Содержание к диссертации
Введение
I. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность темы 6
1.2. Цель и задачи исследования 7
1.3. Научная новизна работы 7
1.4. Практическая значимость 8
1.5. Основные положення, выносимые на защиту 9
1.6. Апробация работы 9
1.7. Публикации 10
1.8. Реализация результатов исследований І0
1.9. Объем и структура диссертации 10
Обзор литературы 11
2.1. Иммунная система и клетки иммунитета 11
2.2. Взаимодействие антигена с антителом 16
2.3. Теории иммунитета 17
2.4. Влияние иммунологических факторов на воспроизводство плацентарных 23
3. Материал, методика и объем работы 31
4. Собственные исследования 34
4.1. Спермоантитела быков и хряков 34
Аутоспермоантитела быков 34
Аутоспермоантитела хряков 40
4.2. Изменчивость аутоспермоантител быков и хряков 46
Изменчивость аутоантител у быков 44
Изменчивость аутоспермоантител у хряков 47
4.3.Аллоспермоантитела укоров и свиноматок 53
Аллоспермоаититела у коров 53
Аллоспермоантитела у свиноматок 56
4.4. Аллоантитела быков и хряков 63
Аллоантитсла у быков 63
Аллоантитела хряков 65
4.5.Специфичность спермоантител 69
4.6,Формы агглютинации спермисв 15
Патологические формы спсмиев 83
4.7.Влилние аутоспермоантнтел на свеженолученные эякулягы быков и хряков 85
4.8.Влияиие аутоспермоаитител па криоконсервацию спермы быков .89
4.9. Влияние аллоантител коров на оплодотворяемость 94
4.10. Изменение сервис-периода у коров 96
5. Экономическая эффективность от внедрения 105
Обсуждение полученных результатов 109
Выводы 118
Предложения 120
Литература 121
- Актуальность темы
- Основные положення, выносимые на защиту
- Взаимодействие антигена с антителом
- Изменчивость аутоспермоантител быков и хряков
Введение к работе
Сельскохозяйственное животноводство очень важная отрасль
производства. Успешное развитие этой отрасли обусловливается
множеством факторов. Некоторые из них решаются более легко, если
можно так сказать, "эволюционно"; некоторые несколько труднее, как
правило, "революционно". Подавляющее большинство биологических
проблем сельскохозяйственного животноводства решается
"революционно". Наиболее наглядным примером может быть проблема
воспроизводства сельскохозяйственных животных. Естественное
осеменение "революционно" сменилось искусственным осеменением.
Наиболее успешное развитие этой технологии отмечается в крупном
животноводстве и свиноводстве. Ученым и специалистам этих отраслей
животноводства известны какие биологические предпосылки
способствовали широкому внедрению в практику технологий искусственного осеменеия коров и свиней.
В настоящее время зоотехнической науке и практике известен
биотехнологический метод ускоренного воспроизводства
высокопродуктивных особей крупного рогатого скота - это технология трансплантации эмбрионов коров.
И хотя эти технологии воспроизводства практически приемлемы и экономически более эффективны, продолжительный период их использования показывает, что эти технологии далеко несовершенны.
В животноводстве отмечаются многочисленные факты неоплодотворяемости коров и свиноматок, длительный период их бесплодия; нередки случаи отхода новорожденного приплода.
Необходимость совершенствования этих технологий, обусловливается жесткими условиями капиталистического производства продуктов животноводства. В условиях свободных рыночных отношений, конкурентоспособность отрасли - это современные технологии,
эффективная организация труда и персональная экономическая ответственность. Новой областью научных исследований, способствующих повышению эффективности воспроизводства сельскохозяйственных животных, являются исследования влияния иммунных факторов (Соколовская И.И., 1967, 2003; Успенский А.Н., 1992; Дибиров М, 2000; Сердюк Г., 1975, 2000; Нежданов А.Г., 2003; Федоров Ю.Н., 2006 и др.).
Однако, большинство ученых считают, что отрицательное влияние иммунных факторов в воспроизводстве животных обусловлено патофизиологическими процессами половой системы самок и самцов. Поэтому, до настоящего времени не сложилось общего мнения о закономерности иммунологических механизмов в воспроизводстве животных.
В этой связи, главная задача наших исследований заключалась в изучении значения иммунных факторов в воспроизводстве крупного рогатого скота и свиней, степени их отрицательного влияния и возможности определения оптимальных мероприятий, исключающих или снижающих влияние этих факторов в животноводстве.
