Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы для обоснования тем исследований ... 19
1.1. Биохимическая характеристика спермы сельскохозяй ственных животных 19
1.1.1. Окислительные ферменты спермы и факторы, влияющие на процессы энергообразования 19
1.1.2. Лизосомы: ферментный состав и биологические функпии ; гидролитические ферменты спермы 28
1.1.3. Фэсфолипиды, гликолипиды, жирные кислоты: структура и биологические функции ; липиды спермы 47
1.2. Влияние внешних факторов, возраста и породных особенностей на спермопродукцию производителей 73
2. Материалы и методы исследований 86
3. Результаты исследований 101
3.1. Активность гидролитических ферментов спермы хряков... 101
3.1.1. Активность кислых гидролаз спермы хряков в зависимости от технологических приемов обработки ее для длительного хранения 101
3.1.2. Связь активности гидролитических ферментов с подвижностью и холодостойкостью спермиев 105
3.1.3. Активность гидролитических ферментов при разных условиях хранения спермы хряков 107
3.2. Активность окислительных ферментов в сперме хряков... 118
3.3. Липиды спермы хряков 119
3.3.1. Определение фракций фосфолипидов в сперме хряков... 121
3.3.2. Определение гликолипидов в сперме хряков 123
3.3.3. Ширнокислотный состав спермы хряков 126
3.4. Исследование связей между спермопродукцией хряков и биохимическими показателями спермы 133
3.5. Спермопродукция, биохимический состав и оплодотворяющая способность спермы хряков в зависимости от внешних факторов 139
3.5.1. Изменение спермопродукции и физиологических функций спермиев хряков по сезонам года в условиях свиноводческих комплексов 139
3.5.2. Изменение биохимических показателей спермы хряков по сезонам года 149
3.6. Биохимический состав спермы хряков в зависимости от возраста, породной принадлежности и индивидуальных особенностей 166
4. Разработка способов сохранения высокого качества и оплодотворяющей способности спермиев хряков на основе исследований биохимического состава и физиологических шункций половых клеток 187
4.1. Новый способ объективной оценки качества спермиев и прогнозирования оплодотворяющей способности по активности сукцинатдегидрогеназы 187
4.2. Новый способ повышения оплодотворяемости свиноматок на основе применения гидролитических ферментов 191
4.3. Способ применения гидролитических ферментов для повышения эффективности использования эякулятов 201
4.4. Устройство для искусственного осеменения свиней .204
5. Обсуждение результатов исследований
6. Заключение 277
7. Выводы 290
8. Предложения производству 296
Указатель литературы 297
- Фэсфолипиды, гликолипиды, жирные кислоты: структура и биологические функции ; липиды спермы
- Активность гидролитических ферментов при разных условиях хранения спермы хряков
- Биохимический состав спермы хряков в зависимости от возраста, породной принадлежности и индивидуальных особенностей
- Способ применения гидролитических ферментов для повышения эффективности использования эякулятов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современный этап развития свиноводства характеризуется концентрацией и специализацией производства, строительством новых комплексов и реконструкцией старых ферм, применением интенсивных способов и приемов ведения отрасли, позволяющих получать максимум высококачественной продукции.
Оцной из главных проблем освоения передовых технологий производства свинины является четкая организация размножения поголовья, ритмичное получение приплода с желательными признаками. Как показывает опыт эксплуатации крупных комплексов, решение этой задачи крайне необходимо для достижения проектной мощности предприятий и, в конечном итоге, увеличения производства мяса, улучшения его качества, снижения трудовых и материальных затрат.
Важным фактором успешного решения проблемы воспроизводства является эффективное использование метода искусственного осеменения свиней, получение от лучших хряков-производителей высококачественной спермопродукции. Широко применяя высококлассных производителей, можно ускорить преобразующий процесс селекции, добиться осеменения свиноматок только хряками, проверенными по собственной продуктивности и качеству потомства.
Рациональное использование спермопродукции хряков способствует экономии денежных и материальных средств на содержание отцовского стада при одновременном увеличении производства и улучшении качества свинины.
Следует отметить, что без применения искусственного осеменения трудно перевести свиноводство на промышленную технологию и обеспечить непрерывный процесс воспроизводства. Наряду с использованием достижений эндокринологии, искусственное осеменение
дает возможность планомерно управлять процессом разведения, добиться стабильных показателей по воспроизводству животных, улучшить организацию и условия труда обслуживающего персонала.
Без искусственного осеменения невозможно в полном объеме результативно и в срок внедрить прогрессивные системы и методы разведения свиней, предусматривающие производство мяса в спецхозах и на промышленных комплексах на межпородной и межлинейной гибридной основе, а также ввести элементы индустриального производства на фермах с традиционной технологией, повысить производительность и эффективность труда. Указанный метод позволяет повысить концентрацию и углубить специализацию свиноводческой отрасли путем создания станций искусственного осеменения, разделения труда со всеми вытекающими отсюда выгодами.
Вместе с тем, потенциальные возможности искусственного осеменения свиней реализуются далеко не в полной мере. Объясняется это недостаточной изученностью биохимических основ жизнедеятельности спермиев, внутренних и внешних факторов, влияющих на спермопродук-цию, несовершенством методов оценки качества спермы, технологических приемов ее обработки для глубокого замораживания и длительного хранения. Трудности в практической реализации метода глубокого замораживания спермы связаны со спецификой метаболизма половых клеток хряков (В.К.Милованов, 1962; И.И.Соколовская 1962; Н.П.Шергин, 1967; И.Кёниг, 1980 и др.).
