов венозной крови доноров разного пола 81
3. Обсуждение полученных результатов 98
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список литературы 107
Приложение 127
- Морфофизиологические, биохимические и биомеханические свойства эритроцитов периферической крови
- Физиологические аспекты трансфузий эритроцитарных компонентов
- Материалы и методы исследования
- Физиологическая оценка популяционного состава и механической резистентности эритроцитов капиллярной и венозной крови доноров
Введение к работе
Актуальность темы. За исторически короткий промежуток времени переливание крови прошло путь от привлекательной, но сопряженной с риском и потому неординарной методики лечения до самостоятельной научной дисциплины трансфузиологии — науки об управлении функциями организма с помощью парентерального введения органических и неорганических трансфузионных сред (Б.Е. Мовшев, 2003).
В настоящее время, в трансфузиологии уделяется большое внимание обеспечению не только безопасности, но и лечебной эффективности трансфузионных сред. Ведь их качество в конечном итоге обеспечивает и качество лечения больных, позволяет сохранить жизни многим людям с тяжелыми, подчас неизлечимыми болезнями.
Как известно, в процессе хранения консервированных эритроцитов сродство гемоглобина к кислороду увеличивается, что предполагает снижение способности эритроцитов отдавать тканям организма кислород (B.C. Ярочкин, 1993). В связи с этим особо важное значение приобретает процесс естественного восстановления нарушенной при хранении кислородтранспортной функции донорских эритроцитов, что в значительной степени определяет лечебную эффективность консервированных эритроцитов при лечении острых гипоксических состояний (СМ. Виноградов, 1987).
Эритроциты как один из компонентов крови, отвечающий за ее кислородтранспортную функцию, широко используются в клинической практике. Одновременно с введением в практику трансфузий возникли проблемы консервирования (хранения) и контроля качества эритроцитов. Методы консервирования и * контроля качества эритроцитов совершенствовались по мере развития фундаментальных представлений о биохимии и физиологии клеток вообще и эритроцитов в частности (Б.Е. Мовшев, 2003).
Разработка и изучение методов консервирования эритроцитов невозможны без адекватной оценки их качества (функциональной полноценности). В связи с этим очень важным представляется поиск способов и методов решения двух основных проблем переливания крови — проблемы консервирования (хранения) и контроля качества эритроцитов. Одной из задач консервирования крови является создания условий, препятствующих разрушению физико-химической структуры эритроцитов и способствующих поддержанию процессов обмена веществ, необходимых для жизнедеятельности красных клеток (Ю.К. Новодержкина, 2004). В настоящее время разработаны и внедрены в широкую практику консерванты крови и ее компонентов, позволяющие достаточно длительное время сохранять последние и переливать по мере необходимости.
Как известно, донорская кровь с первых секунд пребывания вне сосудистого русла подвергается сложным морфологическим, биохимическим, реологическим, иммунологическим, функциональным изменениям (Г.И. Козинец, 1997). Большое значение имеет также возможность оценки качества консервированных эритроцитов непосредственно перед трансфузией (Б.Е. Мовшев, 2003).
В результате представляется актуальным оценка пригодности донорской крови к переливанию с использованием метода исследования биомеханических и реологических свойств эритроцитов по А.А.Ненашеву и соавторам (1983, 2006). Большое значение имеет также возможность оценки качества консервированных эритроцитов непосредственно перед трансфузией.
Поэтому целью исследований явилась физиологическая оценка структурно-функциональной полноценности эритроцитов в различные сроки хранения консервированной донорской крови.
Исходя из обозначенной цели, для решения были поставлены следующие задачи исследований:
1. Изучить влияние вибровоздействия на количественный и качественный состав эритроцитов консервированной крови в различные сроки хранения.
Провести физиологическую оценку популяционного состава и механической резистентности эритроцитов капиллярной и венозной крови доноров.
Исследовать структурно-функциональную полноценность эритроцитов донорской крови в различные сроки хранения.
