Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Общая характеристика спермы быков 8
2.2. Влияние сезона года, кормления и режима использования производителей на качество их спермы 17
2.3. Возрастные и породные особенности спермопродукции быков-производителей 22
2.4. Роль ферментов спермы в воспроизведении сельскохозяйственных животных 26
2.5. Группы крови и сывороточные полиморфные системы животных и их связь с воспроизводительной способностью 36
3. Материал и методика исследований 44
4. Результаты собственных исследований 49
4.1. Физиологические показатели спермопродукции быков-производителей 49
4.2. Энзим-электрофорез изоферментов ЛДГ и МДГ в агаровом геле 67
4.3. Изоферментные спектры ДЦГ и ВДГ в сперме быков-производителей 76
4.4. Электрофоретическая картина спермы быков-производителей 94
4.5. Энзим-электрофоретическая характеристика белков и изоферментов ЛДГ сыворотки крови быков 109
4.6. Взаимосвязь спермопродукции и фертильности быков-производителей с уровнем гетерозиготности по маркерным генам 126
4.7. Экономическая эффективность раннего определения воспроизводительной способности быков 153
5. Обсуждение результатов собственных исследований 157
6. Выводы 162
7. Предложения производству 165
8. Список использованной литературы 166
Приложения 212
- Влияние сезона года, кормления и режима использования производителей на качество их спермы
- Возрастные и породные особенности спермопродукции быков-производителей
- Физиологические показатели спермопродукции быков-производителей
- Энзим-электрофорез изоферментов ЛДГ и МДГ в агаровом геле
Введение к работе
Актуальность темы. Важнейшей составной частью экономической стратегии партии на текущее десятилетие является одобренная майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС Продовольственная программа СССР на период до 1990 года. Одной из основных задач сельского хозяйства страны является дальнейший подъем и развитие общественного животноводства, его интенсификация и индустриализация с целью дальнейшего увеличения производства продуктов питания.
Особая роль в выполнении этой задачи принадлежит воспроизводству стада на основе широкого применения искусственного осеменения коров и телок глубокозамороженной спермой. При этом особо жесткие требования предъявляются к быкам-производителям, ибо в случае пониженной их воспроизводительной способности наносится значительный ущерб животноводству. Поэтому очень важно раннее прогнозирование и оценка воспроизводительной способности быков на основании комплексного изучения физиологических, биохимиче -ских и генетических показателей, определяющих оплодотворяющую способность их половых клеток. Для этого необходимы дальнейшие исследования влияния различных факторов на физиологические и биохимические показатели спермиев, их оплодотворяющую способность и разработка методов объективной оценки полноценности и жизнеспособности спермиев.
Определенное теоретическое и практическое значение имеет изучение связей между качеством спермопродукции и возрастом, породой, условиями и режимом использования производителей.
Цель и задачи исследований. Целью исследования было повышение воспроизводительной способности быков - увеличение количества и улучшения качества спермопродукции, а также повышение оплодотворяющей способности спермиев.
Задачи настоящего исследования были следующие:
изучить влияние породы, возраста, сезона года и режима использования на спермопродукцию быков-производителей в условиях юга Украины;
исследовать энзим-электрофоретическую характеристику белков и изоферментов ДЦГ плазмы спермы и спермиев в породном, возрастном аспекте и во взаимосвязи с физиологическими показателями спермопродукции;
изучить энзим-электрофоретическую характеристику белков
и изоферментов ДЦГ сыворотки крови быков во взаимосвязи с возрастом, породой и их воспроизводительными способностями;
- изучить воспроизводительную способность быков во взаимо
связи с полиморфными сывороточными системами и F - системой
групп крови.
Научная новизна. Изучены сезонные и возрастные изменения спермопродукции быков красной степной и англерской пород в условиях Николаевской области. В сперме изучены физиологические и биохимические показатели, их взаимосвязь с показателями крови быков.
Установлено положительное влияние неионного детергента твин-80 на качество энзимограмм при электрофоретическом разделении изоферментов ДЦГ и ЩГ. Актуальными и новыми являются исследования изоферментов спермы и сыворотки крови и их взаимосвязь с воспроизводительной способностью быков.
На основании исследований установлено генетическое влияние уровня гетерозиготности по маркерным генам на качество спермы и плодовитость быков-производителей.
