Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 14
1.1 Системное воспаление как типовой патофизиологический процесс 14
1.2 Патогенетические основы развития системного воспалительного ответа ... 17
1.3 Современное представление о патогенезе системного воспаления 22
1.4 Дискутабельность существующих положений о патогенезе системного воспалительного ответа
1.6 Характеристика маркеров системного воспаления 37
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 52
2.1 Дизайн исследования 54
2.2. Клиническая характеристика групп исследования 56
2.3 Использованные в работе методы 59
2.3.1 Метод прямого подсчета лейкоцитарной формулы 59
2.3.2 Метод сбора сыворотки крови 60
2.3.3 Метод иммуноферментного анализа 60
2.3.4 Методы статистической обработки результатов 64
ГЛАВА 3 Факторы врождённого иммунитета 65
3.1 Клеточные компоненты врожденного иммунитета 66
3.2 Гуморальные компоненты врожденного иммунитета 70
3.2.1 Система комплемента 70
3.2.1.1 Классический путь активации комплемента 71
3.2.1.2 Лектиновый путь активации комплемента 74
3.2.1.3 Альтернативный путь активации комплемента 78
3.2.2 С5а субкомпонент системы комплемента 82
3.2.3 С-реактивный белок 85
ГЛАВА 4 Цитокины 90
4.1 Интерферон гамма 90
4.2 Провоспалительные цитокины 93
4.3 Противовоспалительные цитокины 104
ГЛАВА 5 Молекулы клеточной адгезии и функции эндотелия
5.1 Селектины 115
Заключение 133
Выводы 152
Список использованных сокращении 156
- Патогенетические основы развития системного воспалительного ответа
- Клиническая характеристика групп исследования
- Гуморальные компоненты врожденного иммунитета
- Провоспалительные цитокины
Патогенетические основы развития системного воспалительного ответа
Воспаление представляет собой защитно-приспособительную реакцию организма, направленную на восстановление повреждённой ткани [145]. Местная воспалительная реакция защищает организм, освобождает его от патогенных факторов, запускает репаративные процессы и способствует выздоровлению. Любое повреждение целостности тканей организма влечёт за собой активацию местных воспалительных реакций, прежде всего компонентов неспецифического врождённого иммунного ответа [130]. Воспалительный процесс, развиваясь при обязательном участии различных медиаторов воспаления, может сопровождаться преимущественно местной реакцией с типичными местными проявлениями болезни и умеренной, малозаметной общей реакцией органов и систем организма [23]. Ключевым моментом в генерализации воспаления является срыв защитных механизмов ответной адаптационной воспалительной реакции в месте локализации повреждения [23, 130]. Принципиальным отличием системного воспалительного ответа от классического воспаления является генерализация базисных механизмов воспалительного процесса, ассоциированных с очагом воспаления и предназначенных для локального, но не системного действия [99].
Нормально функционирующие контрольные механизмы иммунной системы препятствуют бесконтрольному выделению целого комплекса биологически активных веществ (медиаторов воспаления) и обеспечивают адекватную местную реакцию [23, 130].
Современные представления о сути воспаления включают в себя понимание универсальности механизмов течения физиологических и патологических процессов в организме [130]. Все типовые, как физиологические, так и патофизиологические, процессы опосредованы различными межклеточными взаимоотношениями, с участием многочисленных медиаторов и развиваются по одним и тем же закономерностям, как при внедрении инфекции, так и при повреждениях неинфекционного генеза [23, 130].