Изучить морфофизиологическую полноценность консервированной крови доноров, разделенных по половому признаку.
Составить научно-обоснованные рекомендации по профилактике отклонений при хранении донорской крови.
Научная новизна. Впервые научно обоснована морфофизиологическая полноценность эритроцитов консервированной донорской крови в различные сроки хранения с использованием метода исследования механической резистентности эритроцитов по А.А. Ненашеву и соавт.
Дана комплексная характеристика количественного и качественного состава венозной и капиллярной крови, позволяющая объективно оценить полноценность их эритроцитов.
Проведено морфофизиологическое сравнение популяционного состава и механической резистентности эритроцитов венозной крови доноров разного пола.
Разработаны научно-обоснованные рекомендации о физиологически-обоснованных сроках использования консервированной донорской крови.
Научная новизна полученных результатов исследований подтверждена патентом РФ на полезную модель № 63544.
Практическая значимость. Предложен оригинальный метод для оценки морфофизиологических, биохимических и биомеханических свойств эритроцитов консервированной донорской крови.
Разработаны практические предложения для станций переливания крови, позволяющие контролировать состояние эритроцитов хранящейся крови на предмет пригодности к переливанию.
Реализация результатов исследований. Материалы диссертации включены в правила работы с донорами на Самарской областной клинической станции переливания крови и используются при контроле сроков сдачи крови доноров на хранение и определении сроков выдачи консервированной крови в лечебные учреждения. Материалы диссертации используются при проведении лекционных и практических занятий на кафедре госпитальной терапии с курсом трансфузиологии ГОУ ВПО «СамГМУ» Росздрава и на кафедре биологической химии ГОУ ВПО «СамГУ». Также материалы диссертации внедрены в курс обучения по экологическим программам НОУ УЦ «Самара», а также используются в работе экоаналитической лаборатории при обследовании работающих в экологически небезопасных условиях.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI» (Москва, 2006), V международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2006), V Международной научно-практической конференции «Новые медицинские технологии в охране здоровья здоровых, в диагностике, лечении и реабилитации больных» (Пенза, 2007), ГХ Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием «Королевские чтения» (Самара, 2007).
Материалы и основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном заседании кафедры физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Самарская ГСХА» (Самара 2010).
7 Научные положения, выносимые на защиту:
Имеется взаимосвязь между количественно-качественными характеристиками эритроцитов и методом определения их функциональной активности.
Выявлена причинно-следственная связь между сроками хранения консервированной крови и биомеханическими показателями венозной и капиллярной крови доноров.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 1 работа в издании, определенном ВАК России для докторских и кандидатских диссертаций, 1 патент РФ на полезную модель.
Структура и объем диссертации. Работа включает следующие разделы: введение (5 с), обзор литературы (36), собственные исследования (54), обсуждение полученных результатов (7), выводы (1), практические рекомендации (1), список литературы (20), приложение (1).
Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного исполнения, содержит 10 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 205 источников, в том числе 86 зарубежных.
Морфофизиологические, биохимические и биомеханические свойства эритроцитов периферической крови
Эритрон - часть кроветворной системы организма, которая непосредственно связана с выработкой красных клеток крови, их созреванием, функционированием, старением, гибелью, а также с регуляцией этих процессов. Эритрон не является каким-либо одним органом, а рассеян по всей кроветворной ткани костного мозга. Эритрон является одной из самоподдерживающихся систем организма (Т.С. Истаманова, 1973; O.K. Гаврилов, 1985).