Практическая ценность работы. Полученные результаты ис-
- б -
следований и вытекающие из них выводы послужили основой для практических рекомендаций о более эффективном использовании быков-производителей на Николаевском облплемобъединении, для оценки молодых быков по качеству спермопродукции, для продления срока племенного использования быков-улучшателей, улучшения качества и увеличения количества их спермопродукции.
Исследования изоферментного спектра ЛДГ и белков спермы, сыворотки крови во взаимосвязи с физиологическими показателями спермы позволяют определять функциональное состояние половых желез, объективно оценивать качество получаемой спермопродукции и в итоге прогнозировать воспроизводительную способность быков.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и одобрены на:
республиканской научной конференции молодых ученых "Вклад молодых ученых в выполнение продовольственной программы СССР", Аскания-Нова, 1983 г.;
научно-производственных конференциях профессорско-преподавательского состава и молодых ученых Каменец-Подольского сельскохозяйственного института (1981, 1982, 1983);
заседаниях кафедры ветакушерства и хирургии, ученом совете ветеринарного факультета в течении 1980-1983 г.г.
Публикация материалов диссертации. По результатам исследований опубликовано 3 научные работы.
Объем диссертации. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, иллюстрирована 53 таблицами, 3 рисунками, 10 фотографиями, 2 графиками.
Список используемой литературы включает 408 источников, в том числе 143 на иностранных языках, кроме того в приложении приведены рационы кормления быков и метеорологические данные за І98І-І983 г.г.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследований, результатов собственных исследований и их обсуждений, выводов и практических предложений, списка литературы и приложения.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Влияние сезона года, кормления и режима использования производителей на качество их спермы
Общее состояние производителей и качество их спермопродук-ции, в том числе и способность спермиев сохранять оплодотворяющие свойства в глубоко замороженном состоянии, в значительной мере зависит от условий содержания, уровня кормления и интенсивности эксплуатации самцов. Н.Ф. Маслов (1961), Ф.И. Осташко (1968, 1978) и др. сообщают, что качество спермопродукции производителей колеблется в зависимости от сезона года, что связано с сезонными изменениями температуры воздуха, продолжительности светового дня, качества и количества кормов, а также интенсивности полового использования и санитарно-гигиенических условий.
В.А. Яблонский (1970, 1974), Г.М. Андреев (1971), И.В. Смирнов и А.П. Кругляк (I960), В.П. Кожемякин (1981), С.Г. Шалови-ло (1983) установили, что самый высокий объем эякулята у быков наблюдается летом, а зимой он снижается. Однако, по данным Т.П. Ильинской (1969), Н.В. Осиповой (1974), М.Х. Соттаева (1979), Rao Т. Narasimha, A. Ramamohana (1980) максимальным он был осенью и зимой, а весной снижался, Е. Mercier, с. Sa -lisbury (1945), Т.П. Ильинская (1969), В.А. Яблонский (1970), Г.М. Андреев (1971), В.П. Кожемякин (1981) отметили в сперме быков самую низкую концентрацию половых клеток в весенне-летний период. Не наблюдали значительного изменения концентрации и активности спермиев по сезонам года М.Х. Соттаев (1979), И.В. Смирнов, А.П. Кругляк (1980), В.П. Кожемякин (1981), С.Г. Шаловило (1983). Летом J.Smith et al (1957) отмечали у быков самую густую сперму с максимальной выживаемостью половых клеток, однако, интенсивность окислительных процессов в сперме было самой высокой зимой и весной, с. Duiyn (1964) наблюдал максимальную активность, выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев быка осенью. Такие же результаты получены в исследованиях Т.П. Ильинской (1969), Т.П. Ильинской и Н.В. Осиновой (1969), (1971); В.А. Яблонского (1970, 1974), Н.В. Осиновой (1974), И.В. Смирнова, А.П. Кругляка (1980), С. Витанова, Т. Тхъм (1983),
По данным Г. Самойло (1968), Т.П. Ильинской (1972), N Reddy, с. Раза (1979) повышение содержания в сперме фруктозы и липоидного фосфора в осенние месяцы сопровождается усилением холодостойкости спермиев. В весенне-летний период качество спер-мопродукции быков в опытах Ф.И. Осташко (1968, 1978) ниже, чем в осенне-зимний, поэтому последний автор считает наиболее пригодным для создания запасов замороженной спермы.