Материалы диссертационной работы являются частью
исследований темы кафедры морфологии и биотехнологии животных
Тверской государственной сельскохозяйственной академии,
обозначенной: "Изучение влияния иммунологических факторов в воспроизводстве крупного рогатого скота и свиней» (регистрационный государственный № 01.99.00 09299).
Актуальность темы
Актуальность темы. Промышленное развитие животноводства, достижения зоотехнической науки и ветеринарной медицины свидетельствуют, что эффективность и конкурентноспособность отрасли в значительной степени зависит от внедрения современных технологий ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных. Известно, что существуют общие схемы последовательного внедрения современных технологий ускоренного воспроизводства животных. Сегодня метод искусственного осеменения в крупном животноводстве дополняется биотехнологическим методам трансплантации эмбрионов, в ближайщим будущем технологией клонированием эмбрионов.
Биотехнологические методы воспроизводства сельскохозяйственных животных практически приемлемы, но далеки от совершенства. Искусственное осеменение коров и свиноматок сопровождается фактами неоплодотворяемости, потерей беремености и гибелью приплода в молозивный период.
Новой областью научных исследований, способствующих повышению эффективности воспроизводства, являются исследования роли иммунных факторов в процессе размножения животных (Успенский А.Н., 1992; Сердюк Г.Н. и др., 2000г; Соколовская И.И., 2003; Субботин А.Д., 2004; Федоров Ю.Н., 2006 и др.).
Публикации в этой области знания свидетельствуют об определенной роли иммунных механизмов в воспроизводстве животных, но они фрагментарны и не позволяют представить общепринятую теорию, указывающую на общебиологическую закономерность, а следовательно, целенаправленно воздействовать на темпы воспроизводство. Большинство ученых считают, что отрицательное влияние иммунных факторов в воспроизводстве животных обусловлено патологическими процессами. Противоречивость мнений обусловливает актуальность изучаемой проблемы.
Цель и задачи исследований. Главная цель исследований заключалась в определении значения иммунных факторов в воспроизводстве крупного рогатого скота и свиней, выяснении степени отрицательного влияния этих факторов, а именно: ауто- и аллоспермоантител самцов на качество спермы и самок на оплодотворяемость. Для решения поставленной цели решались следующие задачи: - изучить наличие и распространенность аутоспермоантител в свежеполученных эякулятах быков и хряков; - определить влияние аутоспермоантител производителей и их влияние на качество свежеполученных эякулятов и криорезистентность спермы; - определить наличие и распространенность аллоспермоантител и их влияние на оплодотворяемость коров и свиноматок; - изучить возможность внедрения эффективных подходов, способствующих снижению отрицательного влияния алло- и аутоспермоантител на качество и криорезистентность спермы, оплодотворяемость коров.
Научная новизна работы. В результате изучения значения иммунологических факторов в воспроизводстве крупного рогатого скота и свиней получены новые данные:
- в свежеполученных эякулятах клинически здоровых быков и хряков определяются аутоспермоантитела, обусловливающие агглютинацию спермиев в различном количестве, что определяет индивидуальные воспроизводительные способности самцов; - в работе обосновано, что широкое распространение ауто- и аллоспермоантител невозможно объяснить только патофизиологическими процессами в организме самцов;
- в работе показана индивидуальная и групповая изменчивость аутоспермоантител в эякулятах быков и хряков, по наличию аутоспермоантител производителей можно разделить на четыре группы, что значительно облегчает работу по групповому подбору особей при спаривании;
- определено, что спермоантитела характеризуются: титром, абсорбционной способностью и взаимодействием с антигеном, что свидетельствует об их иммунной природе;
- в секретах половых путей и сыворотке крови всех коров и свиноматок определяются аллоспермоантител а, агглютинирующие различное количество спермиев разных производителей от 10 до 100%, что обусловливает индивидуальную оплодотворяемость самок; установлено, что спермоантитела, как и все антитела, подразделяются на "полные" или поливалентные, и "неполные" -одновалентные. Взаимодействие спермиев с "полными" антителами контролируется визуально, с "неполными" по косвенным признакам; - впервые показана целесообразность селекции по способности образования спермоантител в крупном животноводстве и свиноводстве; -определенны экономические потери в результате отрицательного влияния спермоантител в воспроизводстве крупного рогатого скота, на 100 коров они составили 163000 рублей.
Практическая значимость. Результаты исследований целесообразно использовать на производственных подразделениях при получении спермы быков и хряков, оценке качества эякулятов и криоконсервировании спермы производителей, в хозяйствах на пунктах искусственного осеменения коров и свиноматок.