Эритроциты - это безъядерные клетки, имеющие форму двояковогнутых дисков с диаметром в среднем 7,5-8,4 мкм при определении его в изотонической среде (А.Л. Чижевский, 1959; А.И. Воробьев 2001). Общая площадь поверхности эритроцитов взрослого человека составляет 3 800 кв.м. Прямым способом оценки размеров эритроцитов служит метод измерения объема этих клеток. Могут быть случаи, когда имеется несоответствие между величиной диаметра эритроцитов и величиной их объема. Так, при врожденной гемолитической анемии диаметр эритроцитов уменьшен, и на этом основании ее относят к группе микроцитарных анемий. При нарушении эритропоэза происходит сдвиг кривой нормального распределения (кривой Прайс-Джонса) вправо, наблюдается так называемый макроцитоз, т.е. значительное увеличение числа эритроцитов с диаметром, превышающим 8 мкм. При перницитозной анемии диаметр отдельных эритроцитов (мегалоцитов) иногда превышает 12 мкм. Однако определение среднего объема эритроцитов дает нормальные и даже повышенные цифры (до 128 фл), что связано с явлениями сфероцитоза (И.А. Кассирский, 1970). Следовательно, измерение лишь одного показателя (только диаметра эритроцитов или только их объема) не может заменить собой полностью исследования другого (Д.И. Гольдберг, 1969). По мнению И.М. Тищенко (1989), приоритет следует отдавать все-таки исследованию распределения эритроцитов по объему и измерению их среднего объема. Объем эритроцитов, так же, как и их диаметр, подвержен определенным физиологическим колебаниям. Нижняя граница нормы составляет 75-76 фл (мкм3), верхняя -95-96 фл (мкм3) (А.Л. Чижевский, 1959; И.М. Тищенко, 1989; СМ. Алабова, 1995; П.А. Воробьев, 1997; и др.). В других публикациях указывается иная величина среднего объема эритроцитов в цельной крови у взрослых - 80-100 фл (мкм ) (И.М. Тищенко, 1989). Толщина эритроцита в центральной части 1 мкм, по периферии 2,4 мкм (Е. Ponder, 1947).
О плазматической мембране эритроцитов человека известно гораздо больше, чем о любой другой мембране эукариотической клетки. Эритроцит не имеет внутренней строго упорядоченной структуры, относительно гомогенное содержимое ограничено высокоструктурированной мембраной, которая служит поверхностью раздела с плазмой. Мембрана эритроцита представляет собой сложный липидный бислой и содержит большое количество различных белков. По своему строению мембрана эритроцита принципиально не отличается от мембран ядросодержащих клеток организма. Однако цитоскелет эритроцита отличается от цитоскелета этих клеток. У эритроцита есть только поверхностный цитоскелет, который представляет собой устойчивое к действию детергентов соединение белков друг с другом и с мембраной, образующее своеобразную сеть вдоль внутренней поверхности плазменной мембраны. В отличие от многих других клеток внутреннего цитоскелета в виде проходящих через клетку микротрубочек и микрофиламентов, соединяющих плазменную мембрану и компоненты цитоплазмы, у эритроцита нет, как нет и создающих этот цитоскелет белков тубулина и виментина. Одним из главных белков, образующих сеть на внутренней поверхности мембраны, является спектрин. Кроме спектрина, эту сеть образуют F-молекулы актина. У пересечения спектрина с актином и в местах их соединения находится белок «band-4.1». Спектрин соединяется с мембраной клетки через белок анкирин — «band-2.1» и синдеины - «band S 2.2-2.6». У места соединения анкирина с мембраной находится белок «band-З» (А.И. Воробьев, 2001).
Мембрана эритроцита представляет собой пластичную молекулярную мозаику, состоящую из белков, липопротеинов и гликопротеинов и, возможно, чисто липидных участков. Положение различных частей мембраны по отношению к форме клеток не является фиксированным: часть мембраны, которая в данный момент расположена в центре диска, в другой момент может оказаться на краю. Под влиянием постоянных сильных воздействий кровотока форма эритроцитов изменяется. Способность эритроцита изменять свою форму в ответ на деформирующее усилие определяет его ригидность или деформируемость (Г.Н. Карабанов, 1984; Л.Н. Катюхин, 1995). В норме эритроцит человека обладает способностью к значительной деформации (И.Л. Лисовская, 1999).