Однако, В.Л. Нлеминой (1966) установлена лучшая выживаемость спермиев быка в мае-августе. Г.М. Андреев (1971) сообщает об улучшении качества спермы быка, за исключением концентрации спермиев в летнее время. И. Павличенко (1965), П.А. Варакса (1967), В.И. Волгина и др. (1970) считают, что в весенне-летний сезоны сперма быков является лучшей по качеству, чем в осенне-зимний, поскольку летом наблюдается повышение количества спермиев в эякуляте, резистентности и выживаемости спермиев.
Н.Ф. Маслов (1961), c.Pardo et ai (1979) сообщают, что быки выделяют больше спермы и лучшего качества при повышении атмосферного давления и влажности при среднедневной температуре воздуха +15-25С. Т. Bonadonna (1963) установил, что температура воздуха выше +27С угнетает воспроизводительные функции быков. И.В. Смирнов и А.П. Кругляк (1980) указывают, что повышение среднедневной температуры выше +16С и снижение ниже -1С отрицательно влияет на спермопродукцию быков, ухудшая её качество. Действие низкой и высокой температуры воздуха приводит к временным нарушениям барьерной функции между извитыми канальцами, придатком семенника и кровеносными капиллярами. О влиянии сезона года на спермопродукцию быков сообщается также в работах Э.Б. Баширова (I960), Х.Т. Ариэль (1979), В.А. Мельник (1980), Н. Menger (1980), В. Drzazuzynski, Н. Grodzki (1981) и др. Вопрос сезонных колебаний спермопродукции нельзя рассматривать отдельно от половой нагрузки производителей, а выбор оптимального времени для создания запасов спермы по этой причине связан с оптимальным режимом использования быков.
Установлено, что усиленное использование быков вызывает достоверное снижение объема эякулята, концентрации спермиев, их резистентности и выживаемости, а также оплодотворяющей способности (Д.В. Смирнов-Угрюмов, 1951; И.И. Родин, 1958, 1962; И.Г. Зорин, I960; В.А. Яблонский, 1962, 1970; Г.В. Зверева и Л.А. Черномаз, 1963; Ф.И. Осташко, М.И. Лопатко, 1965; Ф.И. Осташко, 1968, 1978; Г.М. Андреев, 1971; Н.М. Крамаренко, Л.К. Эрнст, 1971; А.И. Питушкин, 1973; Е.Б. Старостин, 1975; Н.С. Гавриленко и др., 1975; Л. Кибкало, 1981; И. Суллер, 1982; Н.А. Дмитраш, 1983; Д.Т. Винничук, Г.Д. Святовец, 1983). Опыты показывают, что получение от быков по 5 и больше эякулятов в неделю в течение даже 2-3 недель приводит к заметному снижению качества спермы, которая становится непригодной для хранения в замороженном состоянии. Т.П. Ильинская (1963), B.C. Антонюк (1969), Ф.Д. Буяло, А.П. Кругляк (1971), И.С. Вакуленко (1972), Ф.И. Осташко (1978) и др. установили, что режим использования быков, предусматривающий получать сперму один раз в 5-7 дней, в сравнении с режимом получения её через 2 дня на третий, способствует улучшению качества спермы и повышению оплодотворяющей способности после оттаивания.
Возрастные и породные особенности спермопродукции быков-производителей
Возраст и породная принадлежность производителей тесно связаны с гормональной регуляцией у них репродуктивных функций, что в свою очередь определяет физиологические и биохимические показатели спермы, функцию половых органов и срок племенного использования самцов( И. Суллер, 1982 ; J.L.Kratz et ai , 198З; Т.П. Ильинская, 1983; Д.Т. Винничук, Г.Д. Святовец, 1983).