Отсюда следует, что научное обоснование и практические приемы хранения спермы хряков могут быть разработаны только на основе углубленных исследований физиологии и биохимического состава спермы, а также происходящих в ней изменений в процессе технологической обработки и хранения вне организма.
Однако к началу наших исследований сведения о биохимических механизмах, лежащих в основе компенсаторно-приспособительных процессов, обеспечивающих жизнедеятельность и физиологические функции спермиев после воздействия экстремальных факторов, в частности, низких температур, были чрезвычайно скудны.
'В большой степени это сопряжено с недостаточностью знаний о биохимическом составе спермы хряков. Проблема взаимосвязи свойств и функций спермиев хряков с важнейшими метаболическими процессами, обеспечивающими жизнеспособность и деятельность клеток в физиологических условиях, оставалась нерешенной. Понятно, что особую остроту приобретают эти вопросы при искусственном осеменении с учетом действия на спермии, с одной стороны, многообразных и сильных факторов внешней среды, а с другой - влияния возрастных, породных и индивидуальных особенностей производителей.
Следовательно, биохимический аспект решения проблемы искусственного осеменения имеет не только теоретическое значение, но и представляется наиболее перспективным направлением в разработках объективных критериев оценки качества эякулятов, полноценности и жизнеспособности спермиев, оптимальных вариантов использования спермопродукции хряков, хранения и консервации спермы, прогнозирования и сохранения высокой оплодотворяющей способности спермиев, а также увеличения многоплодия свиноматок.-
Известна исключительная роль энергообразующих процессов в обеспечении жизнеспособности спермиев. Исследованы механизмы образования макроэргов (прежде всего аденозинтрифосфорной кислоты -АТФ) в сперме сельскохозяйственных животных ; изучены роль АТФ в указанных явлениях, связь с подвижностью мужских половых клеток, влияние глубокого замораживания на активность гликолитических и дыхательных ферментов (И.И.Иванов, К.И.Каныгина, 1945 ; Н.П.Шергин,
8 1945 ; С. А, Бурнашева, 1947 ; В. А. Знгельгардт, 1959 ; В. Г. Семаков, 1961; Е.М.Платов, 1973; Г.В.Зверева, 1980 и др.). В то же время, указанные работы касались преимущественно энергообразования в сперме быков, баранов, жеребцов. Сперма хряка в данном направлении изучалась мало, но и эти немногочисленные исследования свидетельствуют о своеобразии реакций анаэробного и аэробного гликолиза, протекающих в ней. В доступной литературе не удалось обнаружить сведений о функциях ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (таких как сукцинатдегидрогеназа) и терминального окисления (например, цитохромоксидазы) в сперме хряка во взаимосвязи с общими биофизическими показателями спермопродукции, а также в зависимости от различных внешних факторов, породных, возрастных и индивидуальных особенностей производителей.
Актуальным, но недостаточно освещенным в литературе является
вопрос о значении кислых гидролитических ферментов в процессах
воспроизведения, в частности, оплодотворения. Отдельными исследо
ваниями установлена определенная связь ферментов лизосом с про
цессами сперматогенеза и овогенеза. Наиболее изученным ферментом
из класса гидролаз, участвующим в процессе взаимодействия спер-
миев с яйцеклеткой, является гиалуронидаза, которая содержится
в акросоме головки спермия. Предполагается, что роль гиалурони-
дазы заключается в облегчении контакта между мужской и женской
гаметами путем разжижения вязкого желатинообразного вещества,
связывающего фолликулярные клетки вокруг свежеовулированного яйца
(И.И.Соколовская, 1950; A.c.jaiison, 1967, 1970; ї.Мшіп,
1973).
Значение других кислых гидролитических (лизосомных) ферментов в физиологии и патологии оплодотворения менее известно. Между тем,
9 набор их, с учетом сложного биохимического состава оболочек, окружающих яйцеклетку, должен быть значительно разнообразнее. Поэтому исследование кислых гидролаз в сперме хряка, действующих на различные по химической природе субстраты, позволит расширить представление об основной функции акросомных гидролитических ферментов в обеспечении оплодотворения.
фактически не исследован такой важный аспект проблемы искусственного осеменения свиней, как взаимосвязь физико-химических факторов при технологической обработке спермы с особенностями функционального состояния лизосомного аппарата спермиев. Отсутствует информация о зависимости активности гидролитических ферментов лизосом от сезонных факторов года, породных, возрастных и индивидуальных особенностей производителей. Решение данных вопросов открывает возможность правильно подходить к задаче устойчивого и равномерного получения качественной спермопродукции от производителей.
В настоящее время не вызывает сомнения огромное значение липи-дов, в том числе фосфорилированных, как в организации ультраструктуры, так в обеспечении и регуляции основных жизненных функций клеток. Являясь важнейшими структурными компонентами биологических мембран, участвуя в интеграции внутриклеточных метаболических процессов, фосфолипиды непосредственно влияют на многие ферментные реакции, в частности, анаэробного и аэробного гликолиза, окислительного фосфорилирования, связанных с образованием макроэргов. Входя в состав кофакторов ферментов или выступая в качестве их необходимого физиологического активатора, они обуславливают активность ферментов разнообразнейшего спектра действия, влияют на синтез белков и гормонов, на водно-минеральный, углеводный обмены и т.д. Известна роль фосфолипидов в многообразных
10 физиологических процессах: клеточном делении, регенерации ткани, фагоцитозе, реакциях возбуждения, торможения и т.д. В организме липиды используются в качестве запасного материала для энергопродукции.