Ответная реакция организма, независимо от локализации повреждения, развивается в соответствии с общими закономерностями, свойственными всякому острому воспалению [23]. Общие местные признаки классического воспаления: гиперемия, отёк, боль, нарушение функции повреждённой ткани, прежде всего отражают внешние проявления сложного и разнообразного процесса воспаления [235]. В то же время, они могут использоваться в качестве критериев многих заболеваний и отдельных синдромов [23, 130]. Процесс развития воспаления можно подразделить на два уровня: первый, или базисный (местный уровень очага воспаления), и системный [251]. Местный уровень интегрирует биологически наиболее агрессивные механизмы [23, 130], к которым относят перестройку микроциркуляции, эффекты фагоцитов и экспрессию других флогогенных факторов. Регуляторными посредниками для этой взаимообразной активации служат эйкозаноиды, биогенные амины, продукты активации систем гемостаза и комплемента и многие другие медиаторы воспаления [195]. Особое место среди них занимает цитокиновая сеть [66]. Генерализация цитокинов из очага воспаления в системный кровоток является одним из лимитирующих факторов, подключающих второй, внешний по отношению к очагу воспаления, или системный уровень воспалительного процесса [130]. Он активируется при определенной степени выраженности и декомпенсации механизмов первого (базового) уровня и направлен на решение двух основных задач: а) поддержку воспалительной реакции в очаге посредством усиления притока на его территорию лейкоцитов, энергетических и строительных субстратов, плазменных факторов, потребляемых в очаге воспаления; б) сохранение относительного постоянства внутренней среды организма [23, 130]. Механизм реализации этой, в целом протективной для организма, системной составляющей воспалительного процесса заключается в развитии особого варианта стрессовой реакции, приоритетно направленной на решение не внешней, но внутренней проблемы [23, 130, 129]. Сутью системного воспаления, как патофизиологического процесса, является генерализованное включение базисных механизмов программы первого уровня в ответ на системный характер действия факторов повреждения [23, 130]. В этом случае флогогенные механизмы теряют свою протективную основу (локализация факторов альтерации) и сами становятся главной движущей силой патологического процесса [130]. По определению академика В. А. Черешнева, системное воспаление — это типовой, мультисиндромный, фазоспецифичный (стадиоспецифичный для хронического варианта) патологический процесс, развивающийся при системном повреждении и характеризующийся тотальной воспалительной реактивностью эндотелиоцитов, плазменных и клеточных факторов крови, соединительной ткани, а на заключительных этапах и микроциркуляторными расстройствами в жизненно важных органах и тканях [23].
Отличительной особенностью системного воспалительного ответа является большая степень критичности состояний пациентов, а также качественно более высокие уровни цитокинемии и большая вероятность выявления критериев, отражающих феномены: системной альтерации, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), вовлекающее в ответную реакцию практически все системы организма нейроэндокринной системы, [130]. Ведущим патогенетическим фактором включения реакции острой фазы системного воспаления является лавинообразная продукция интерлейкинов 1-го и 6-го типов, фактора некроза опухоли, интерферонов [78, 280].
Отношение к системному воспалительному ответу как патологическому процессу, с общими принципами для всех нозологических форм заболеваний, определяет необходимость изучения патофизиологических основ его течения и механизмов реализации, что позволит вносить патогенетически обоснованные коррективы при прогнозировании и лечении критических состояний раннего послеоперационного периода в кардиохирургии, в том числе и при протезировании клапанов сердца.
Клиническая характеристика групп исследования
Количественное определение содержания в сыворотке биологически активных молекул таких как, интерферон гамма (interferon у - IFNy), фактор некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor а - TNFa), интерлейкинов 1, 4, 6, 8, 10, (interleukin - IL), селектинов P (Р-селектин), L (L-селектин) и E (Е-селектин), С-реактивный белок (СРБ) производили с применением коммерческих наборов (с использованием сыворотки) производителя тест-систем для научных исследований Bender MedSystems, Австрия. А исследование концентраций IL -12р70 с использованием набора «Human IL - 12+р70», Invitrogen, США. Концентрацию эндотелина (ЭТ) определяли при помощи набора Endothelin (1 -21) Biomedica, США.
Во всех случаях использован твердофазный иммуноферментный метод анализ (ELISA - enzymeinked immunosorbent assay). Исследование осуществлено в точном соответствии прилагаемой производителем к каждому набору инструкцией пользователя.
Для всех используемых наборов применён общий методический принцип: Антитела, специфичные к анализируемому аналиту, сорбированы в ячейках полистеролового планшета.
Неизвестные образцы, стандарты и контрольные образцы вносятся в ячейки планшета, где происходит связывание с сорбированными антителами. Вслед за этим добавляется конъюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена, который связывает молекулы аналита, захваченные первыми антителами.
После инкубации и промывки из ячеек удаляется остаток ферментного конъюгата, а в ячейки добавляется субстратный раствор, взаимодействующий с образованным ферментным комплексом с получением окрашенного раствора.
Интенсивность окраски, измеренная при длине волны 450 нанометров, пропорциональна концентрации исследуемого аналита, присутствующего в образцах. Количественное значение аналита в образце определяется расчетным методом по стандартной кривой, построенной по соответствующим стандартным разведениям в соответствующем опыте.