Нормальная интенсивность спермиогенеза и качество спермопродукции устанавливается у быков в возрасте 11-18 месяцев. (В.И. Мельников, А.П. Солдатов, 1966; А.Г. Ионова, 1968; В.В.Куч-ко, 1969; П.И. Пакенас, 1969; И. Софронов, 1971; И.В. Смирнов, и др., 1977; Ф.И. Осташко, 1978). Исследованиями возрастной динамики спермопродукции доказано, что объем эякулята у быков разных пород увеличивается до 7-9-летнего возраста. У І-2-летних быков он был на 1/3 меньше, чем у 9-12-летних (А.А. Трутнев, 1964; В.А. Яблонский, 1970, 1974; И.З. Сирацикй, Г.Д. Святовец, 1971; И.З. Сирацкий, Д.И. Шафарук, 1973; И.В. Смирнов и др., 1973; А.П. Кругляк, 1974; X. Ариэль, 1979; В.А. Мельник, 1980; И.Г. Микульский, 1982; D.D.Lunstra, S.E. Echternkamp 1982).
Концентрация и оплодотворяющая способность спермиев достигают максимума в 2-3-летнем возрасте и с небольшими колебаниями удерживаются до 7-9 лет (И.З. Сирацкий и Г.Д. Святовец, 1971; И.З. Сирацкий и Д.Н. Шафарук, 1973; И.В. Смирнов с соавт., 1973; И.З. Сирацкий с соавт., 1974; Г.Д. Святовец, 1980; И.З. Сирацкий, 1982).
Правда, Г.У. Солсбери, Н.Л. Ван-Демарк (1966), ссылаясь на исследования Т. Танабе и Г.У. Солсбери (1946), сообщают, что плодовитость быков достигает вершины в возрасте 2-х лет, а затем постепенно снижается. Также В.И. Волгина и В.М. Столбов (1971) установили лучшие результаты по активности и оплодотворяющей способности спермиев у быков в возрасте 2-3 лет.
G.Killian, R. Amann (1972) наблюдали быстрое увеличение у молодых голштинских бычков объема эякулята, концентрации спермиев, их общего количества в эякуляте, подвижности парал. лельно с развитием половых органов (масса семенников и придатка семенника, число сперматид на семенник и на I г паренхимы семенника) в течение 20 недель после достижения половой зрелости. Последующие 10 недель роста быков не сопровождались повышением уровня спермопродукции и развития половых органов, хотя масса животных увеличивалась. Аналогичные результаты получили в своих исследованиях Г.Д. Святовец и др. (1976), И.З. Сирацикий и Г.Д. Святовец (1971), А.П. Кругляк (1981).
Возраст производителей сказывается и на других показателях спермы. Так В.В. Кучко (1969), параллельно с увеличением концентрации, активности и переживаемости спермиев у быков с 14 до 18-месячного возраста наблюдал повышение дегидрогеназной активности спермы. Г.А. Самойло (1971) установил, что дегидрогеназ-ная активность спермы повышается до 3 лет, с 3 до 8 лет ее колебания незначительны. На породные и возрастные особенности ферментативной активности спермы быков указывают в своих работах Б.Н. Чухрий (1964, 1972), АЛ. Клевец (1980), Г.В. Зверева и др. (1982).
В исследованиях В.А. Яблонского (1970), М.И. Лопатко (1980) установлены возрастные и породные различия в содержании общих Сахаров в сперме быков и, в частности, фруктозы.
Ряд авторов указывают на существование межпородных различий спермы производителей. Исследованиями Н.В. Маслова (1961), Н.А. Трутнева (1964), Т.А. Мисостова (1966), Е.А. Мамзиной и В.И. Волгиной (1968), Н.В. Мисостовой (1969), В.И. Волгиной и В.М. Столбова (1971), И.В. Смирнова с соавт. (1973), Н.А. Денисова (1974), В.И. Волгиной и Л.Д. Римаровой (1975), М.Х. Соттае-ва (1979) доказана связь физиологических показателей (объем эякулята, активность, концентрация и резистентность спермиев, количество мертвых и патологических форм) с их породной принадлежностью. Д.В. Смирнов-Угрюмов (1951) отметил, что быки швицкой и костромской пород отличаются от быков холмогорской и остфризской пород более высокой концентрацией спермиев.