Основные положення, выносимые на защиту
Иммунология успешно развивается в течении последних десятилетий. Начало истории развития иммунологии считают с весьма успешных результатов работ Л. Пастера (Эфроимсон В.П., 1971; Добронравов А.В., 1978; Говалло В.И., 1980; Колотев В.Д. и др., 2004; Альперн Б, 1973; Вагонис З.И., 1969, 1972; Мухитдинов У.Б., 2000 и
В современном представлении иммунная система плацентарных обусловливает иммунологические реакции организма: - защищает организм в процессе онтогенеза от патогенной микрофлоры; -обеспечивает постоянство индивидуального антигенного полиморфизма особи в процессе онтогенеза, осуществляя иммунологический надзор; - элиминирует клетки или антигенные вещества, которые в результате мутационных и иных процессов приобрели признаки генети ческой чужеродности; -обеспечивает формообразовательные процессы в период развития особи.
Эти функции обусловливаются иммунокомпетентными клетками (ДыгинВ.Д., 1964;ШабалинВ.Е, 1969; Аверкина Р.Ф., 1973; УтешевБ.С, Бабичев Б.А., 1974; Галактионов В., 1983; Черешнев В.А., 2003; Пыцкий В.И., 2003; Мороз Т.Ю, 2003). Последние синтезируют циркулирующие антитела, обусловливают феномены клеточного иммунитета: трансплан тационньш иммунитет, гнперчувствителыюсть замедленного типа, реакцию «трансплантат против хозяина», иммунологическую толерантность.
К центральным органам иммунной системы относят тимус, фабрициеву сумку (у птиц) или ее аналог у млекопитающих, возможно, пейеровы бляжки или костный мозг. К периферическим лимфатические узлы, селезенку, салитарные фолликулы, кровь,, лимфатическая система (Шевелев А.С, 1978, 1985; Слободянник В.И., 2002, 2004; Шульга Н.Н., 2006 и др.).
Как отмечают Вязов О.Е., 1958, 1962; Кульберг А.И., 1982; Васильева З.Ф., 1984; Ярилин А.А., 1991 и др., исходным «началом» иммунокомпетентных клеток иммунной системы являются стволовые клетки костного мозга, которые, мигрируя в центральные лимфоидные органы и дифференцируясь там, утрачивают одни и приобретают другие антигены и функции. Попавшие в тимус, стволовые клетки дифференцируются в Т-лимфоциты (Т-клетки), а клетки, прошедшие. через фабрициеву сумку (или ее аналог у млекопитающих),— соответственно в В-лимфоциты (В-клетки). Т- и В-клетки после этого выходят из центральных лимфоидных органов и заселяют периферические, занимая в них строго определенные зоны: Т-клетки -Т-зоны, В-клетки—В-зоны. Тимус и фабрициева сумка содержат соответственно в основном Т- и В-клетки, периферические лимфоидные органы имеют их смесь, благодаря чему в присутствии антигена и вспомогательных клеток формируется клеточный и
К иммунологически компетентным клеткам относят лимфоциты и плазматические клетки, к вспомогательным — ретикулярные, макрофаги, эозинофилы и тучные клетки.
Основными продуцентами антител являются В-клетки. В-клетки обладают рецепторами - детерминантами иммуноглобулинов всех классов. Последние—IgM, IgG и IgA локализуются на разных лимфоцитах, лишь IgD располагаются на клетках, имеющих поверхностные детерминанты IgM. Находящиеся на мембране В-клеток иммуноглобулины своими Fab-концами ориентированы наружу. Максимальное число всех иммуноглобулиннесущих В-лимфоцитов обладает детерминантами IgM; IgG находятся на меньшем числе В-клеток (Anderson К.V., 1968; Зильбер Л.А., 1968; Земсков М.В., 1977; Шевелев А.С., 1978; Емельяненко П.А., 1987; Бережная Н.М., Сепиашвили Р.И., 2003; Коровушкин А.А., 2004 и др.).
В-клетка способна синтезировать в течение часа до 50000 молекул поверхностного иммуноглобулина, а на мембране ее может находиться до 0,3—1,5 х 105 его молекул. Иммуноглобулины не очень жестко связаны с поверхностью В-клетки, постоянно сходят с нее, полностью обновляясь за 8—20 час. У поверхностных и секретируемых иммуноглобулинов одинаковые параметры специфичности.
В-клетки предетерминированны к синтезу определенного класса иммуноглобулинов, осуществляемому, их потомками, тогда как у Т-клеток такой жесткой предетерминированности нет. Они способны взаимодействовать с несколькими В-клетками.
