Содержание к диссертации
Введение
2. Основная часть 9
2.1. Обзор литературы 9
2.1.1. Физиологическое состояние быков–производителей 9
2.1.2. Показатели спермы и оплодотворяющая способность 15
2.1.3. Методы оценки качества сперматозоидов 23
2.1.4. Факторы, влияющие на воспроизводительную функцию быков– производителей 31
2.1.5. Гипертермия и ее последствия на организм животных 38
2.2. Материал и методы исследований 51
2.3. Результаты исследований 57
2.3.1. Физиологическое состояние быков–производителей 57
2.3.2. Разработка автоматического метода комплексной оценки качества спермы быков-производителей с помощью отечественного спермоанализатора SFA-500 57
2.3.2.1. Разработка протокола исследований спермы быков-производителей .58
2.3.2.2.Апробация разработанного метода 59
2.3.2.3.Влияние технологических этапов криоконсервации на динамику качественных характеристик спермы быков-производителей 65
2.3.2.4.Зависимость оплодотворяющей способности от скорости движения сперматозоидов быков-производителей .70
2.3.3. Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разного возраста .73
2.3.3.1.Этапы исследования в зависимости от продолжительности высокотемпературной атмосферной аномалии .73
2.3.3.2.Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной
аномалии на воспроизводительную способность быков-производителей в возрасте 5-6 лет 76
2.3.3.3. Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей в возрасте 9-11 лет .79
2.3.3.4.Сравнение влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на качество спермы быков–производителей разного возраста (в экономическом аспекте) 82
3. Заключительная часть .87
3.1. Обсуждение результатов исследования 87
3.2. Выводы .91
3.3. Рекомендации производству 93
Список сокращений 94
Список литературы 95
Приложения 120
- Показатели спермы и оплодотворяющая способность
- Разработка протокола исследований спермы быков-производителей
- Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разного возраста
- Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей в возрасте 9-11 лет
Введение к работе
Актуальность исследований. Важнейшей задачей интенсификации животноводства и повышения уровня племенной работы является совершенствование технологии оценки качества спермы. (Эрнст Л.К., 2004; Десятов В.Г. и др., 2004; Амерханов Х.А., Абилов А.И., 2011).
Используемые в практике племпредприятий критерии биологической оценки спермы не имеют стабильной корреляции с оплодотворяющей способностью и неполностью отражают биологической полноценности сперматозоидов (Hallap Т., 2005; Турчанов С., 2008).Совершенствование методов оценки качества спермы находится в центре внимания многих зарубежных специалистов (Leiding С. еt al, 2009; Singh А. et al, 2012; Vincent Р. еt al, 2012). В частности, представляет также интерес изучение влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разных возрастных категорий.
Цель исследований. Разработать новые технологические элементы при оценке спермы и изучить влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей.
Задачи:
- изучить физиологическое состояние быков–производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей;
- определить качественные характеристики спермы на разных технологических этапах в сравнительном методическом аспекте, уточнить распределение сперматозоидов по скорости движения и ее связь с качеством спермы;
- выяснить взаимосвязь между скоростью движения сперматозоидов с их выживаемостью после замораживания–оттаивания и влияние ее на результат искусственного осеменения;
- разработать комплексный метод оценки качества спермы с помощью отечественного спермоанализатора SFA-500
- изучить влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей;
- сравнить степень влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на показатели спермы быков–производителей разного возраста.
Научная новизна. Представлен новый модифицированный метод определения качественных и количественных характеристик спермы быков-производителей на всех этапах технологического процесса, на основе лазерного анализа частотного спектра флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов, вызванных их движением через оптический канал со специальными характеристиками при помощи спермоанализатора SFA-500.
Изучено влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей голштинской породы в зависимости от возраста. (Данный раздел диссертационной работы выполнен при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере», грант №702).
Практическая значимость работы. Определено общее физиологическое состояние быков-производителей на основе биохимических, гематологических и сперматологических показателей. Разработан, апробирован и внедрен новый метод комплексной оценки спермы быков-производителей при помощи отечественного спермоанализатора SFA-500 в нашей модификации. Установлена зависимость результата искусственного осеменения от скорости движения сперматозоидов после замораживания-оттаивания.