В свете изложенного понятен пристальный интерес специалистов по биологии размножения ко всем аспектам липидного обмена в сперме сельскохозяйственных животных. В литературе представлены данные об идентификации, содержании и локализации некоторых липид-ных соединений в сперме, их составе, структуре, взаимосвязи с физиологическими свойствами спермиев в нормальных и экстремальных условиях. Так, была показана зависимость продолжительности жизни спермиев, их устойчивость к ряду повреждающих воздействий от состава липоидного (липопротеидного) покрова клеток, от содержания в сперме липидов и липоидного фосфора (О.А.Селиванова, 1934; В.К.Милованов, 1934, 1962 ; Б.А.Матукайте, П.И.Пакенас, 195б;В.Е.Шавкун, 1963; Г.В.Зверева, 1964; Е.Д.Ким, 1966; В. П. Кононов, 1969; И. В. Смирнов, А. 3. йяец, 1971; Т. П. Ильинская, В.С.Антонюк, 1975 и др.).
Вместе с тем, необходимо отметить отсутствие глубокого комплексного исследования состава липидов спермы хряков. Рассмотренные выше работы выполнялись, в основном, на биологическом материале производителей жвачных животных и в большинстве своем были посвящены изучению общего количества липидов, фосфолипидов и липопротеидов, а не их индивидуальных фракций.
Требует уточнения биологическая роль фосфолипидов в сперме хряка. Фракционный состав фосфолипидов в ней вообще не известен. Целесообразность проведения экспериментальных работ в этом направлении диктуется тем обстоятельством, что в последние годы существенно расширяются знания о специфических свойствах и био-
логической роли индивидуальных представителей этого класса веществ.
В современной сперматологии лишь единичные работы посвящены исследованию важнейших представителей сложных липидосодержащих соединений - гликолипидов ( H.P.Hiesen et al., 1978). Между тем, указанные полимеры, наряду с фосфолипидами и холестерином, составляют основной липидный структурный остов оболочек любых клеток, а не только нервных, как полагали ранее. Состав и свойства гликолипидов поверхности плазматических мембран определяют митотическую активность клеток и фазы клеточного деления. Показана их исключительная роль в межклеточных взаимодействиях: в явлениях "узнавания" клеток друг другом, адгезии, дифференциации, роста, пролиферации, контактного ингибирования роста и др. Сообщают об их иммунологических, детоксикационных свойствах, способности расслаблять гладкую мускулатуру и так далее.
В то же время биологическое значение гликолипидов далеко не выяснено. Сведений о гликолипидах спермы хряка вообще нет. Можно с уверенностью полагать безусловную связь этих интереснейших липидов полимеров со многими сторонами биологии воспроизводства. Однако эта проблема не изучалась должным образом и требует экспериментальной проработки во всех аспектах.
Жирнокислотный состав липидов, как известно, тесно связан с особенностями их строения и биологической функцией. Жидко-кристаллическое состояние биологических мембран, проницаемость, плотность и другие свойства зависят от состава и соотношения находящихся в них жирных кислот. Сбалансированность между содержанием насыщенных и ненасыщенных свободных жирных кислот влияет не только на все многообразие метаболических превращений различных липидов, но оказывает действие на такие процессы, как синтез
12 простагландинов, образование перекисных соединений в организме и др. Есть немногочисленные сообщения о жирнокислотном составе спермы сельскохозяйственных и других животных, о токсическом влиянии избытка перекисей липидов на спермин ( R.Jones, Т.Мадш, 1973 ; Е.М.Платов, 1978 ; И.И. Соколовская, 1981; В.К.Ми-лованов и др., 1981).
Подобные исследования не касались спермы хряка. Іирнокислот-ный состав спермы хряка, его роль в физиологии и патологии оплодотворения оставались неизвестными.
Выяснение важнейших особенностей биохимического состава спермы хряка во взаимосвязи с показателями спермопродукции, факторами внешней и внутренней среды, технологическими приемами обработки спермы в целях искусственного осеменения дают представление о тонких механизмах, лежащих в основе интегральных компенсаторно-приспособительных реакций спермы в ответ на внешнее воздействие, и открывают возможность управления этими процессами путем изыскания специфических протекторов или разработок направленной коррекции обнаруженных расстройств метаболических систем.
Подобные исследования важны для уточнения взаимодействия спермин - яйцеклетка, результаты которых могут дать правильное направление при разработке искусственной регуляции численности спермиев для эффективного оплодотворения, с одной стороны, а с другой - повышения результативности оплодотворения.
Требует дальнейшего уточнения степень влияния метеорологических факторов на спермопродукцию хряков, поскольку не были проведены комплексные, системные и глубокие исследования в этом направлении. Знание взаимосвязи и влияния условий внешней среды, возраста, породы и индивидуальных особенностей производителей на биохимический состав спермы, качество и оплодотворяющую спо-
ІЗ собность спермиев имеет большое значение для организации ритмичного и эффективного воспроизводства, особенно на крупных фермах и комплексах, для разработки методов длительного хранения спермы, приемов улучшения качества эякулятов по сезонам года, способов повышения оплодотворяющей способности спермиев (Ю.Д.Клинский, 1970; С.И.Сердюк, 1977 ; В.М.Прокопцев, 1981идр.).