Деформируемость любой клетки зависит от различных мембранных и цитоплазматических факторов. Внутреннее содержимое эритроцита представляет собой ньютоновскую жидкость. Вязкость ее невысока и незначительно влияет на ригидность клетки в целом. Деформируемость эритроцита больше всего зависит от свойств его мембраны. Эластические свойства мембраны характеризуют ее сопротивление статической деформации (Л.Н. Катюхин, 1995; Г.И. Козинец, 1997; И.Л. Лисовская, 1999). Важную роль в способности к деформации эритроцита играет мембранный цитоскелет (главным образом спектрин). Одним из подтверждений этого служит факт зависимости между реологическими свойствами эритроцитов и особенностями строения цитоскелета у больных наследственными анемиями, вызванными мутациями 20q- и 13q-. Вязкость крови таких больных значительно увеличена, деформируемость эритроцитов снижена. Структурная аномалия спектрина у таких больных заключается в нарушении ассоциации димер-димер в эритроцитарной мембране (N. Maeda, 1994). Имеется слабая корреляция между величиной модуля изгиба мембраны и нарушениями, связанными с мембранным протеином полосы 4.1 и с числом мест связывания белка анкирина (Л. Н. Катюхин, 1995). В деформируемости эритроцита играет роль не только цитоскелет, но и липиды мембраны, в частности, соотношение фосфолипидов и холестерина, которое определяет текучесть мембраны у всех клеток вообще (А.В. Мазурин, 1994). Это свойство также может иметь отношение к стойкости мембраны эритроцита. Текучесть клеточных мембран меняется при их отмывании, что связано с изменением их липидного состава. Этот феномен имеет место in vivo, при циркуляции эритроцита в селезенке, в красной пульпе, где происходит деплазмирование клеток, в почках в условиях «чудесной кровяной сети» и реабсорбции жидкости (А.И. Воробьев, 2001).
По способности эритроцитов к деформации можно судить об их функциональном состоянии (М.А. Котовщикова, 1992). Деформируемость эритроцитов зависит также от отношения площади поверхности к объему клетки (A.M. Чернух, 1984; И.Л. Лисовская, 1999), от формы клетки, от осмотического давления и кислотно-щелочного состояния плазмы крови, от напряжения сдвига в сосуде (Г.Н. Карабанов, 1984). Уменьшение деформируемости эритроцитов приводит к увеличению энергетических потерь кровотока (СМ. Алабова, 1995).
Физиологические аспекты трансфузий эритроцитарных компонентов
За исторически короткий промежуток времени переливание крови прошло путь от привлекательной, но сопряженной с риском и потому неординарной методики лечения, до самостоятельной научной дисциплины трансфузиологии — науки об управлении функциями организма с помощью парентерального введения органических и неорганических трансфузионных сред. Если в начале XX века в качестве трансфузионной среды рассматривалась кровь и только кровь, то по мере углубления наших знаний переливание цельной крови все более уступало место переливанию ее компонентов, производных, растворов солей, коллоидов, аминокислот, жировых эмульсий и т.д.
Многообразие трансфузионных сред расширилось за счет костного мозга и других кроветворных тканей, биологических субстратов и лекарственных препаратов (Б.Е. Мовшев, 2003).
Переливание компонентов аллогенной крови наряду с лечебным эффектом несет риск осложнений. Мировой тенденцией является рестриктивная тактика назначения компонентов крови — только по показаниям, только в ситуации, когда без переливания крови клинический прогноз ухудшится (К. Sazama, 2007).
На протяжении столетия показания к гемотрансфузии определялись эмпирически. Практика назначения компонентов крови зависит от традиций организации, персонального опыта врача и в отечественных нормативных документах определена в общем виде, допускающем широкую трактовку (Инструкция по применению компонентов крови, утв. приказом Минздрава России от 25.11.2002 № 363; Е.Б. Жибурт, 2007; A. Pereira, 2007).