Выявлена степень отрицательного влияния продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разных возрастных групп.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены, обсуждены и одобрены на: конференциях лаборатории эмбриологии и биологии воспроизводства сельскохозяйственных животных Центра биотехнологии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии 2008-2014гг; международной научно-практической конф. «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» / РАМЖ, пос.Быково, Моск.обл., 2013;науч.-практ. конф. молодых ученых «У.М.Н.И.К.» / ВИЖ, 2013; получен грант №702.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, заключительной части, списка сокращений, библиографического списка, приложений. Материал изложен на 128 страницах печатного текста, содержит 22 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 222 источника, в том числе 76 на иностранных языках.
Показатели спермы и оплодотворяющая способность
Оплодотворяющая способность спермы быков-производителей – важный биологический и экономически значимый признак. Даже при значительном объеме банка спермы быков, но низкой оплодотворяющей способности спермы будет получено меньше дочерей быков, будут значительные перегулы и эффективность в итоге будет низкой. В «Инструкции по оценке бычков молочных, молочно-мясных пород по качеству потомства» в период проверки их по собственным показателям предусмотрена выбраковка молодых быков с оплодотворяющей способностью менее 50% (Митюков А.С., 1996). Небольшая доза для осеменения, вследствие разбавления спермы, приводит к тому, что в половые пути самки попадает небольшое количество сперматозоидов, что повышает требования к их качеству, в конечном итоге, определяющему степень оплодотворяющей способности. Прогнозирование оплодотворяющей способности должно служить основным критерием при окончательном решении об использовании каждого конкретного эякулята в дальнейшем. Изучение качественных показателей спермы и их связи с оплодотворяющей способностью является важным направлением в искусственном осеменении животных.
В литературе имеется много работ по оценке качества сперматозоидов с целью определения их связи с оплодотворяющей способностью. Необходимо сказать, что многие ученые отмечают, что оплодотворяющая способность спермы отличается не только тем, от какого производителя она получена, но и какая это сперма: нативная или замороженно–оттаянная от одного и того же производителя (Nadarajah K, 1988; Watson P.F., 2000). Такие показатели качества спермы, как подвижность сперматозоидов, целостность их мембран и митохондриальная активность связаны друг с другом и коррелируют с оплодотворяющей способностью (Антонюк В.С., 1984; Малиновский А.М., 1994; Шапиев И.Ш. и др., 1994; Кононов В.П. и др., 2007; Zuge R.M. et al, 2008). Ученые установили, что корреляция между этими параметрами и оплодотворяющей способностью имеет довольно большой диапазон (Januskauskas A. et al, 2003). Бондарев Г.Ф. (1968) определял оплодотворяющую способность спермы быков-производителей с помощью ультразвука и доказал, что есть связь между реакцией на ультразвук и оплодотворяющей способностью Основным показателем реакции сперматозоидов на ультразвук считал разницу между количеством мертвых сперматозоидов до и после воздействия. Например, если в день обработки подвижность сперматозоидов была ниже на 1-2 балла по сравнению с контролем, то в последующие 2-3 суток этой разницы не было. Данные показывают, что малая терапевтическая интенсивность ультразвука (0,5-1 Вт/м2) не влияет отрицательно на переживаемость, способствуя отсеву слабых сперматозоидов. Другой ученый использовал скорость оседания сперматозоидов как показатель оплодотворяющей способности спермы быков и показал, что сперматозоиды со скоростью оседания до 13см/3мин имеют худшую активность, переживаемость и оплодотворяющую способность, которая составила 58,4% против 63,1% при достоверной разности (р 0,05) (Вагенлейтер А.В., 1978). Шапиев И.Ш. и др. (1994) выяснили, что величина стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом после шока и замораживания имеет высокую связь с оплодотворяющей способностью замороженной спермы (r=+0,70). Такая же связь и в свежеполученной сперме. Если стимуляция дыхания в свежеполученной сперме выше 3,6, то оплодотворяющая способность замороженной спермы больше 60%/ В своих опытах Антонюк В.С. (1984) установил взаимосвязь оплодотворяющей способности, подвижности сперматозоидов, их концентрации в эякуляте с активностью дыхательных ферментов. В предсказании оплодотворяющей способности может использоваться компьютерная система. Индекс оплодотворяемости коррелировал с определенным компьютером процентом подвижных клеток от 0 до 1,5 часа после оттаивания, скоростью или комбинацией подвижности спермы и скорости (Budrtorth P.R. et al., 1987). Yenz R.M. (1988) прогнозировал оплодотворяющую способность по реакции акросом сперматозоидов быков на хондроитинсудьфат (смесь трех изомеров глюкозоаминоглюкана, секретируемого половым трактом коров) in vitro. Полученные им данные свидетельствуют о возможности использования этого метода. Сперматозоиды быков, отделенные от семенной плазмы центрифугированием спермы при 200 об/мин в течение 10 минут, инкубировали в течение 9 ч. в среде, содержащей хондроитинсульфат, наблюдая за реакцией их акросом под микроскопом. В опыте использовали две группы быков: первая группа с известной оплодотворяющей способностью их спермы, вторая группа – с неизвестной оплодотворяющей способностью. Коэффициент корреляции между частотой акросомной реакции и оплодотворяющей способностью быков первой и второй групп достигала соответственно 0,98 и 0,81.