Активность фактора фон Виллебранда (ФВ) IMUBIND vWF Activity ELISA Sekisui Diagnostics (American Diagnostica), CUIA. Для анализа адгезивных свойств фактора фон Виллебранда, как реализации физиологической функции, определяется его способность связываться с коллагеном. Принцип метода: дно лунок покрыто человеческим коллагеном III типа. Калибраторы и контрольные леофилизованные плазмы («низкий» и «высокий уровни для целевой проверки) восстанавливаются в 500 микролитров дистиллированной воды. Готовиться разведение калибраторов, контрольных плазм и анализируемых образцов 1:25. Подготовленные таким образом калибраторы, контрольные и опытные образцы вносятся в соответствующие лунки планшета и инкубируются при комнатной температуре. После отмывки несорбированных частиц в лунки добавляют поликлональные антитела к фактору фон Виллебранда - пероксидазный конъюгат. После повторной инкубации и образования ферментного комплекса, излишки конъюгата удаляют и добавляют хромоген (тетраметилбензидин). При взаимодействии хромогена с ферментным комплексом образуется окрашенный раствор. Остановка реакции осуществляется раствором 0,45 моль/литр соляной кислоты. Интенсивность окраски, измеряют при длине волны 450 нанометров, референсная 620 нанометров. Концентрации в пробах рассчитывают на основании калибровочной кривой, построенной по точкам поглощения калибровочных образцов, использованных в опыте. Калибровочные значения выражены в единица/миллилитр (Ед/мл), и при представлении данных следует учитывать, что 1 Ед/мл = 100% активности фактора фон Виллебранда.
Скрининг активации комплемента по одному из путей проводили с использованием коммерческого набора «WieslabComplement system Scrinkit» (Euro Diagnostica Headquarters, Швеция) в соответствии с инструкцией производителя.
Принцип метода: в основе WieslabComplement system Scrinkit лежит анализ гемолитической активности комплемента с использованием меченых антител специфичных к неоантигенам, полученным в результате активации комплемента. Объём генерируемого неоантигена пропорционален функциональной активности пути комплемента.
Лунки микротитрационных стрипов покрыты специфическими активаторами классического, лектинового или альтернативного путей. Исследуемые сыворотки разводят в растворах специфических блокаторов, для обеспечения регистрации только одного из путей активации. Во время инкубации разведённой сыворотки в лунах со специфическими активаторами происходит активация компонентов комплемента сыворотки по одному из путей.
После отмывки лунок вносят C5d - 9 компоненты комплемента и специфические алкалинфосфотазо-меченые антитела. Во время инкубации образуется комплекс антиген - антитело.
После следующей отмывки регистрируют специфическое связывание антител. Активность комплементарного пути коррелирует с интенсивностью окраски раствора в лунке и измеряется как оптическая плотность жидкости. После произведения перерасчета определяется активность анализируемого пути комплемента в %.
Количественное определение С5а компонента комплемента проводили с использованием коммерческого набора «HUMAN С5а EISA TEST KIT» (Hycult Biotech, Нидерланды) а соответствии с инструкцией производителя.
Принцип метода: набор «HUMAN С5а EISA TEST KIT» основан на «сэндвич» - методе твердофазного иммуноферментного анализа. Образцы и стандарты инкубируют в лунках микропланшета, покрытых антителами к человеческому С5а. После инкубации в лунки вносят биотинированные антитела к человеческому С5а. После повторной инкубации и отмывки в лунки вносят стрептовидин-пироксидазу. Этот конъюгат специфически реагирует с биотинированными антителами, связанными с С5а. После завершающей отмывки во все лунки вносят субстрат - тетраметилбензидин. Интенсивность краски раствора в лунке пропорциональна количеству С5а присутствующему в образце. Ферментативную реакцию останавливают добавлением лимонной кислоты. С помощью спектрофотометра (длина волны 450 нанометров) измеряют абсорбцию. Калибровочную кривую получают путем построения графика зависимости оптической плотности (линейная ось) от соответствующих концентраций известных стандартов (log). Концентрация С5а в образцах сыворотки определяется по калибровочной кривой, построенной в том же анализе, что и исследуемые образцы.
Гуморальные компоненты врожденного иммунитета
Однако, данные таблицы демонстрируют, что в условиях увеличения IL6 в 1-е сутки (р 0,0001) у пациентов с осложненным СВО, его уровень в 2 раза ниже, чем у пациентов группы СВО без осложнений.