Огромный клинический опыт показал, что нецелесообразно переливать цельную кровь для лечения патологических состояний, вызванных дефицитом тромбоцитов, лейкоцитов, свертывающих факторов плазмы. Требуемый лечебный эффект возможен лишь при трансфузии больших доз свежезаготовленной крови, а это сопряжено с риском тяжелых осложнений. В зависимости от дефицита тех или иных клеточных элементов крови или белков плазмы больной должен получать трансфузии тех компонентов крови или белковых препаратов, недостаточность которых должна быть восполнена. (В.А. Инглиш, 2006).
В условиях современной клиники, располагающей достаточным арсеналом трансфузионных сред, действует правило: нет показаний к переливанию цельной крови. Более того, в ряде случаев переливание цельной крови представляет определенную опасность: больной получает, помимо эритроцитов, нежелательные для него лейкоциты, тромбоциты, белки, изоантитела и т. д., т. е. переливание цельной крови приводит к изоиммунизации, образованию антител к клеточным элементам и антигенам белков плазмы. (J. Boldt, 2006). В последующей жизни больного при необходимости повторной гемотерапии это увеличивает риск тяжелых постгрансфузионных реакций. Вместо ожидаемого лечебного эффекта трансфузия может оказать отрицательное действие. (В.Н. Шабалин, 1987). Эритроцитный концентрат может и должен рассматриваться как средство выбора для коррекции нарушений циркулирующего эритрона с клиническими признаками тяжелой гемической гипоксии у больных и раненых как в мирное время, так и в любых чрезвычайных условиях. Внедрение эритроцитоконцентрата в практику способствовало успешному решению вопросов профилактики синдрома массивных трансфузий и связанного с переливанием крови острого респираторного дистресс-синдрома, а также позволили снизить частоту индивидуальных подборов у лиц, нуждающихся в длительной гемотрансфузионной терапии (СВ. Сидоркевич, 2000).
Для коррекции анемического синдрома клиницисты зачастую вынуждены применять трансфузии эритроцитарных компонентов донорской крови. Однако, по данным литературы, единый подход к определению показаний для назначения эритроцитарных компонентов крови зачастую отсутствует (В.М. Городецкий, 2002; А.П. Зильбер, 1999; В.В. Мороз, 2002; А.Г. Румянцев, 1997; Р.Е. Marik, 2001; Е.С. Rossi, 1994).
Хотя значительное количество трансфузий выполняется по показаниям, существуют исследования, документирующие выполнение трансфузий без необходимости. Количество необоснованных трансфузий варьирует, по данным разных авторов, от 18 до 57% (A Report by the American Society of
Anesthesiologists, 1996; A.T. Brandts, 1994; P.B. Hasley, 1994; D.G. Johnston, 1978; A. Thompson, 1991). L. Stehling (1987) обнаружили, что использование компонентов донорской крови анестезиологами основывается больше на стремлении следовать привычной схеме лечения, чем на конкретных данных. В исследовании S. Salem-Schatz (1990) сделан вывод о широко распространенном у врачей дефиците представлений о риске, связанном с трансфузиями и об определении показаний к гемотрансфузиям. В то же время В. Mozes (1989) отметили тенденцию о переоценке риска при отказе от трансфузий.
Первоначально показания к использованию цельной крови и эритроцитарной массы были достаточно широкими: помимо восполнения кровопотери, трансфузии эритроцитов рекомендовались для лечения практически всех анемических состояний, сепсиса, инфекционных заболеваний, алиментарной дистрофии, с целью улучшения трофики и заживления ран. У хирургических больных в определении показаний к гемотрансфузии главным критерием считалось наличие операционной кровопотери (Б.В. Петровский, 1979). Объем переливаемой крови и эритроцитарных компонентов определялся формулой "капля за каплю" (В.А. Климанский, 1977).