Также И.Ш. Шапиевым и др. (1994), В.П. Кононовым (2007), S. Parland (2007) доказано, что оплодотворяющая способность спермы напрямую связана с точностью ее комплексной оценки по ряду факторов и зависит от целостности и стабильности биологических мембран.
Реакция восстановления реазурина (RRT) оценивает метаболический статус активных сперматозоидов, связанный с концентрацией подвижных сперматозоидов (Dart M.G. et al., 1994). Некоторые ученые отметили значительную корреляцию между спектрофотометрической оценкой RRT и оплодотворяющей способностью у быков (Foote R.H., 1999). Подвижность обычно считается одной из самых важных характеристик, связанных с оплодотворяющей способностью спермы. Действительно, подвижность была признана давно необходимым параметром для транспортировки сперматозоидов через женский репродуктивный тракт и для оплодотворения. Подвижность - это выражение жизнеспособности и структурной целостности сперматозоидов.
Разработка протокола исследований спермы быков-производителей
Некоторые работы с фотомикрографией показывают, что сперматозоиды с высокой скоростью движения могут быть менее эффективными. Этот факт объясняют связью между малой амплитудой боковых смещений головки и очень быстрой линейной скоростью. Малая амплитуда боковых движений головки связана с плохой проникающей способностью в цервикальной слизи и снижением оплодотворяющей способности. Очень высокая скорость сперматозоидов может быть связана со снижением долговечности сперматозоида, вызванного ранним истощением внутриклеточной АТФ, которая производятся в митохондриях сперматозоидов. Итак, показано, что медленная или вялая линейная или нелинейная подвижность – лучшая форма движения сперматозоидов, чем быстрая и линейная. (Dunphy B.C., 1989; Rajender S. et al., 2010). Работами А.М. Малиновского и др. (1994) доказана зависимость оплодотворяющей способности спермы барана от скорости движения сперматозоидов. Ученые ВНИИплем разработали и апробировали новый объективный способ прогнозирования оплодотворяющей способности замороженной спермы барана. В оттаянной сперме барана наряду с известными показателями ее качества (подвижность и концентрация сперматозоидов в 1 мл спермы) определяют новый биоэнергетический показатель: среднюю скорость движения сперматозоидов. Измерение данного показателя проводят в специальной камере при температуре +25С под микроскопом с увеличением 300х. Для измерения времени пробега сперматозоидом участка пути известной длины используют электронный секундомер-сумматор. В каждом эякуляте определяют скорость движения у 100 сперматозоидов и рассчитывают среднюю величину их скорости.
