Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
Теоретические основы замораживания биологических объектов II
Морфологические, биохимические и физиологические изменения в семени сельскохозяйственных животных под действием низких температур 19
Защитный эффект различных компонентов синтетических сред при замораживании семени производителей сельскохозяйственных животных 29
Действие различных способов технологической обработки семени на жизнеспособность гамет быков-производителей і 38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
Общие методические положения 51
Морфологические и биохимические исследования семени быков-производителей 52
а) Морфологическое состояние акросомы 52
б) Методика определения сульфгидрильных групп в
семени быков-производителей 53
в) Определение устойчивости связи между белками
и липидами 55
г) Методика определения активности глутамино-
аспарагиновой трансаминазы в плазме семени
сельскохозяйственных животных (К.Ф.2.6.І.І.) 56
д) Определение аминокислот в гаметах быков-про
изводителей 58
Определение оптимальной концентрации веществ при разработке синтетической среды для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках 59
Изучение действия разных режимов охлаждения семени на биохимические и морфологические показатели гамет быков-производителей 60
Изучение влияния разных режимов охлаждения, замораживания и оттаивания семени быков-производителей на физиологические показатели
гамет 61
2.6. Научно-производственный опыт по осеменению
коров и телок 63
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 66
Морфологические и биохимические изменения гамет под действием замораживания и оттаивания семени быков-производителей 66
Действие антиоксидантов на биохимические и морфологические показатели гамет быков-производителей 77
Выявление оптимальных режимов охлаждения, замораживания и оттаивания семени быков-производителей в полимерных соломинках 82
Научно-производственный опыт по изучению эффективности установленных режимов охлаждения, замораживания и оттаивания семени быков
в полимерных соломинках 94
3.5. Сравнительная оценка эффективности примене
ния способов замораживания семени быков-про
изводителей в полимерных соломинках и в форме
открытых гранул 96
Эффективность использования различных синтетических сред для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках 101
Разработка новой синтетической среды для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках 104
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 122
ВЫВОДЫ 140
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 144
ПРИЛОЖЕНИЯ 184
Введение к работе
В решении Продовольственной программы, выдвинутой ХХУІ съездом КПСС и одобренной майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС, большое значение имеет дальнейшее улучшение породных и продуктивных качеств сельскохозяйственных животных. В условиях современного ведения животноводства осуществление крупномасштабной генотипической селекции возможно только путем широкого использования метода длительного сохранения семени сельскохозяйственных животных в замороженном состоянии, открытого советскими биологами В.К.Миловаловым, И.И.Соколовской, И.В.Смирновым (1972).
В настоящее время в принципе разработан способ замораживания семени быков-производителей широко применяемый в производстве во многих странах мира. Однако около 40-50% гамет после замораживания-оттаивания не восстанавливают своих функций, что не позволяет максимально использовать высокоценных, проверенных по качеству потомства быков-производителей. К настоящему времени природа криогенных изменений гамет в процессе технологической обработки изучена недостаточно.
В результате многочисленных исследований, проводимых под руководством академика В.К.Милованова, а также научным руководителем данной работы установлено, что в процессах разбавления, охлаждения, замораживания и оттаивания семени в первую очередь повреждаются плазматическая мембрана и акро-сома гамет, тогда как ядро, представляющее сильно уплотненные нуклеотидные и белковые структуры практически не изменяется.
При выборе направления исследования данной работы мы руководствовались гипотезой, сущность которой заключается в
том, что криоповреждение биомембран и акросомы обусловлено развитием таких процессов, как физико-химические (изменение характера устойчивости связи в липопротеиновых и гликопротеи-новых комплексах, фазовых переходов липидов, ослабление гидрофобных взаимодействий и др.); биохимические (развитие пере-кисного окисления липидов, активирование либо ингибирование ряда ферментов, окисление SH -групп и др.) и физические, которые приводят к фазовым превращениям вода-лед, лед-вода. Как следствие происходят морфологические изменения мембраны и акросомы и элиминация из гамет структурных компонентов, что в конечном итоге приводит к снижению функциональной полноценности семени сельскохозяйственных животных.
Представленный материал определенным образом служит подтверждением этой гипотезы.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы - выявление морфологических и биохимических изменений гамет при криоконсервации семени быков-производителей и на этой основе изыскание условий их стабилизации.
Для достижения этой цели намечалось следующее.
Выявить криогенные изменения устойчивости белково-холестериновых комплексов, аминокислот, активности глута-мино-аспарагиновой трансаминазы и морфологические нарушения акросомы гамет быков-производителей.
Изыскать условия стабилизации устойчивости белково-холестериновых комплексов, глутамино-аспарагиновой трансаминазы и акросомы гамет при замораживании семени быков-производителей.
Изучить действие полиолов и антиоксидантов, входящих в состав синтетических сред, на морфологические, физиологи-
ческие и биохимические показатели гамет при криоконсервации и на этой основе разработать новый протектор для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках.
Определить эффективность воздействия различных условий технологической обработки на биологические показатели гамет при замораживании семени быков в полимерных соломинках.