Цель и задачи исследований» В связи с изложенным, целью наших исследований явилось изучение спермопродукции, физиологии и биохимии спермиев хряков (активность окислительных и гидролитических ферментов, метаболизм липидов) во взаимосвязи с факторами внешней среды, возрастными, породными и индивидуальными особенностями производителей, приемами обработки эякулятов для искусственного осеменения, направленное на углубление научно-теоретических основ и практическую разработку новых приемов эффективного использования спермопродукции, способов объективной оценки качества спермы, повышение оплодотворяющей способности спермиев и многоплодия свиноматок.
Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:
I. Исследовать активность ключевых окислительных ферментов -сукцинатдегидрогеназы и цитохромокеидазы в сперме хряков, связь их активности с биофизическими и физиологическими показателями спермиев, факторами внешней среды, породной, возрастной и индивидуальной особенностями производителей.
. Изучить активность кислых гидролитических (лизосомных) ферментов - гиалуронидазы, кислых катепсинов, кислой фосфатазы, бета- D -глюкозидазы, бета- D -галактозидазы - в сперме хряков, установить зависимость их активности от возраста, породной принадлежности хряков, сезона года, а также действия физико-химических факторов при технологической обработке спермы.
Определить содержание липидов (фосфолипидов и их фракций, гликолипидов - ганглиозидов и цереброзидов, насыщенных и ненасыщенных жирных кислот) как в цельной сперме, так и в ее фракциях: половых клетках, плазме. Установить степень влияния различных манипуляций со спермой в процессе ее подготовки для длительного хранения, действие метеорологических факторов на метаболические превращения липидосодержащих веществ.
Выяснить влияние сезонных факторов (продолжительность светового дня, температура и относительная влажность) на воспроизводительную функцию хряков в условиях свиноводческих комплексов с целью разработки методов, предупреждающих снижение количества и качества спермопродукции, оплодотворяющей способности половых клеток.
На основании комплексной оценки спермопродукции результатов физиологических и биохимических исследований разработать методы объективной оценки качества эякулятов, полноценности и жизнеспособности спермиев, способы прогнозирования их оплодотворяющей способности.
Учитывая роль лизосомных ферментов в оплодотворении, разработать способы повышения эффективности использования эякулятов хряков, оплодотворяющей способности спермиев, увеличения многоплодия свиноматок путем экзогенного введения гидролитических ферментов.
Изыскать технические приемы сохранения высокой оплодотворяющей способности спермиев, увеличения многоплодия свиноматок и повышения производительности труда операторов путем разработки устройства для искусственного осеменения.
Научная новизна. Впервые в длительных экспериментах определена активность и выявлена роль окислительных и гидролитических
15 ферментов в жизнеобеспечении спермиев и их оплодотворяющей способности.
В сперме хряков установлено наличие трех фракций фосфолипидов (сфингомиелина, кефалина, лецитина), двух типов гликолипидов (ганглиозидов и цереброзидов), изучен спектр и уровень жирных кислот.
Определена зависимость биохимического состава спермы от сезона года, породных, возрастных и индивидуальных особенностей производителей, физико-химических факторов и технологических приемов обработки эякулятов для длительного хранения.
Проведенные исследования развивают новое направление и подходы в разработке эффективного метода длительной консервации спермы хряка, основывающиеся на изучении и использовании тонких биохимических механизмов жизнедеятельности половых клеток.
Впервые обнаружена взаимосвязь активности окислительных и гидролитических ферментов, содержания фосфолипидов, гликолипидов, насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с холодостойкостью спермиев хряков. Определены биохимические тесты оценки воздействия различных факторов на спермии для контроля их качества при разработке практически приемлемого метода длительной консервации спермы хряков.
На основе теоретических обобщений результатов исследования физиологических, биофизических и биохимических свойств спермы хряка разработаны: способ определения оплодотворяющей способности спермы хряков (авторское свидетельство № 622466 от 15 мая 1978 г.), способ искусственного осеменения животных (авторское свидетельство № 904691 от 14 октября 1981 г.), способ повышения эффективности использования эякулятов хряков, устройство для ис-
кусственного осеменения свиней. Предлагаемые способы сравнительно просты в исполнении, доступны для широкого использования, легко воспроизводимы и информативны.
Практическая ценность и реализация результатов. Оущественно расширены знания в области биохимии спермы хряка, ^но обоснование новому направлению в биологии размножения, которое основывается на использовании показателей активности окислительных ферментов спермы для определения и прогнозирования оплодотворяющей способности спермиев, а также на применении экзогенных гидролитических ферментов с целью повышения оплодотворяемости и многоплодия свиноматок.
Применение разработанных способов, технических и технологических решений повышает эффективность искусственного осеменения в условиях свиноводческих комплексов, позволяет более рационально использовать хряков-производителей и в конечном итоге обеспечивает увеличение производства свинины.
Предложенные способ определения оплодотворяющей способности спермы хряков, способ искусственного осеменения животных, способ повышения эффективности использования эякулятов хряков, устройство для искусственного осеменения свиней прошли производственную проверку, утверждены научно-техническим советом МСХ БССР и внедрены на свиноводческом комплексе по откорму 108 тыс. голов свиней совхоза-комбината им. 60-летия БССР, свиноводческом комплексе по производству 11,8 тыс. голов племенного молодняка селекционного центра республики по животноводству, на Барано-вичском областном госплемпредприятии. Ряд перечисленных способов и методов оценки жизнеспособности спермиев нашли применение в научно-исследовательской работе БелНИИЖа, областных государственных опытных станций БССР.