Средняя скорость движения сперматозоидов барана составляет 72 мкм/сек (пределы 45,7-98,5 мкм/сек). Установлена высокая устойчивая отрицательная корреляция между скоростью движения сперматозоидов и ее оплодотворяющей способностью (r=-0,999). Лучшая суягность овцематок (50,6%) отмечена при осеменении спермой со средней скоростью движения сперматозоидов от 45 до 74 мкм/сек по сравнению с овцематками, осемененными спермой со средней скоростью движения сперматозоидов 81,3 мкм/сек (18,6%) (Малиновский А.М., 1994). Такие показатели качества спермы, как, например, средняя скорость движения по прямолинейной траектории, доля клеток с аномалией хвоста, и нелинейная моторика показали значимую корреляцию с оплодотворяющей способностью после искусственного осеменения. Несколько групп иностранных ученых также сообщают о значимой корреляции между подвижностью, скоростью движения сперматозоидов и оплодотворяющей способностью быков-производителей (Gillan L. et al, 2008; Kathiravan P. et al, 2011). P. Vyt и другие доказали, что доля подвижных сперматозоидов оказывают значимое (P 0,05) и положительное влияние на общее количество поросят, родившихся (размер выводка), и число живорожденных поросят (P.Vyt et al., 2008). Зверева Г.В. и другие (1980) определили, что оплодотворяющая способность положительно коррелирует с активностью ацетилхолинэстеразы в сперме быков. Помимо вышеперечисленных причин, оплодотворяющая способность спермы быка зависит от адаптивного потенциала сперматозоидов (Дарий Г.Е., 1997). Экспериментально определена взаимосвязь изменения характеристик светорассеяния с параметрами состояния спермы (концентрацией и подвижностью). Разработана методика определения качества спермы путём измерения параметров концентрации сперматозоидов нефелометрическим методом, позволяющая повысить точность на 30%. Повышена точность метода на 20% относительно традиционного микроскопического и одновременно на порядок снижена трудоёмкость оценки репродуктивной полноценности за счет определения концентрации и подвижности сперматозоидов лазерным нефелометрическим методом и методом обработки визуальных изображений (Пырикова С. И., 2002). Точное измерение концентрации является первым и важнейшим шагом в технологии производства спермодоз. Правильная оценка концентрации сперматозоидов имеет огромное значение для обеспечения необходимого числа сперматозоидов в дозе для осеменения, концентрация должна соответствовать требованиям так, чтобы за эякуляцию можно было заготовить максимальное количество спермодоз (Zrimek P., 2011). Тем более, что все чаще ученые показывают возможность снижения количества сперматозоидов в дозе для осеменения (Субботин А.Д. и др., 2011).
Даже в нормальном эякуляте встречается некоторое число уклоняющихся форм сперматозоидов. К ним относятся гигантские и карликовые сперматозоиды с деформацией головки, с двумя головками, с надломом у шейки, изолированными головками, сперматозоиды с искривленным или закрученным хвостом, с двумя хвостами, утолщением хвоста и др. Сперма, содержащая большой процент патологических форм сперматозоидов, для искусственного осеменения непригодна. Чтобы определить количество таких сперматозоидов в сперме, нужно на чисто вымытое обезжиренное спиртом и эфиром предметное стекло нанести каплю спермы и сделать мазок. Мазок просушивают в течение 1—2 мин, фиксируют в 96-ном спирте, окрашивают раствором фуксина или метиленовой синьки, просматривают под микроскопом при увеличении не менее чем в 600 раз и подсчитывают в нескольких полях зрения не менее 500 сперматозоидов. В каждом поле зрения подсчитывают нормальных по форме спермиев и патологических. После подсчета тех и других вычисляют процент патологических форм сперматозоидов. Преобладание в сперме патологических форм сперматозоидов с деформацией головки, гигантских и карликовых является показателем нарушения функции семенников (хроническое воспаление, перегрев). Наличие в сперме сперматозоидов деформацией хвоста и распавшихся сперматозоидов связано с патологическим состоянием выводящих путей и придаточных половых желез, а также с длительным пребыванием спермы в выводящих путях при редком половом использовании производителя, нарушением терморегулирующей функции мошонки или с перегреванием семенников. Закручивание хвостов у сперматозоидов может быть вызвано попаданием в сперму воды. Сперма быка допускается к использованию, если в ней содержится не более 18% патологических сперматозоидов (Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков-производителей, 2008).