У пациентов группы СВО с ПОН еще до операции количество IL6 в 2,5 раза ниже, чем в первых двух группах. И не смотря на значимое (р =0,007) увеличение концентрации IL6 в 1-е сутки, в это период его уровни не достигали значений, определяемых у пациентов первых двух групп. К 7-м суткам количество IL6 не имело значимых отличий от исходных (р =0,03), однако, оставалась разница в его уровнях у пациентов разных клинических групп.
Таким образом, продемонстрирована связь динамических изменений концентраций IL6 в послеоперационном периоде пациентов с инфекционным эндокардитом и клинико-лабораторными вариантами системного воспаления. В данном случае феномен «цитокиновой анергии» применим в отношении пациентов с клиническими проявлениями СВО с ПОН, и выражается в низком уровне продукции данного медиатора на протяжении всего периода наблюдения.
На момент наиболее интенсивной альтерации (1-е сутки после операции) анергия острофазных медиаторов в этой группе и слабовыраженная реакция в группе осложненного СВО вносит свой вклад в проявления дискоординации воспалительного ответа. В противовес данным о неблагоприятном влиянии высоких концентраций IL6 на патогенез СВО при септических состояниях [32, 80], в условиях системного воспаления неинфекционного генеза после протезирования клапанов сердца у пациентов с инфекционным эндокардитом подъём сывороточных концентраций IL6 выше 35,00 - 40,00 пг/мл в первые сутки после операции, является благоприятным прогностическим признаком.
Не смотря на описанные ранее в посвященной системному воспалению литературе [70], корреляции высоких концентраций IL8 и клинической манифестацией синдрома системного воспалительного ответа, в отношении пациентов с инфекционным эндокардитом обнаружена противоположная тенденция. Так в таблице 11 показано, что до операции у пациентов всех групп концентрации IL8 находятся на одном уровне (Н =3,01, р =0,22).
Затем, в 1-й день после операции, у всех пациентов наблюдалась положительная динамика по этому аналиту. При том, что увеличение сывороточных концентраций произошло у пациентов всех групп, наиболее выраженные изменения были у пациентов группы СВО без осложнений. В это время концентрации IL8 у пациентов 1-й группы значимо превышали таковые групп осложнённого СВО и СВО с ПОН. Это указывает на то, что у пациентов с инфекционным эндокардитом механизм повреждения тканей не основывается на гиперпродукции IL8, что, по-видимому, связано с истощением адаптационных механизмов в процессе течения основного заболевания.
В таблице показано, что для пациентов с инфекционным эндокардитом (в условиях развития послеоперационного системного воспаления неинфекционной этиологии), наблюдается связь высоких концентраций IL8 в острую фазу воспаления и благоприятного разрешения системного воспаления. Что имеет под собой биологическое основание: при увеличении концентрации IL8 происходит стимуляция хемотаксиса и активация иммунокомпетентных клеток врожденного иммунного ответа, что влечет за собой адекватную воспалительную реакцию на повреждение с последующим благоприятным разрешением воспаления. И обратная ситуация складывается при низком уровне продукции этого цитокина: малое его количество не обеспечивает в должной мере привлечения в зону повреждения необходимого числа иммунокомпетентных клеток и границы острофазного ответа растягиваются во времени, что влечет за собой разнонаправленный дисбаланс иммунного ответа и развитие осложнений.
В последствии, на 7-е сутки после операции, количество IL8 у пациентов группы СВО без осложнений и группы СВО с ПОН снизилось на уровень в 2 раза ниже чем до операции (р =0,003, р =0,0002 соответственно), а у пациентов с осложнённым СВО достиг исходного (р =0,78). При этом, в позднем послеоперационном периоде протезирования клапанов сердца значимых различий в концентрациях IL8 у пациентов с разными вариантами системного воспаления не наблюдается.
Таким образом показано, что в патогенезе развития системного воспаления у пациентов с инфекционным эндокардитом после клапанного протезирования имеет значение уровень IL8 и степень его динамических изменений. Увеличение сывороточного количества IL8 в 1-е сутки после операции является протективным. Неблагоприятным является недостаточное сывороточное содержание IL8 в острую фазу воспаления. Низкий сывороточный уровень этого хемокина обуславливает дальнейшее нарушение координации всех механизмов врожденного иммунного ответа в реализации системного воспаления.
Известные в настоящее время данные показывают, что снижение экспрессии IL12p70 нарушает опосредованный им иммунный ответ [232], и увеличивает риск инфекционных осложнений после хирургической травмы. Учитывая важную роль IL12 в продукции IFNy [67] и наличие биологических функций только у субъединицы р70 [63], считается, что её значение в патогенезе системного воспаления наиболее весомо.