За выполнение ряда исследований по совершенствованию методов воспроизводства и искусственного осеменения свиней в комплексной работе по разработке и внедрению в Белорусской ССР эффективной системы племенной работы в свиноводстве, созданию белорусского внутрипородного типа свиней крупной белой породы и белорусской черно-пестрой породы автору диссертации постановлением Совета Министров СССР от 30 марта 1981 года № 309 присуждена Премия Совета министров СССР за 1980 год (диплом лауреата Премии Совета Министров СССР № I026I). За участие в разработке и внедрении в сельскохозяйственное производство технологий воспроизводства скота и свиней на промышленных комплексах Советом Выставки достижений народного хозяйства Белорусской ССР награжден Дипломом I степени.
Апробация. Основные положения диссертации доложены на 7 республиканских, региональных, союзных научно-теоретических и практических конференциях, симпозиумах и съездах, на заседаниях координационного совета по воспроизводству и искусственному осеменению животных при ВИЖе (I974-I98I гг.), ученых советах БелНИИЖа, Министерства сельского хозяйства БССР (1974-1982 гг.), а также на Международном совещании стран СЭВ "Применение и развитие способа глубокого замораживания спермы хряков и баранов" (Москва -Дубровицы, 1975 г.), УШ Международном конгрессе по воспроизведению и искусственному осеменению животных (Краков, 1976 г.), I Международном симпозиуме по структуре и функциям лизосом (Москва, 1976 г.), советско-шведском симпозиуме по свиноводству (Упсала, 1979 г.).
Публикация результатов исследований. Материалы диссертации опубликованы в 32 научных работах,изданных в СССР и за рубежом, монографии "Биология и техника искусственного размножения свиней",
18 Минск: "Ураджай", 1978, 176 с. 9,51 п.л., и в трех рекомендациях.
Объем работы. .Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и практических предложений для производства. Работа изложена на 341 странице машинописи, из них содержит 296 страниц текста, 53 таблицы и рисунка, списка литературы, включающего 447 источников.
Фэсфолипиды, гликолипиды, жирные кислоты: структура и биологические функции ; липиды спермы
Липиды относятся к классу важнейших в биологическом отношении веществ. Огромный интерес к изучению липидов в организме связан с установлением их регуляторной, защитной и других функций, с выяснением их значения как запасного материала в энергообразующих процессах, а также как структурных компонентов биологических мембран. Различные липиды отличаются друг от друга химическим строением, биологическими свойствами и функциональной направленностью в организме.
В структуре и функциях клеток большая роль принадлежит фосфо-липидам. Последние годы характеризуются детальным изучением не только химической структуры фосфолипидов, но и их биологического значения в организации ультраструктур, регуляции ряда жизненных функций клетки (G.B.Ansell et al. 1973 ; R.L.Jackson et al., 1974).
Выяснено, что фосфолипиды играют роль не только пластических соединений, но и являются функционально активными веществами. Как важнейшие структурные компоненты биологических мембран, фосфолипиды регулируют многие ферментные реакции,например, окислительное фосфорилирование ( D.Hegner,D.Piatt, 1975). Они участвуют в транспортировке минеральных веществ и органических соедине 48 ний через биологические барьеры, играют определенную роль в возникновении процессов возбуждения, торможения и других физиологических явлений. Эти соединения выполняют специфическую защитную роль в организме, так как их отдельные представители обладают антитоксичными, антибактериальными и антивирусными свойствами (К.Т.Карагезян, 1972). Наконец, фосфолипиды служат запасным материалом, который при необходимости может использоваться в энергообразующих процессах в качестве субстрата.
Фосфолипиды представляют собой сложные органические высокомолекулярные соединения, широко распространенные в различных тканях и клетках организма животного ; различаются между собой определенными специфическими физико-химическими и функциональными особенностями ( R.L.Jackson et alv, 1974).
В состав фосфолйпидов входят насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и их альдегиды, фосфорная кислота, глицерин, инозит,сфин-гозин, холин, этаноламин и серии ( G.J.Helson, 1967; ї.В.Schwartz, 1977; E.J.Masoro, 1977).
Согласно наиболее распространенной классификации (Н.М.Flowers, 1972), фосфолипиды подразделяются на глицерофосфолипиды (лецитины, или фосфатидилхолины ; кефалины, или фосфатидилэтаноламины ; серин-фосфатиды ; ацетальфосфатиды, или плазмалогены ; лизофосфатиды ; фос-фатидные кислоты и полиглицерофосфатиды), сфингомиелины, инозит-фосфатиды.
Все природные глицерофосфатиды представляют собой производные альфа-глицерофосфорной кислоты. В фосфолипидах к остатку фосфорной кислоты, которая является обязательной составной частью, присоединяется азотистое основание (холин, этаноламин, серии). Жирные кислоты связаны сложноэфирной связью с гидроксилами глицерина в альфа и бета- положениях. В естественных условиях фосфолипвды обычно содержат насыщенную жирную кислоту в альфа-положении, а ненасыщенную - в бета-положении (М.И. Прохорова, З.Н.!гупикова, 1965). Известны плазмалогенные формы фосфатидилхолинов, Ф-этанол-аминов, Ф-ееринов.