Морфологические аномалии сперматозоидов могут иметь отрицательное влияние на оплодотворение и эмбриональное развитие, но достоверной корреляции с оплодотворяющей способностью в основном, учеными не получено, хотя есть некоторые данные о связи между морфологией сперматозоидов и оплодотворяющей способностью (Al-Makhzoomi A. et al, 2008; Saacke R.G. et al, 2008). Различия в морфологии спермы обнаруживаются у большинства видов млекопитающих, и ученые предполагают, что они могут привести к тому, что сперматозоиды будут иметь различную по структуре подвижность (Miro J. et al, 2005). При получении от быков и баранов спермы с пониженной подвижностью сперматозоидов (косвенный показатель содержания в ней большого процента патологических сперматозоидов) нужно дополнительно исследовать (Родин И.И. и др., 1981) их морфологический состав и при показаниях применять стимулирующие средства (массаж семенников и кофеин отдельно или в комплексе, холостые садки). Ученые не установили связи оплодотворяющей способности с фрагментацией хроматина ядра (Addad R.O., et al, 2009). Снижение оплодотворяющей способности спермы на 10% ведет за собой уменьшение валового производства на 11318 т и для восполнения этой разницы 2390 дочерям быка с низкой оплодотворяющей способностью необходимо иметь продуктивность на 1017 кг больше по сравнению с их сверстницами в первом случае. Повышение оплодотворяющей способности спермы позволяет увеличить валовое производство молока при одинаковом уровне продуктивности стада коров. По сообщению А.С. Митюкова и З.С. Эскелевой (1987), чтобы плодотворно осеменить корову спермой быка, имеющую 22%-ю оплодотворяемость, необходимо израсходовать 9 спермодоз. Если же у быка оплодотворяющая способность спермы 80%, то на плодотворное осеменение потребуется всего 2,5 спермодозы. Также необходимым условием что при хорошей работе по репродукции стада с использованием искусственного осеменения является показатель оплодотворяемости от первого введения спермы 60-70% (Федотов С.В., 2008). Повышение продуктивности коров благодаря использованию быков-производителей с высокой оплодотворяющей способностью их спермы – значимый фактор в селекционной работе. Вот почему этот показатель должен быть одним из основных при оценке племенной ценности быка.
Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей разного возраста
В настоящее время предложено множество методов определения качества спермы сельскохозяйственных животных: биологические методы в основном изложены в монографии В.К. Милованова (1962), определение скорости движения (Ван-Дюйн, 1964; Иванов Г.И. 1971; Ельчанинова Л.П., 1972; Abaigar T. et al., 1999; Quintero-Moreno A. et al., 2003; Miro J., 2005). Выявлена достоверная обратная зависимость между оплодотворяющей способностью и скоростью движения сперматозоидов (Платов Е.М. и др., 1981; Малиновский А.М. 1994; Sozanska A. et al., 2005; Vyt P. et al., 2008). Разработка методов для точной и объективной оценки функциональной полноценности спермы очень важна при создании банка генофонда и для повышения эффективности научных исследований, связанных с методами ее сохранения (Sozaska A. et al, 2005; Singh A. et al, 2012). В связи с вышеизложенным в последние годы был поиск более точных и объективных критериев и экспресс-тестов для оценки спермы до и после криоконсервации. Вместе с тем большое внимание было уделено разработке методов дифференциации сперматозоидов по их функциональному состоянию и автоматизации этого процесса. Предложены новые критерии и методы оценки, а также экспресс-тесты, основанные на исследовании антигенных свойств сперматозоидов, иммунофлуоресценции, проницаемости мембран и функционального состояния энергетической системы; определении трансмембранных перемещений ионов К+, Nа+ и Са++ с использованием ионоселективных электродов, потенциала энергетического пробоя мембраны, температуры фазового перехода липидов; измерении скорости движения сперматозоидов, степени повреждения акросом, утечки из клеток ферментов; использовании флуоресцентных зондов (Шапиев И.Ш. и др., 1994; Janukauskas А., ilinskas Н., 2002; Felipe-Prez Y.E. et al, 2008).
Соколовская И.И., Ойвадис Р.Н. и Абилов А.И. (1981) описали акроскопический метод, основанный на использовании темно-польного конденсора вместо фазово-контрастного. Пригодными для использования можно считать образцы оттаянной спермы, в которых сперматозоиды сохранили не менее 30% акросом, так как 15-20% поступательно движущихся сперматозоидов могут иметь акросомные повреждения.