В конце 70-х и в 80-е годы прошлого столетия решение о трансфузии эритроцитов в основном базировалось на правиле " 100/30", что определяло необходимость трансфузии, если концентрация гемоглобина у больного снижается до уровня менее 100 г/л и величина гематокрита составляет менее 30% (А.И. Воробьев, 2001; А.С. Ермолов, 2002; L.C. Stehling, 1994).
Материалы и методы исследования
Во время исследовательской работы было обследовано 115 доноров Самарской областной станции переливания крови (81 мужчин и 34 женщины) (схема опытов). Исследования проводили с применением следующих методов: 1) гематологические методы - метод определения механической резистентности эритроцитов.
Исследование с применением данного метода проводилось при закладке крови на хранения, в середине и в конце срока хранения. В качестве консерванта использовался «Глюгицир». Также проводилось исследование капиллярной крови из пальца, взятой у донора в день забора крови и стабилизированной гепарином.
Метод определения механической резистентности эритроцитов предложен А. А. Ненашевым с соавт. еще в 1983 году. В 1988г. А.А.Ненашев с соавторами получают второе авторское свидетельство, где расширяются возможности устройства для данного метода. В 2006 году был получен патент на полезную модель, где была предложена улучшенная модель устройства.
Величина механической резистентности позволяет косвенно судить о функциональных возможностях эритроцитов крови в норме, при различных физиологических состояниях и при патологии. Эта величина, как и способность транспортировать кислород, определяется возрастом эритроцитов, находящихся в циркуляции, состоянием их мембраны и обменных процессов, происходящих с участием ферментов мембраны: при снижении активности Ыа+-К+-АТФазы (например, при старении эритроцита) эритроцит начинает накапливать натрий и воду, и, увеличиваясь в объеме, превращается в макроцит-сфероцит (или овалоцит). У таких клеток также значительно меняются вязко-эластические свойства клеточной мембраны в сторону снижения текучести мембраны и увеличения жесткости клетки. Они в первую очередь разрушаются при прохождении «узких мест» в селезенке и других органах вследствие потери деформабельности.
С целью изучения механической резистентности определяется число эритроцитов капиллярной крови до вибронагрузки и после нее. При включении возбудителя колебаний в пробе крови распространяются колебания заданной амплитуды и частоты, воздействующие на эритроциты, которые под действием нагрузки начинают разрушаться (гемолизироваться). При этом следует учитывать, что при вибронагрузке происходит не только гемолиз эритроцитов, преимущественно старых, но и фрагментация наиболее молодых, уплощенных эритроцитов, которые имеют достаточно большой объем клетки и высокую текучесть мембраны. При этом из одной клетки образуются 2-4 микроцита, которые способны выполнять газотранспортную функцию и проходить через мельчайшие капилляры. Во время вибрации может происходить также агрегация (склеивание, слияние) эритроцитов.
Для ускорения подсчета эритроцитов, для стандартизации метода (сравнения получаемых результатов), а главное, для получения цитометрических кривых (ЦМК) (% клеток в зависимости от их объема) используется аппарат «Laborscale» (PSL—1) с блоком «Анализатор» (PSA—1) венгерской фирмы MEDICOR. В основе работы прибора лежит кондуктометрический принцип, основанный на законе Ома. Кондуктометрический принцип состоит в том, что каждая частица, проходя через микроотверстие измерительного капилляра, изменяет сопротивление между электродами, находящимися на разных концах (по разные стороны) от микроотверстия, причем величина этого изменения прямо пропорциональна объему частицы. При этом между электродами возникает импульс напряжения, амплитуда которого, таким образом, также пропорциональна объему клетки (по закону Ома при постоянной силе тока). Эти импульсы напряжения и регистрируются прибором. В процессе измерения непрерывно происходит обработка импульсов соответственно их размерам, затем, после окончания измерения, на экране появляется распределенный по 64 каналам результат анализа.
Подготовку к работе и работу с прибором осуществляют согласно инструкции по эксплуатации, прилагаемой к прибору.