Лизофосфатиды представляют собой глицерофосфолипиды, лишенные одной молекулы жирной кислоты. В лизолецитине тканей остаток жирной кислоты находится в альфа-положении, а свободная гидроксиль-ная группа-в бета-положении. Установлены и бета ацильные формы лизофосфатидов ( Е. J.Masoro, 1977).
Сфингомиелин в отличие от лецитина и кефалина вместо глицерина содержит высокомолекулярный ненасыщенный аминоепирт - сфинго-зин, насыщенную жирную кислоту, фосфорную кислоту и холин. Сфингомиелин является составной частью миелина. Исследования последних лет показывают, что сфингомиелин не относится к специфичным липидам только нервной ткани ; они были выделены из сердечной мышцы, печени, почек, жировой ткани, надпочечников и сыворотки крови. Основным представителем жирнокислотного состава является лигноцериновая кислота.
Среди фосфатидов есть группа веществ, имеющих в своем составе помимо глицерина 6-атомный циклический спирт инозит - инозитфое-фатиды. Инозитсодержащие фосфолипвды были впервые обнаружены Фол-чем (н.м.Flowers, 1972). По количеству фосфатных групп они делятся на моно-, ди- и трифосфоинозитиды. Благодаря наличию диссоциированных фосфатных групп, молекулы ди- и трифосфоинозитидов характеризуются ярко выраженными анионными и гидрофильными свойствами. Этим в значительной мере определяется их высокое сродство с двухвалентными катионами, и особенно с Са2+ ( L.s.Wolfe, J.A.Lowden, 1964). Исследования показали, что ди- и трифоефоинозитиды преимущественно сосредоточены на поверхности миелиновых оболочек ( P.Emme lot, R.P.Van Ho even, 1975; P.R.Cullis, B.De Kruijff, 1979). Такая их локализация обеспечивает свободный контакт с ферментами, АТФ, катионами и др. метаболитами.
Активность гидролитических ферментов при разных условиях хранения спермы хряков
Для выяснения влияния различных способов хранения спермы хряка на активность ферментов были проведены специальные исследования. В первом варианте опыта цельную неразбавленную и разбавленную сперму сохраняли до анализа 6-7 часов при комнатной температуре (инкубированная сперма). Затем центрифугированием отделяли плазму от спермиев и определяли активность ферментов. Во втором варианте опыта сперму сразу после получения (неразбавленную и разбавленную) центрифугировали и замораживали в жидком азоте (отдельно плазму и епермии). Контролем служила сперма, замороженная и оттаянная по общепринятой методике.
В инкубированной сперме активность гиалуронидазы была ниже в обеих фракциях (плазме и спермиях), чем в свежеполученной и тотчас замороженной (табл. 3). В неразбавленной инкубированной сперме активность фермента в плазме была в 5,6, а в половых клетках - в Z раза выше, чем в сразу замороженных спермиях и плазме. Такая же закономерность отмечена после разбавления; разница в активности гиалуронидазы в инкубированных в течение 6-7 часов и тотчас замороженных образцах составила 31,69 ед.акт. В контроле замораживание и оттаивание привело к значительному повышению активности рассматриваемого гидролитического фермента без достоверного различия между вариантами хранения, т.е. замораживание-оттаивание при исследуемых режимах хранения вело к заметному возрастанию активности гиалуронидазы в половых клетках.
Отмечена более низкая активность кислых катепсинов (Р 0,05) в плазме (5,8 раза) и половых клетках (2 раза) в инкубированных образцах по сравнению с замороженными без выдержки фракциями неразбавленной спермы. Добавление разбавителя незначительно повлияло на активность кислых катепсинов в спермиях при различных режимах хранения. Замораживание спермы по общепринятой методике вызвало значительное (в 1,9 раза ; Р 0,01) увеличение активности названного гидролитического фермента в половых клетках по срав нению со свежеполученными и инкубированными в течение 6-7 часов при комнатной температуре. Достоверная разница между активностью кислых катепсинов в сразу замороженных, разбавленных и замороженных-оттаянных половых клетках не установлена. Условия хранения не оказали достоверного влияния на активность кислой фосфатазы как в плазме, так и в спермиях свежеполученных эякулятов. Однако в половых клетках разбавленной инкубированной, а также сразу замороженной спермы активность кислой фосфатазы снизилась соответственно на 48, (Р - 0,01) и 77, #S (Р Г 0,01). В контрольных образцах (замороженных-оттаянных) независимо от условий хранения активность этого фермента в спермиях была значительно ниже (4,1 и 3,9 раза)-, чем в свежеполученных и разбавленных (соответственно 2,8 и 2,2 раза).
Активность бета- D -глюкозидазы в свежезамороженной плазме была в 3,7 (Р 0,001)"раза выше, чем при хранении 6-7 часов в условиях комнатной температуры. Напротив, в половых клетках активность рассматриваемого фермента в сразу же замороженной сперме была в 2 раза (Р 0,01) ниже. При сравнении активности бета- -глюкозидазы в половых клетках после разбавления выявлена более высокая ее активность (в 1,5 раза) при хранении спермиев в течение 6-7 часов в условиях комнатной температуры. В обоих обсуждаемых вариантах хранения активность бета-D-глюкозидазы в половых клетках контрольных образцов (замороженных и оттаянных по общепринятой методике) была значительно выше (в 3,6 раза, Р 0,05), чем в евежеполученной и разбавленной сперме.