И.З. Сирацкий и Г.Д. Святовец (1971), И.З. Сирацкий и Д.У. Шафарук (1973) и др. изучали возрастные и породные особенности сперматогенеза у быков-производителей. При этом быки-производители Лебединской породы имели больший объем эякулята, чем быки симментальской, красной степной, черно-пестрой и белоголовой украинской пород. Причем, у первых он увеличивался до семилетнего возраста, у вторых - до девятилетнего, у третьих - до восьмилетнего, у остальных - до десятилетнего возраста. Уже в двух-трехлетнем возрасте быки-производители выделяли большого объема эякуляты. Т.А. Самойло и С.А. Орлов (1971) отмечают, что у быков черно-пестрой породы до шести лет происходит увеличение объема эякулята, а затем он снижается. Отмечена также тенденция к увеличению концентрации спермиев с увеличением возраста черно-пестрых быков до восьми лет, после чего этот показатель снижается. Э.А. Кузнецова (1970) установила, что у быков-производителей красной степной породы объем эякулята увеличивается до шести-семи, а концентрация спермиев до четырех-пятилетнего возраста. Отмечено также различие в спермопродукции в связи с принадлежностью быков к линии. Так наибольшее количество спермы получено от производителей линии Визита КГН-26, наименьшее - от производителей линий Казбека ЗАН-60, Рекорда УСН-І5. У быков линии Аванса 355-. Н наблюдается наивысшая густота спермы (1,49 млрд/мл).
Физиологические показатели спермопродукции быков-производителей
Основное назначение быков-производителей при искусственном осеменении заключается в выделении максимального количества высококачественной спермопродукции, отвечающей всем требованиям технологии глубокого замораживания (криоконсервации) и обладающей высокой оплодотворяющей способностью. Поэтому свои иссле -дования мы начали с изучения качества спермопродукции подоптных быков.
В таблице 4.I.I приведена характеристика спермопродукции подопытных быков. Таблица 4.1.1. Характеристика спермопродукции быков (средние данные за 1981-83 г.г.) Показатели спермы !M±fn ! lim ! Су Количество животных 16 Получено эякулятов за год 203,1± 0,70 Объём эякулята, мл 4,10 0,15 Концентрация спермиев, млрд в I мл 0,98 ± 0,03 Активность спермиев, баллы 8,18 ±0,027 Общее количество спермиев в эякуляте, млрд 3,96 ± 0,09 197 - 210 1,47 3.39- 5,44 14,76 0,77 -1,16 12,24 7,97- 8,36 1,33 3.40- 4,65 9,07 Как видно из приведенных данных, в среднем за год от быков получали по 203,0 0,7 эякулятов, средний объём эякулята составлял 4,10 0,15 мл, концентрация спермиев - 0,98 0,03 млрд/мл, актив ность - 8,18±0,03 балла, общее количество спермиев в эякуляте -- 3,96±0,09 млрд. Наиболее вариабельным среди изучаемых показателей спермы оказался объём эякулята ( Cv - 14,8%) и концентрация спермиев ( Cv - 12,2%), тогда как общее количество спермиев в эякуляте, их активность и количество получаемых эякулятов были более стабильными.
В следующей таблице 4.1.2 представлены показатели спермо-продукции подопытных быков по годам исследования. Как видно, из данных этой таблицы, половая нагрузка на производителей в течение трех лет была стабильная, расчитанная на получение 4 эякулятов в неделю. Данные таблицы показывают также, что в течение трехлетнего периода происходили изменения показателей спермо -продукции у быков. Так общий объём спермы, полученной от одного производителя, увеличился с 798,8І40,5 мл в 1981 году до 882,б±31,9 мл в 1983 году, разница составляет 84 мл. Увеличился и объём эякулята, и за счет этого общее количество спермиев в эякуляте с 3,91±0,12 млрд до 4,17±0,Ю млрд. Концентрация спермиев и их активность оставались без существенных изменений.
Учитывая литературные данные о влиянии породы на количество и качество спермы быков, мы изучили в условиях Николаев -ской области показатели спермопродукции быков красной степной и англерской породы. Данные таблицы 4.1.3 показывают, что быки красной степной породы несколько превосходят англерских по объему эякулята, которые в свою очередь имеют более высокую концентрацию спермиев. Однако, достоверного различия между этими показателями, а также активностью и общим количеством спермиев в эякуляте не обнаружено ( Р 0.5; Р 0,5). Если же сравнивать данные по годам исследований (таблица 4.1.4), то можно заметить, что на протяжении трех лет наиболее стабильные результаты по объёму спермы получены от быков англерской породы. Коэффициент вариации этого показателя по годам исследования составляет для них 17,8%; 10,9%; 6,1%; соответственно, по объёму эякулята - 16,9%; 11,7% и 6,2%.