Провести научно-производственные опыты по определению эффективности разработанных способов замораживания и синтетических сред на предмет дальнейшего широкого испытания и внедрения их в производство.
При выполнении работы были использованы такие методы исследования как: полярографический, спектрофотометрический, колончатово аминокислотного анализа и фазо-контрастной микроскопии.
Научная новизна результатов исследования
Впервые изучено действие антиоксидантов на морфологические, биохимические и физиологические показатели гамет после замораживания-оттаивания семени быков-производителей. Показана необходимость введения антиоксидантов в состав защитных сред для лучшей стабилизации функциональной полноценности семени быков-производителей при его криоконсервации. На основании изучения действия полиолов и антиоксидантов на вышеуказанные показатели гамет разработана новая синтетическая среда для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках, новизна которой подтверждается авторским свидетельством № 935098.
Доказано, что стабилизация исследуемых морфологических, биохимических и физиологических показателей гамет
лучше достигается при охлаждении разбавленного семени защитной средой без глицерина при 4С в течение 3-3,5 часов и добавлении второй среды, содержащей глицерин в соотношении 1:1 за 20-30 минут до его замораживания. Замораживание семени быков-производителей, расфасованного в полимерные соломинки (0,5 мл), проводят в парах жидкого азота при начальной температуре минус 120- І40С в течение 8 минут.
На основе указанных исследований предложен способ замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках, новизна которого подтверждается авторским свидетельством № 98641I.
3. Разработанная ранее синтетическая лактозо-фруктозо-рафинозо-магниево-глицерино-желточная среда (авт.свид.№536823] для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках, способствовала улучшению физиологических показателей гамет в сравнении с импортируемой из Франции средой под шифром Лецифос.
Практическая ценность работы
В результате широкого научно-производственного испытания синтетической лактозо-сорбито-тиосульфато-глицерино-желточной среды (авт.свид.№ 935098) для разбавления и замораживания семени быков-производителей в соломинках в зоне деятельности Молдавской и Тернопольской госплемстанций было показано, что она позволяет улучшить подвижность и продолжительность жизни гамет при 37С на 20 и 4Щ>, соответственно, сохранность акросомы на О/о и оплодотворяемость коров от первого осеменения на 9/0 по сравнению с ранее разработанной нами средой ЛШРМГЖ, предназначенной для тех же целей. Кроме того, использование новой среды дает возможность исключить такие дорогостоящие компоненты, как фруктоза и рафиноза.
Предложенный способ замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках (0,5 мл) способствует повышению подвижности гамет после оттаивания на 13%, продолжительность жизни в часах при 37С на 12%, сохранности акросомы на 17% и оплодотворяемость коров и телок от первого осеменения на 5- 6%.
Внедрение результатов исследований
Предложенная нами синтетическая среда ЛФРМГЖ (авт.свид. № 536823) для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках утверждена Фармакологическим советом при Главном управлении ветеринарии МСХ СССР, включена в Инструкцию по организации и технологии работ станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных (Москва: Колос, 1981) и внедрена на плем-предприятиях и станциях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных страны, имеющих соответствующие оборудование для замораживании семени в полимерных соломинках (акт внедрения от 9 апреля 1979 г. по МСХ СССР).
Разработанная нами новая лактозо-сорбито-тиосульфато-глицерино-желточная синтетическая среда (авт.свид. № 935098) рассмотрена на НТС Селекцентра МССР (протокол № І от 31 августа 1981 г.), одобрена и рекомендована для широкого производственного испытания в 17 административных районах МССР. По результатам комиссионной проверки ВГНКЙ ветпрепаратов она рекомендована для производственного испытания (акт от 20 декабря 1982 г.).
Усовершенствованный способ замораживания семени в полимерных соломинках (авт.свид. № 9864П) рассмотрен на НТС МСХ МССР, одобрен и рекомендован для внедрения. В настоящее время данный способ внедрен на Молдавской станции по искусст-
венному осеменению сельскохозяйственных животных (акт внедрения от 23 октября 1981 г.).
По результатам проводимых лабораторных и научно-производственных исследований опубликовано 12 научных работ, основные положения диссертации обсуждены на различных научных и научно-практических конференциях. На защиту выносятся следующие вопросы.
Стабилизация функциональной полноценности семени быков-производителей путем использования в составе синтетических сред антиоксидантов и полиолов, а также равномерно-замедленного способа охлаждения разбавленного семени без глицерина, добавления среды с глицерином в соотношении 1:1 и замораживания сразу или через 30 минут при минус 120 - 140С в течение 8 минут.
Синтетическая среда лактозо-сорбито-тиосульфато-гли-церино-желточная (авт.свид. № 935098) для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках, обеспечивающая лучшую стабилизацию акросомы, сульфгид-рильных групп и физиологических показателей гамет при длительном сохранении семени быков-производителей в глубокоза-мороженном состоянии.
Способ замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках (авт.свид. №986411), способствующий лучшей стабилизации биохимических, физиологических и морфологических показателей семени быков-производителей при его криоконсервации.