В-клетки распределяются среди лимфоидных тканей следующим образом: 0% в тимусе, 14% в грудном протоке, 28% в лимфоузлах, 33% в периферической крови, 56% в селезенке и 39% в костном мозге (Волкова Л.С., 1956, 1957; Булычева Т.И., 2000; Ильина Н.И., 2000 и ДР-) В-клетки дифференцируются в антителообразующие клетки плазмоцитарного ряда.
Взаимодействие антигена с антителом
Антигены и антитела взаимодействуют друг с другом, как целые молекулы, не утрачивая присущей антигенам "шарообразной" формы, а антителам — формы вытянутых эллипсоидов (Boyd В., 1969; Рохлин О.В. 1971 и др.). Установлено, что на одну молекулу антигена приходится значительное количество молекул антител и они создают слой толщиной до 30 А. Реакция антиген—антитело не завершается их распадом или отщеплением каких-либо продуктов.
Неизмененные антитела выделялись из многих комплексов антиген-антитело, чаще всего методом абсорбции клеточными антигенами (Дыбан А.П., 1964; Эфроимсон В.П., 1971; Тихонов В.Н., 1974; Marsh W., 1984;).
Антитела не проникают внутрь бактерий и животных клеток. Они вступают в реакцию с их поверхностными детерминантами. Связь эта хотя и прочна, тем неменее обратима.
Как отмечают Полянский Н.И., Максимов В.И., 1975; Михайленко А.А., Федотова Т.А., 2004 и др., в реакциях антиген— антитело in vitro различают две фазы. Первая фаза специфическая, невидимая, характеризуется адсорбцией антител на поверхности антигена или гаптена. При 37 она протекает довольно быстро, в течение нескольких минут; у криофильных антител — при +5. Вторая фаза неспецифическая, видимая, завершается феноменом агглютинации, преципитации или лизиса. В этой фазе в некоторых случаях необходимо присутствие электролитов (NaCl или MgCb) или
Определяющей особенностью иммунологических реакций является их специфичность, в этой связи, одна из основных задач любой теории иммунитета состоит в попытках объяснить эту специфичность и понять механизм образования антител и специфических рецепторов на лимфоидных клетках. Так как все антитела являются белками, изучение механизма их биосинтеза помогает решить один из основных вопросов современной биологии, а именно объяснить механизм биосинтеза специфичности антител (Эфроимсон В.П., 1971; Buckley R.H., 2003 и ДР-) На ранних этапах развития иммунологии наиболее распространены были "инструктивные" теории образования специфичности антител. Которые предполагали, что антиген привносит в организм новую информацию. Это обусловливало реакцию организма, проявляющуюся в образовании антител, структура которых представляет как бы зеркальное отражение структуры детерминантных групп антигена, определяющих его специфичность (Hull et al, 1949, 1951; Bloom S., 1966; Hiromantsu Y., 2003 и др.).
Наиболее ранними инструктивными теориями иммунитета были так называемые теории прямой матрицы, уподобляющие антиген типографской матрице. Однако "инструктивные" теории оказались в противоречии с данными о механизме биосинтеза белков. Поскольку было доказано, что чужеродные белки не могут включать, содержащуюся в них фенотипическую информацию, в генетическую информацию клеток, поскольку любая генетическая информация кодируется генами, содержащимися в ДНК (Дубинин Н.П., 1967).
На современном этапе развития биологии центральная догма имеет вид; ДНК — РНК—белок, т. е. допускает возможность как прямой, так и обратной транскрипции, но полностью исключает возможность переноса генетической информации с белка на нуклеиновые кислоты.
Наибольшее признание получили, так называемые селективные теории иммунитета, основанные на предположении о том, что вся возможная иммунологическая информация закодирована в генетическом аппарате тех или иных клеток иммунной системы, а роль антигена сводится только к отбору, селекции клеток, вырабатываемых клеткой молекул, способных специфически реагировать с данным антигеном (Burnet F.M., 1964, 1970).
Первая селективная теория иммунитета была сформулирована создателем учения о химиотерапии Паулем Эрлихом и получила название теории боковых цепей. Согласно этой теории, на поверхности клеток существуют рецепторы любой специфичности, причем связывание того или иного рецептора со специфическим антигеном вызывает образование избыточного количества этих рецепторов, они не помещаются на поверхности клеток и попадают в кровь, функционируя в качестве антител. Теория Эрлиха была отвергнута, так как допускала, что в организме заранее существуют антитела, способные соединяться с любым антигеном (Шевелев А.С, 1978 и др.).