Этапы определения числа эритроцитов в капиллярной крови при изучении их механической резистентности (идентичны для исходного образца и образца крови, подвергнутого вибрации): 1. Приготовление и фильтрация разводящего раствора. 2. Забор крови. 3. Разведение крови. 4. Подготовка аппарата к подсчету эритроцитов. 5. Подсчет эритроцитов. 6. Получение графика (гистограммы) распределения частиц по объему (цитометрической кривой). 1. Приготовление и фильтрация разводящего раствора. Ввиду значительной концентрации форменных элементов и вязкости цельная кровь для исследования на приборе не пригодна. Поэтому ее нужно смешать с разводящим раствором в строго определенных соотношениях. К разводящему раствору предъявляется ряд требований: - он должен хорошо сохранять эритроциты, не нарушая их прижизненных структур и не меняя их объем; - он должен быть тщательно очищен от любых механических примесей; - он должен хорошо проводить электрический ток; - он не должен содержать химикатов, разрушающих металлические электроды или оставляющих налет на стеклянных поверхностях рабочих элементов прибора. Обычно используется физиологический (изотонический) раствор хлорида натрия (0,9 %) (готовится в аптеках для внутривенных инфузий и расфасовывается в стеклянные флаконы различной емкости). Он стерилен, достаточно хорошо очищен и не требует фильтрации и проверки перед использованием. 2. Забор крови. Кровь в количестве 0,02 мл берут по обычной методике с соблюдением правил асептики и антисептики, в резиновых перчатках, с соблюдением требований приказов МЗ по профилактике ВИЧ-инфекции.
Кровь забирается (непосредственно, капилляром Сали или Панченкова) в достаточном количестве в пластиковую лунку, предварительно обработанную моющим раствором и спиртом. Перед забором крови лунку промывают раствором гепарина (в 1 мл 5000 ЕД) для инъекций из шприца и дают высохнуть несколько минут (или протирают поролоном или мелкопористой резиной). В дальнейшем из этой лунки кровь в количестве 20 мкл (0,02 мл) пипеткой Сали, соединенной резиновой трубкой с грушей и промытой предварительно раствором гепарина, забирают для проведения исходного анализа (до вибрации), а. также переносят в том же количестве гепаринизированной пипеткой Сали в ячейку аппарата для вибрации.
Физиологическая оценка популяционного состава и механической резистентности эритроцитов капиллярной и венозной крови доноров
Во время проведения исследования у испытуемых доноров, совместно с забором венозной крови на хранение, бралась кровь из пальца, стабилизировалась гепарином и подвергалась вибровоздействию. Сравнение эритроцитарных показателей капиллярной крови и венозной крови на различных сроках хранения предоставляет определенный интерес.
В таблице 2 и на рисунке 1 приведены показатели эритроцитов донорской крови в 1-ый день хранения и капиллярной крови.
Количество эритроцитов оказалось достоверно (р 0,05) больше в капиллярной крови, чем в венозной крови, исследованной в момент закладки на хранение (4,13±0,06 млн/мкл в венозной крови по сравнению с 4,70±0,06 млн/мкл в капиллярной). Также достоверно различие в процентном содержании микроцитов и макроцитов. Микроцитов содержится больше в венозной крови (38,41± 1,52% в венозной крови и 30,96±1,60% в капиллярной крови), в то время как макроциты преобладают в капиллярной (20,62±1,09% в венозной крови и 27,08±1,31% в капиллярной крови).
Примечание - 1 - капиллярной крови до вибровоздействия; 2 - капиллярной крови после вибровоздействия; 3 венозной крови в 1-ый день хранения до вибрации; 4 - венозной крови в 1-ый день хранения после вибрации. Процентное содержание нормоцитов незначительно преобладает в крови, взятой из пальца (40,97±0,78% в венозной крови и 41,97±0,88% в капиллярной крови).