Провоспалительные цитокины
Это приводит к изменению характера адгезии, которая принимает вид необратимой и обеспечивает высокий процент выхода активированных лейкоцитов в субэндотелиальное пространство, где они продуцируют и выделяют биологически активные вещества. Выделение их направлено в первую очередь на защиту организма от воспалительного агента, однако эти же вещества изменяют и структуру интерстиция, меняя его механические свойства. В результате нарушается структура коллагенового матрикса и уменьшается величина гидростатического интерстициального давления [68]. Сосудистая проницаемость увеличивается и приводит к отёку, при этом высокие концентрации нейтрофилов в пострадавших тканях могут увеличить повреждение микрососудов и клеток паренхимы органов за счёт выхода протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, вносит вклад в патогенез формирования тканевой недостаточности и органной дисфункции.
При этом, определено, что низкие концентрации сывороточного L-селектина не играют роли в патогенезе системного воспаления, а указывают на патогенез инфекционного эндокардита, который является основным диагнозом анализируемой когорты пациентов.
Следующим маркером активации эндотелия служит Е-селектин. Известно, что в течение 24-48 часов Е-селектин сбрасывается с цитоплазматической мембраны активированной клетки и попадает в циркулирующее кровеносное русло. Растворимый Е-селектин является хемотаксическим сигналом для нейтрофилов и усиливает миграционные способности клеток [276].
Определяемые у пациентов группы СВО с ПОН высокие концентрации Е-селектина обеспечивает активную адгезию нейтрофилов к эндотелию, обеспечивают активную миграцию в окружающее интерстициальное Дисрегуляция и делокализация являются решающими факторами развития аутоагрессивного воспаления. Спектр адгезивных молекул на поверхности клетки зависит от того, активирована ли иммунокомпетентная клетка или нет. Процессы активации клеток способствуют защите организма и желательны на начальных фазах воспаления, однако положительная роль этих процессов становится проблематичной в тот момент, когда степень активации перестает быть адекватной и когда первоначально защитный механизм перерастает в патологический процесс [77].
Стойкое нарушение функции эндотелия, имеющее определенное значение в патогенезе системного воспаления после протезирования клапанов сердца у пациентов с инфекционным эндокардитом, находит отражение в динамике маркеров эндотелиальной дисфункции: эндотелина и фактора фон Виллебранда. Так в 1-е сутки после операции у в сыворотке крови всех пациентов наблюдается увеличение концентраций эндотелина, связанное с повреждением эндотелия во время кардиохирургической операции и применением искусственного кровообращения. Однако, у пациентов группы СВО с ПОН количество эндотелина возрастает резко и в десятки раз, что обуславливает проявления эндотелиальной дисфункции. Отягощающим фактором у этой группы пациентов в этот период является и нарастание активности фактора фон Виллебранда. В то же время, у пациентов группы с осложненным СВО в 1-е сутки отмечено только усиление активности фактора фон Виллебранда, а у пациентов группы СВО без осложнений активность фактора фон Виллебранда и концентрации эндотелина в целом увеличились, но не достигали тех критических отметок, что характеризовали группы с осложнениями. Согласно литературным данным выраженность эндотелиальной дисфункции зависит от варианта течения инфекционного эндокардита [3]. Однако только длительностью нахождения повреждающего фактора в сосудистом русле пациентов с инфекционным эндокардитом и истощением защитных резервов эндотелия разницу в выраженности эндотелиальной дисфункции у данной кагорты пациентов объяснить не удается.
Таким образом, в патогенезе формирования системного воспаления после протезирования клапанов сердца у пациентов с инфекционным эндокардитом ключевое значение имеют как факторы врожденного иммунного ответа, так и неспецифической резистентности, а так же состояние эндотелия сосудов.
Для определения наиболее значимых показателей из всей совокупности изучаемых маркеров воспаления и факторов врожденного иммунного ответа, молекул - маркеров активации эндотелия был проведен дискриминантный анализ Фишера с построением математических моделей.
Математические модели были построены для значений (концентраций) маркеров, определяемых в первые сутки после операции. Первые сутки после операции являются наиболее критичными с точки зрения активации адаптационных реакций организма и определение с это время маркеров как благоприятного, так и неблагоприятного прогноза является необходимым для стратификации риска осложнений всего послеоперационного периода.