Оценка состояния акросом и целостности мембран сперматозоидов может быть дополнительным тестом для отбора эякулятов для замораживания спермодоз (Никиткина Е.В., 2004). Также поврежденную акросому сперматозоидов выявляют по активности фермента акрозина (Lax Y. et al, 2004). Альтернативой этому методу можно применять HOST метод для определия функциональной целостности мембан сперматозоидов (тест гипоосмотического отека) с использованием флуоресцентных маркеров, т.к. именно мембрана первая повреждается в процессе криоконсервации (происходит криокапацитация и фрагментация хроматина), что ведет за собой снижение жизнеспособности и подвижности сперматозоидов (Khaliva T.A.A. et al, 2008; Celeghini E.C. et al, 2008;). Недорогой и практичный метод - waterest (WT), оценивающий целостность мембан криоконсервированных сперматозоидов, был предложен учеными альтернативой HOST-методу (Navarujillo H. et al, 2011). Некоторые ученые оценивали количество живых сперматозоидов после криоконсервации путем окрашивания 2 способами: эозином и тройным окрашиванием (TriSt) в сравнительном аспекте. Эозин-окрашивание показало, что после оттаивания менее 50% сперматозоидов выжило, тогда, как TriSt – окрашивание нашло только треть выживших сперматозоидов (Felipe-Prez Y.E. et al, 2008). Но существующие различные протоколы окрашивания, разработанные для оценки качества, требуют высококвалифицированного сложного оборудования, такого как флуоресцентные зонды и флуоресцентный микроскоп. Кроме того, использование флуоресцентных пятен требует специальной обработки, ухода, хранения и одноразовых контейнеров (Felipe-Prez Y.E. et al, 2008). Тестирование фертильности и очистка спермы может потенциально быть улучшены за счет применения нанотехнологий. Белки семенной плазмы, очевидно, имеют потенциал для предсказания фертильности (Flowers W.L., 2013). Проверка качества спермы с помощью биомаркеров, которые дифференцируют специфические белки спермы - лиганды, может объективно оценить будущую фертильность. Более чем 400 белков, находящихся на поверхности сперматозоидов, могут быть отделены с использованием магнитных наночастиц, это обеспечивает быстрое, эффективное удаление дефектных сперматозоидов в сперме (Sutovsky P., Kennedy C.E., 2013). Для определения фертильности самцов и влияния различных факторов на качество свежей и замороженной спермы в последнее время все чаще используют метод экстракорпорального оплодотворения ооцитов (Сингина Г.Н., Тарадайник Т.Е., 2013). Для оценки качества спермы все большую значимость приобретает такой показатель, как подвижность сперматозоидов. Визуальная оценка подвижности с помощью микроскопа субъективна. Объективную оценку подвижности могут дать методы с использованием экспонированной фотосъемки и микрокиносъемки движущихся сперматозоидов. Иванов Г.И. (1971) определял скорость движения сперматозоидов путем фотографирования. На основе фотографирования удавалось сразу определить активность спермы по числу движущихся, числу живых и мертвых и ненормальных, их скорость движения, концентрацию, резистентность спермы. Другие исследователи определяли качество спермы по видеомикрографической оценке. Опыты провели с помощью компьютера, соединенного с черно-белой видеокамерой, связанной с фазово-контрастным микроскопом. Они показали, что для точной оценки качества спермы быка необходимо оценить 12 кадров, сделанных со скоростью 25 снимков в секунду. Для оценки подвижности сперматозоидов требуется минимум 5, а оценки скорости их движения – 6 кадров, концентрация оцениваемой спермы составляла 0,08 млн/см3. Для оценки концентрации спермы объем камеры для спермы составлял 10мкл. Не учитывали сперматозоиды со скоростью движения менее 18мкм/с и более 150мкм/c, чтобы исключить при оценке сперматозоиды с повышенной из-за посторонних воздействий скоростью движения или неподвижные сперматозоиды. Исследования показали пригодность новой методики для оценки качества спермы по подвижности, концентрации и скорости движения сперматозоидов в сравнении с традиционными методами (Rath D, 1987).