По объёму выделенной за год спермы быки красной степной породы преобладают над быками англерской, однако по количеству в ней спермиев несколько преобладают быки англерской породы. Средний коэффициент вариации (14,3-8,9%) говорит о незначительных колебаниях спермопродукции в пределах каждой породы.
С целью изучения возрастных различий физиологических показателей спермы нами было сформировано пять возрастных групп быков красной степной породы; сформировать возрастные группы из быков англерской породы мы не смогли из-за малочисленного их количества. В первую группу красностепных быков вошли молодые животные, в возрасте от 1,5 до 3 лет, вторая группа состояла из 3 - 5-летних быков, третья - 5 - 7-летних, четвертая - 7 - 9-леТ них и пятая включала быков старше 9 лет. Полученные результаты исследования спермопродукции указанных групп быков отображены в таблице 4.1.5.
Как видно из таблицы наименьшее количество эякулятов (135,6±16,3) при небольшом объёме (2,85±0,17 мл ) с низкой концентрацией спермиев (0,85 0,02 млрд/мл) и общем количестве их за год (326,6 51,2 млрд), а также активностью (7,95±0,04) получено от быков 1,5 - 3-летнего возраста. Для быков этого возраста характерна высокая вариабельность (коэффициент вариации составляет от 22,5 до 58,6%) всех показателей спермопродукции, кроме активности спермиев ( Cv - 1,8%) и концентрации их ( Cv - 7,9%), что можно объяснить становлением спермопродукции.
Энзим-электрофорез изоферментов ЛДГ и МДГ в агаровом геле
При изучении энзим-электрофоретической характеристики изоферментов ДЦГ и ВДГ сыворотки крови прежде всего необходимо было отработать оптимальные условия для проявления этих изоферментов. Энзим-электрофорез изоферментов ЛДГ и ОДЦГ проводили в 1%-ном геле дальневосточного агар-агара или бакто-агара фирмы uFe) cik
В некоторых лабораториях для улучшения качества энзим-электрофореза в гель вводят сыворотку крови, сывороточный альбумин, неионные детергенты - тритон Х-100 и Х-405, бриж 35 и ионный детергент - цетавлон. Исходя из этого нами было изучено влияние неионного детергента полиоксиэтиленового ряда полиокси-этиленсорбитанмоноолеата (твин-80) на проявление изоферментов ЛДГ и ЩГ в сыворотке крови, сперме и ее составных частях. Для этого перед электрофорезом в разогретый агар вводили 0,1-0,2 мл сыворотки крови на 100 мл агара и твин-80. Исследован диапазон концентрации детергента от 0,05 до 1,5%. Результаты исследования показали, что при введении в гель сыворотки крови быка и твина-80 наблюдается более интенсивное окрашивание изоферментов ДЦГ и ЩГ, особенно минорных (нестабильных) фракций. При создании в геле 0,5-0,75% концентрации твина-80 и более образуется диффузный фон, искажающий денситометрию, а также при этом уменьшается электрофоретическая подвижность анодных фракций. Появление темного фона можно объяснить массивным каталитиче -ским восстановлением НСТ на мицеллах детергента; восстановителем при этом является ФМС, диффундирующий из мест с более высокой ферментативной активностью. Снижение электрофоретической подвижности изоферментов ДЦГ и МДГ наиболее быстро мигрирующих к аноду, связано, по-видимому, с движением мицелл детергента в условиях гелевого электрофореза к катоду за счет эндоосмоса. Устранить эти недостатки удалось снижением концентрации твина-80 до 0,3-0,4%, при которой не изменялась подвижность изо-ферментов и окрашивание фона было минимальным. При этом в значительной мере сократилось время инкубации геля в субстратной смеси. Если для выявления ЛДГ необходимо 1,5-2,5 часа, ЩТ - до I суток, то введение в гель детергента сокращает это время для ЛДГ до 40 минут, ВДГ - 1,5-2 часа.
Введение твина-80 в состав субстратной среды не дало существенного улучшения качества энзимограмм. Это, по-видимому, связано с небольшой скоростью диффузии в гель мицелл детергента (по сравнению с другими компонентами субстратной смеси) и проявлением ими НСТ-редуктазных свойств только на поверхности ге-левой пластинки.