Не выявлена достоверная разница между способами хранения све-жеполученной спермы по активности бета-D-галактозидазы как в плазме, так и половых клетках. В спермиях разбавленных образцов активность бета- D -галактозидазы снизилась в 1,5 раза (Р 0,05) после 6-7-часового хранения при комнатной температуре, и в 1,7 раза (Ргс0,01) после немедленного замораживания. Активность рассматриваемого фермента в половых клетках контрольных образцов была достоверно (Р 0,01) ниже, чем в свежеполученном эякуляте.
При сравнении со спермиями, инкубированными в течение 6-7 часов, разница не установлена.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что замораживание неразбавленной спермы без предварительного инкубирования ведет к значительному повышению активности всех (кроме кислой фое-фатазы) гидролитических ферментов в плазме, а гиалуронидазы, кислых катепсинов, бета- D -галактозидазы - в спермиях.
Разбавление половых клеток средой предупреждает активизацию рассматриваемых гидролитических ферментов при выбранных вариантах хранения. Очевидно, добавление разбавителя предохраняет спермин от действия внешних факторов, что видно по снижению активности большинства кислых гидролаз в половых клетках.
Следовательно, способ обработки спермы перед глубоким замораживанием оказывает большое влияние на сохранность биологической полноценности половых клеток, а активность ферментов может служить критерием оценки эффективности режимов и методов технологической обработки спермы для ее консервации.
Нашими исследованиями установлена также связь активности гидролитических ферментов с породной принадлежностью, возрастом хряков и сезоном года. Результаты опытов по выявлению зависимости активности лизосомных ферментов от названных факторов будут представлены в соответствующих разделах данной главы.
Биохимический состав спермы хряков в зависимости от возраста, породной принадлежности и индивидуальных особенностей
Для выяснения возможных индивидуальных особенностей, влияния возраста и породной принадлежности хряков на спермопродукцию в период с июня 1979 г. по июль 1980 г. нами была прослежена динамика показателей количества, качества и биохимического состава спермы производителей. Были использованы взрослые хряки специализированных линий (Тийтер, № 1285, создан на основе крупной белой, эстонской беконной и ландрас ; Абор, № 3457 и Матти, № 1343, выведены на основе крупной белой, эстонской беконной, ландрас и шведский йоркшир) и крупной белой породы (№ 33, кличка Самсон). В начале опыта все производители, за исключением хряка № 33, имели возраст 36 мес (отклонения в возрасте 3,5 мес) и живую массу 300, 310 и 319 кг. Хряк № 33 был в возрасте 4 лет и име живую массу 340 кг.
Животные принадлежали племенному заводу "Заречье", находились в одинаковых условиях кормления и содержания, использовались І раз в неделю. По всем подопытным хрякам учитывали общие показатели спермопродукции, рН и активность окислительных ферментов за указанный период эксперимента; активность кислых гидролитических ферментов, содержание индивидуальных фракций фосфолипидов, гликолипидов и жирных кислот исследовали в сперме производителей № 1285 и № 3457 - аналогов по возрасту и живой массе.
Установлены достоверные различия между хряками по объему эякулята (табл. 29). Наибольший объем спермы отмечен у производителя № 33, наименьший - у производителя № 3457. Обнаружена значительная достоверная (Р 0,05) разница в объеме эякулята между хряками № 3457 и № 1343 одного возраста и происхождения.
В показателях концентрации и подвижности спермиев также установлены индивидуальные отклонения. Достоверная разница (Р 0,05) в подвижности спермиев прослеживается между животными № 33, № 3457 и № 1285. Наиболее высокая концентрация спермиев в эякуляте была у хряков № 3457 и № 1285.
Количество подвижных спермиев у хряка № 33 значительно (на 169 10,57-13,67 млрд) превосходило данный показатель других подопытных животных. Достоверная разница по количеству подвижных спермиев между производителями одного возраста, принадлежащих специализированным линиям, не выявлена.
Величина рН спермы находилась в пределах нормы (7,63-7,7) и достоверно не различалась между хряками.
Общественная разница отмечена в активности окислительных ферментов (табл. 30).
Разница в активности сукцинатдегидрогеназы между хряками № 1285 и № 33 составила 38,7%. Сперма производителя № 1285 отличалась также повышенной активностью цитохромоксидазы. Так, если показатель активности цитохромоксидазы хряка № 33 принять за I0Q&, то данный показатель у первого хряка был выше на 11,6$. Разница в активности сукцинатдегидрогеназы между хряками одной и той же линии (№ 1285 и № 3457) составила 11,96.
Следует отметить взаимосвязь между активностью сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, которая особенно отчетливо прослеживается по показателям хряка № 1285.
Таким образом, длительное изучение количества и качества спермопродукции, активности окислительных ферментов свидетельствует о заметном различии по этим показателям как между хряками разного возраста, так и между одновозрастными индивидуумами. Последнее отчетливо заметно при сравнении активности ферментов, участвующих в энергообразовании. У 4-летних (к концу эксперимента 5-летних) хряков количество спермопродукции значительно больше, чем у производителей на I год моложе. Оцнако активность окислительных ферментов ниже по сравнению с более молодыми животными.
Сводные данные по активности гидролитических ферментов в сперме подопытных хряков за весь период изучения представлены в табл. 31.