Отмечено достоверное (р 0,05) преобладание среднего объема эритроцитов в капиллярной крови (91,15±1,19 фл в капиллярной крови против 85,76±0,93 фл в венозной). Показатель анизоцитоза выше в капиллярной крови (39,40±1,96% в капиллярной крови против 38,89±2,12% в венозной).
При вибровоздействии наблюдается сдвиг цитометрических кривых венозной и капиллярной крови влево, что свидетельствует о фрагментации форменных элементов красной крови. При этом условный гемолиз микроцитов, в частности микроцитов 2, достоверно меньше (по абсолютному значению) в венозной крови, что показывает повышенную фрагментацию клеток капиллярной крови (-10,74±2,86% в венозной крови по сравнению с -20,93±5,2% в капиллярной).
Это также подчеркивается положительным условным гемолизом больших субпопуляций капиллярной крови (начиная с нормоцитов 2). Общий условный гемолиз макроцитов положителен (4,76±2,57%), что, в совокупности с отрицательным значением условного гемолиза микроцитов (-17,85±3,87%), указывает на разрушение крупных эритроцитов, преимущественно стареющих форм, подвергающихся диск-сферотрансформации, а также на фрагментацию клеток большого объема с текучей мембраной.
В случае венозной крови присутствует процесс агрегации, на который указывает отрицательное значение условного гемолиза макроцитов 3 (-15,32±9,79%). Фрагментация менее выражена по сравнению с капиллярной кровью, о чем свидетельствует достоверно (р 0,05) больший условный микроцитов в крови из пальца (-8,46±2,14% в венозной крови и -17,85±3,87% в капиллярной крови). Можно отметить небольшое увеличение количества клеток средней субпопуляции венозной крови, в то время как в капиллярной крови условный гемолиз клеток такого размера положителен, что означает их уменьшение. В целом, условный гемолиз эритроцитов меньше у венозной крови (-3,16±0,65% в венозной крови по сравнению с -1,45±0,85% в капиллярной).
Другая ситуация наблюдается для венозной крови на 7-ой день хранения (таблица 3, рисунок 2).
Общее содержание эритроцитов достоверно (р 0,05) больше в капиллярной крови (4,14±0,06 млн/мкл в венозной крови по сравнению с 4,70±0,06 млн/мкл в капиллярной). Соотношение процентного содержания популяций такое же, как и на первый день хранения. В частности содержание микроцитов преобладает в венозной крови (34,17±1,67% в венозной крови по сравнению с 30,96±1,60% в капиллярной), а макроцитов больше в капиллярной (24,09±1,20% в венозной крови по сравнению с 27,08±1,31% в капиллярной).
Показатели условного гемолиза различаются следующим образом. Наблюдается сдвиг цитометрических кривых влево, что указывает на выраженный процесс фрагментации. Причем в венозной крови эта тенденция выражена сильнее, это видно из большего значения условного гемолиза микроцитов 2 (-23,20±4,01%, а в капиллярной крови -20,93±5,2%). Содержание эритроцитов, имеющих размер больший нормоцитов 1, уменьшается при вибровоздействии, причем величина изменения близка в венозной и капиллярной крови для нормоцитов 2 (1,91±2,39% в венозной крови и 1,68±2,59% в капиллярной крови), нормоцитов 3 (3,03±2,95% в венозной крови и 1,80±3,13% в капиллярной крови), макроцитові (10,87±3,27% в венозной крови и 11,45±3,51% в капиллярной крови), макроцитов 3 (19,72±5,70% в венозной крови и 19,70±5,51% в капиллярной крови). Исключением является условный гемолиз макроцитов 2, где условный гемолиз 26,27±4,62% в капиллярной крови превышает 15,21±4,20% в венозной крови. Средний объем эритроцитов больше в капиллярной крови (89,90±1,30 фл в венозной крови и 91,15± 1,19 фл в капиллярной крови), а показатель анизоцитоза повышен в венозной (41,38±2,13% в венозной крови и 39,40±1,96% в капиллярной крови).