Влияние продолжительной высокотемпературной атмосферной аномалии на спермопродукцию быков-производителей в возрасте 9-11 лет
Новый метод сортировки спермы с помощью «лазерной ловушки», предложили ученые университетов Калифорнии, который позволяет отделять быстро двигающиеся сперматозоиды от более медленных. Это позволило значительно повысить эффективность процедуры экстракорпорального оплодотворения человека и сельскохозяйственных животных за счет отбора более жизнеспособных клеток. Предлагаемый метод основан на использовании конусообразных линз – так называемых аксиконов, которые в комбинации со стандартной линзой и лазером формируют кольцеобразный фокус (кольцеобразную лазерную ловушку). Подобное приспособление применяют также для лазерной обработки и захвата атомов. Ученые утверждают, что предлагаемый метод можно использовать также для сепарации сперматозоидов, несущих различные половые хромосомы, это возможно благодаря тому, что содержащие Х-хромосому клетки, как правило, тяжелее и перемещаются медленнее, чем более легкие сперматозоиды с Y-хромосомой Sozaska A. и др. (2005) иллюстрируют динамику движения сперматозоидов на основе численной обработки оптического контраста спермы, образцы которой соответствуют анализу серой шкалы на уровне накладываемого изображения. Разработанный численный алгоритм позволяет найти относительное количество подвижных сперматозоидов. Пырикова С.И. (2002) создала математическую модель биологически подвижной среды (спермы) для определения параметров движения сперматозоидов методом траекторной обработки, позволяющая оценить количество активно-подвижных, слабо-подвижных и неподвижных сперматозоидов и тип их движения. Разработан алгоритм траекторной обработки и специализированное программное обеспечение для реализации метода обработки визуальных изображений применительно к объекту исследования. Предложена новая концепция оценки качества спермы, основанная на расчетах частиц, имеющих хвостовую часть («пригодных сперматозоидов»), которая позволяет уменьшить общее число клеток на дозу, применяется в системе ISAS (Корнеенко-Жиляев Ю.А., Солер К., 2011).
Еще в 1938 г. В.А. Морозов предложил другое направление в поисках объективной оценки спермы: вместо оценки подвижности определять число живых сперматозоидов. Для различения живых и мертвых сперматозоидов описал объективный метод, основанный на том, что живые сперматозоиды, способные поступательно двигаться, не воспринимают красок, в то время как мертвые легко окрашиваются той же краской. Ученые утверждают, успешное оплодотворение не может быть связано только с количеством нормальных сперматозоидов и, в особенности с их функциональной целостностью. Оценка качества спермы и оплодотворяющей способности на молекулярном, клеточном и на уровне целостностного организма животного необходима для предсказания воспроизводительной функции быков, для чего используют поток цитометрии в сочетании с люминесцентными методами, электронный подсчет клеток и компьютерный анализ области изображения (Rodriguez-Martinez H, 2008). Разработано множество методик определения качественных характеристик для электронной, люминесцентной, фазовоконтрастной и темнопольной микроскопии (Милованов В.К., 1962; Варнавский А.Н. и др., 1972; Ойвадис Р.Н., 1980; Соколовская И.И., 1981; Абилов А.И., 1996; Шишова Н.В., 2006; Шапиев И.Ш. и др., 2007; Rodriguez- Martinez H, 2008). Лабораторные методы, которые оценивают один параметр, не являются эффективными для оценки качества спермы, тем не менее, сочетание нескольких методов может обеспечить наилучшее предсказание фертильности (Rodriguez-Martinez H., 2003). На протяжении многих лет, ученые прилагают все усилия, чтобы разработать лабораторные анализы, которые позволили бы точно оценить оплодотворяющую способность спермы. Лабораторный анализ должен быть полезным, объективным, воспроизводимым, точным и, насколько это возможно, быстрым (Partyka A. et al, 2012). Создание различных методических подходов и устройств для объективного определения характеристик сперматозоидов, позволяющих вычислять их подвижность и концентрацию, однозначно является необходимостью. Среди них имеют приоритетное исследовательское значение компьютерные системы анализа фертильности спермы, включающие микроскоп и видеокамеру с цифровой обработкой изображений. Также ученые отмечают направление, в котором нужно двигаться исследователям, - компактность и удобство использования разрабатываемых приборов (Букаров Н.Г. и др., 2011). Развитие оптических методов позволило создать новые подходы к оценке характеристик подвижности сперматозоидов. Для определения основных показателей фертильности спермы человека был разработан принципиально новый прибор SFA–500, который позволяет измерять концентрацию, суммарную подвижность, количество активно подвижных и среднюю скорость сперматозоидов (Габбасов З.А. и др., 1999; патент РФ № RU 83138 U1, 2009). Существует множество анализаторов спермы быков-производителей импортного производства, например SQA-Vb MES (Израиль), AndroVision Минитюб (Германия), которые имеют существенный недостаток по сравнению с отечественным SFA-500 НПФ «Биола» (Россия) – это высокая цена.