Активность гиалуронидазы в цельной евежеполученной сперме хряка № 3457 на 19,2$ выше, чем у производителя № 1285. В плазме и в половых клетках у первого хряка активность указанного фермента также достоверно выше (Р 0,05). Выявлено различие в активности гиалуронидазы после разбавления спермиев средой, их замораживания и оттаивания. У хряка }р 3457 этот гидролитический фермент после перечисленных манипуляций был более активным как в спермиях, так и во внеклеточной среде. Так, после разбавления половых клеток активность гиалуронидазы у хряка № 3457 была на 18,$ а после замораживания-оттаивания - на 5,6% выше, чем у производителя № 1285. Внеклеточная активность гиалуронидазы как после разбавления, так и под влиянием замораживания-оттаивания половых клеток между хряками достоверно не различалась.
Способ применения гидролитических ферментов для повышения эффективности использования эякулятов
Ввиду наличия в спермиях и плазме гидролитических ферментов, расщепляющих различные биополимеры, а также необходимости введения при осеменении определенного числа спермиев для успешного оплодотворения яйцеклетки нами проведены специальные опыты по снижению количества спермиев в дозе с предварительным введением в половые пути маток экзогенной гиалуронидазы.
Использовали разбавленную сперму в объеме 120 мл с содержанием I млрд подвижных спермиев. За I час до осеменения свиноматкам опытной группы (12 голов) вводили в половые пути 25 мл смеси, приготовленной на 100 мл глюкозо-хелато-цитратно-сульфатной среде с добавлением 100 мг гиалуронидазы. В контрольную и опытную группы подбирали маток-аналогов по происхождению, возрасту, количеству опоросов и живой массе.
В опытной группе по сравнению с контрольной оплодотворяемость повысилась на 8,3 , многоплодие незначительно снизилось, а продолжительность супоросности и крупноплодность не изменились
(табл. 49).
В другом опыте свиноматки-аналоги были разделены на три группы. После установления охоты хряком-пробником маткам первой группы за I ч до осеменения вводили 25 мл смеси, приготовленной на 100 мл ГЩС среды с растворением в ней 50 мг гиалуронидазы и 50 мг трипсина, второй группы - 25 мл такого же раствора, но с содержанием 150 мг гиалуронидазы и 150 мг трипсина. Маткам третьей (контрольной) группы ферменты не вводили. Маток всех 3-х групп осеменяли разбавленной спермой объемом 120 мл с I млрд подвижных спермиев в дозе. Результаты осеменения представлены в таблице 50. По сравнению с животными контрольной группы у свиноматок первой группы опло дотворяемость повысилась на 5, второй - на 1($. Не установлена достоверная разница между группами животных по продолжительности супоросности, средней живой массе приплода и количеству поросят в расчете на опорос. Таким образом, введение гидролитических ферментов (гиалурони-даза + трипсин) за І ч до осеменения в половые пути свиноматок позволяет уменьшить количество спермиев в дозе для осеменения в 3 раза по сравнению с принятым в настоящее время, при это повысить оплодотворяемость на 5-ВД. На возможность уменьшения количества спермиев в дозе до 1,5 млрд без снижения оплодотворяе-мости свиноматок указывает С.И.Сердюк (1977).
. Устройство для искусственного осеменения свиней Среди основных факторов повышения результативности искусственного осеменения важное место занимает сама технология осеменения маток, разработка более совершенных приемов введения спермы. Из литературы известно также положительное влияние оксигенации спермы на ее биологические свойства, подвижность и оплодотворяющую способность спермиев, на качество и резистентность приплода. В этой связи нами были проведены специальные исследования, направленные на техническое усовершенствование способа искусственного осеменения свиноматок.
Сейчас в практике работы ферм и комплексов операторы по искусственному осеменению применяют два способа осеменения свиноматок: метод ВИЖа и фракционный А. В. Квасницкого. Широкое распространение в практике получил серийно выпускаемый полиэтиленовый прибор для искусственного осеменения ПОС-5, разработанный и предложенный СИ.Сердюком и А.А.Беликовым в 1966 г.
На основании многочисленных наблюдений мы установили, что вышеназванные приемы осеменения не лишены определенных недостатков и требуют технологического и конструктивного совершенствования. В производственных условиях зачастую не удается поддерживать температуру спермы близкой к температуре тела животного, что приводи к стрессовым явлениям и как итог - к снижению результата осеменения. К тому же приборы, в частности, для фракционного метода, не 205 компактны и при осеменении большого поголовья свиноматок снижают производительность труда техников.
Нами разработано устройство для искусственного осеменения свиней. Данное устройство позволяет устранить стрессовые явления, вызываемые температурными факторами, а прибор удобен в пользовании и дает возможность использовать кислород, применяемый для оксигенации спермы и для проталкивания ее в короткий период времени в глубокие участки половых путей самки. Емкость для спермы обогревается электрическим нагревателем, температура регулируется автоматически в пределах 38-42G. Кислород, поступающий из источника давления, также подогревается до указанной температуры. В период осеменения происходит насыщение спермы кислородом, что способствует повышению оплодотворяемости маток.
На рис. I, 2 представлена схема и общий вид устройства для искусственного осеменения животных. Устройство состоит из емкости для спермы (I), нагревателя (2), датчика температуры (3), автоматического регулятора температуры (4), катетера (5), источника давления (6) (кислородного баллона). Кислород поступает в емкость для спермы и вытесняет последнюю в половой тракт самки, подогреваясь при этом.