По общепринятому мнению, в любой клетке организма содержится генетическая информация развития всего организма, но активация этой информации в обычных условиях невелика и выявляется в различных клетках по-разному. Основная ее часть репрессирована. В соответствии с теорией генетической регуляции, разработанной Жакобом и Моно на модели бактериальных клеток, помимо структурных генов, существуют гены, контролирующие активность структурных генов (Edited L., 1983; Ballow М, 2003 и др.).
Изменчивость аутоспермоантител быков и хряков
Аллоспермоантитела у коров. В период широкого практического внедрения современных биотехнологических методов ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных особо остро встаёт вопрос о высокой эффективности каждого технологического этапа этого сложного процесса. Так при искусственном осеменении коров весьма важно добиться их оплодотворяемости от первого осеменения в пределах 80-85%.
Как свидетельствуют результаты исследования ряда авторов (Колесник Н.Н., 1972; Ильинский Е.В., 1976; Соколовская И.И., 1976, 2003; Сираджинов Р.С., 1974; Лозовик Н.,1994; Слободянник В.И., 2000, 2002, 2004 и др.), в некоторых случаях в секретах половых путей коров могут появляться спермоантитела к антигенам спермиев быков, что исключает их оплодотворяем ость.
В этой связи нами изучалось наличие и распространенность спермоантител в секретах половых путей коров (табл. 11).
В секретах половых путей всех коров определяются аллоантитела к антигенам спермиев быков, агглютинирующие различное количество спермиев. Более того, оплодотворяемость коров находится в прямой зависимости от количества комплиментарных спермоантител секретов половых путей. В этой связи оценка иммунной совместимости быков и коров по наличию спермоантител в секретах половых путей последних, является практической необходимостью при применении метода искусственного осеменения. Таблица 11- Распространенность спермоантител в секретах половых путей у коров
Это свидетельствует о том, что даже у коров с низкой предрасположенностью к образованию спермоантител, иногда по непонятным причинам, резко повышается иммунологическая реактивность, что и усиливает образование спермоантител. Действительно, в широкой практике животноводства известно, что после абортов или рождения мертворожденных телят большинство коров переходят в категорию труднооплоотворяющихся особей (Диков П., 1972; Кэсида Л.Э., 1974; Ильинский Е.В.,1976; Сысоев А.А., 1978; Кауффольд П. и др., 1990; Преображенский О.Н., 2001; Полянцев Н.И., 2004; Харламов Ю.Е., 2002; Грига Э.Н., 2003; Мадисон В.В. и др., 2005; Мозжерин В.И. и др., 2006.).
По мнению Шевелева А.С. (1978), Васильевой З.Ф. и Шабалина В.Н. (1984) и др., аборты неинфекционного происхождения, а также рождение нежизнеспособного приплода, в большинстве случаев обусловлены иммуноконфликтными беременностями.
Обращает на себя внимание тот факт, что несмотря на значительные индивидуальные различия особей по содержанию спермоантител, всех коров можно условно разделить на 3 группы (в отличие от быков- производителей - 4 гр.). Полученные результаты показаны в таблице 12. В 1 группу включены коровы (17%) в секретах половых путей которых количество агглютинируемых спермиев не превышает 20% и в течение
Всего 177 30 17 121 68 26 15 года этот процент практически не повышается. Вторая группа (68%), это особи, у которых количество агглютинируемых спермиев может изменяться в течение 20-40 дней после осеменения или отёла. И третья группа коров (15%) в секретах половых путей которых агглютинируется значительное количество спермиев (40-80%) большинства быков в течение года. Разделение коров на вышеуказанные группы, значительно повышает необходимость понимания селекции животных по данному признаку. С этих позиций вполне понятны и объяснимы многочисленные факты неоплодотворяемости коров после 2 -4 кратного искусственного осеменения при отсутствии на то видимых причин.
Снижение количества выхода телят на 100 коров в промышленных хозяйствах обусловлено, в основном, за счет неоплодотворяемости коров третьей группы. Поскольку для коров этой группы трудно подобрать сперму от иммунологически совместимого быка-производителя.
Ещё Малаховский А. Я. (1960) утверждал, что наблюдаемое бесплодие у некоторых клинически здоровых самок трудно ликвидировать даже при замене производителя. Подобные высказывания можно встретить и у ряда других авторов (Тихонов В.Н., 1967; Никитин А.К., 1979 и др.).
Аллоспермоантитела у свиноматок. Как было отмечено ранее, до настоящего времени, по мнению большинства ученых, главной причиной наличия у самок антител к спермиев самцов являются патологические процессы.