Полученные нами данные указывают на то, что введение в гель неионного детергента твина-80, обладающего НСТ-редуктазной активностью, способствует более полному использованию образующегося в ходе ферментативной реакции восстановленного ШС и вследствие этого - восстановлению НСТ более соответствующему ферментативной активности. Следовательно, можно рекомендовать при изучении всех ферментов, выявляемых тетразолиевым методом, вводить в гель неионный детергент твин-80, концентрации 0,3 -0,4%.
При проведении энзим-электрофореза в агарном геле мы применяли веронал-мединаловый буфер с рН 8,6 и ионной силой 0,1. Кровь для исследования брали у быков-производителей из яремной вены, до утреннего кормления. Сперму от быков-производителей получали с помощью искусственной вагины, отделяли плазму путем центрифугирования 15 минут при 3000 об/мин. Осажденные спермин трижды отмывали в 0,15 М растворе
Ряд авторов для экстрагирования ферментов применяли различные буферные растворы с низкой ионной силой (0,05), растирая ткани или спермин в гомогенизаторе или в ступках с кварцевым песком. Мы считаем, что при такой обработке не проихсодит достаточное извлечение ферментов из спермиев, так как основная масса ЛДГ и ЛДГр сосредоточены в митохондриях, сконцентриро -ванных в средней части (тело) спермия в виде митохондриальной оболочки системы фибрилл, а ДЦГ и ДЦГ в цитоплазме.
Поэтому к отмытой взвеси спермиев мы добавляли равный объём дистиллированной воды, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 20-30 минут при 37С, затем резко охлаждали до 0С с последующим быстрым оттаиванием до 37С, центрифугировали при 3000 об/мин в течении 15 минут и надосадочную жидкость подвергали электрофорезу. Данная обработка спермиев позволяет избежать образования гибридных форм изоферментов, которые могут образовываться при вымораживании свободной воды и увеличения концентрации солей в растворе, а также в условиях медленных скоростей замораживания или оттаивания и многократных циклов замораживания-оттаивания исследуемых образцов. Такая подготовка спермиев позволила максимально сохранить энзиматическую активность и изоферментный спектр и в то же время обеспечивает максимальное освобождение ферментов в окружающую среду вследствие разрушения клеточных элементов и увеличения проницаемости мембран спермиев.
Энзим-электрофорез проводили в плексигласовой камере нашей конструкции (описано в методике и материалах исследования) на стеклянных пластинках (130 х 180 мм) тщательно вымытых и обезжиренных смесью Никифорова. Энзим-электрофорез ЛДГ и ЩТ проводили при градиенте потенциала 5 В/см, силе тока 20-30 ма, в течение 3-3,5 часов, при охлаждении камеры ледяной водой.
Во избежание диффузии нефиксированных белков из их полос, необходимо чтобы от момента окончания электрофореза до начала проведения гистохимической реакции проходило не более 7-Ю минут. Универсальной прописи приготовления инкубационных сред для , проявления дегидрогеназ не существует, поэтому для каждого отдельного фермента необходимо было подобрать среду. Лучшие результаты получены нами при проявлении изоферментов ДЦГ и ЩГ сыворотки крови, спермы и её составных компонентов инкубационной смесью следующего состава (в расчете на I пластинку - 10-II проб) 0,5 М фосфатный буфер, рН 7,4-15 мл, I М раствор лак-тата натрия (для ЛДГ) или I М раствор малата натрия (для МДП - 5 мл, 0,5$ раствор НГС или ТНГС - 5 мл, 0,047$ раствор - 5 мл, 0,75% раствор НАД - 5 мл, 0,3% раствор ФМС - 1,25 мл. Такое соотношение компонентов в инкубационной смеси выявилось оптимальным.
![Анатомическая изменчивость пояса и свободных нижних конечностей во взаимосвязи с показателями физического развития и типами телосложения девушек 17 - 20 лет Саратовского региона [Электронный ресурс]](/i/i/4229/186098.png "Анатомическая изменчивость пояса и свободных нижних конечностей во взаимосвязи с показателями физического развития и типами телосложения девушек 17 - 20 лет Саратовского региона [Электронный ресурс] Аристова Ирина Сергеевна")
