Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Возможности использования молекул VEGF для улучшения регенерации кровеносного сосуда на основе тканеинженерного графта (обзор литературы) 11
1.1 Сосудистые графты малого диаметра 11
1.2 Реакция тканей на имплантируемый биоматериал и процесс восстановления тканей 17
1.3 Использование биосовместимых графтов для регенерации кровеносного сосуда in situ 21
1.4 VEGF и его роль в ангиогенезе 27
1.5 Применение VEGF в тканевой инженерии кровеносных сосудов 33
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Изготовление сосудистых PCL графтов и PCL графтов, содержащих VEGF 39
2.2 Физико-механические испытания сосудистых графтов 40
2.3 Сканирующая электронная микроскопия поверхности сосудистых графтов 42
2.4 Кинетика выхода ростового фактора из PCL с VEGF графтов 42
2.5 Определение биологической активности VEGF после выхода из PCL графта in vitro 43
2.6 Культивирование эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток на графтах 44
2.7 Внутрибрюшная имплантация PCL графтов и PCL графтов с VEGF 45
2.8 Имплантация сосудистых графтов из PCL и PCL с VEGF в брюшную часть аорты крысы 47
2.9 Статистические методы 48
ГЛАВА 3 Физико-механические свойства и морфология полимерных сосудистых графтов, изготовленных методом электроспиннинга 49
3.1 Зависимость свойств PCL графтов от параметров электроспиннинга 49
3.2 Влияние инкорпорирования VEGF в PCL на структуру и прочностные свойства сосудистого графта 56
ГЛАВА 4 Влияние vegf на биологическую активность PCL графта 62
4.1 Определение выхода молекул VEGF из PCL графтов и их биоактивности 62
4.2 Оценка влияния молекул VEGF на способность PCL графтов адгезировать клетки in vitro 68
ГЛАВА 5 Особенности восстановления тканей на основе pcl графта под влиянием vegf 78
5.1 Изучение реакции тканей на PCL графт после введения ростового фактора в эксперименте in vivo 78
5.2 Формирование кровеносного сосуда на основе имплантированного PCL графта с VEGF 88
Заключение 101
Выводы 108
Список используемых сокращений 110
Список литературы 1
- Реакция тканей на имплантируемый биоматериал и процесс восстановления тканей
- Сканирующая электронная микроскопия поверхности сосудистых графтов
- Влияние инкорпорирования VEGF в PCL на структуру и прочностные свойства сосудистого графта
- Формирование кровеносного сосуда на основе имплантированного PCL графта с VEGF
Реакция тканей на имплантируемый биоматериал и процесс восстановления тканей
Традиционным способом лечения заболеваний, связанных со значительным поражением коронарных и переферических артерий, является хирургическое вмешательство с имплантацией биологических или синтетических протезов. Золотым стандартом для хирургического лечения заболеваний сосудов малого диаметра на сегодняшний день является использование аутотрансплантатов. В качестве аутотрансплантатов наиболее часто применяют подкожную вену, а также грудную и лучевую артерии [181]. Однако использование аутологичных вен и артерий в большинстве случаев приводит к повторным операциям, связанным с деструктивными изменениями и окклюзией шунтов в течение 10 лет после имплантации. Кроме того, около 30% пациентов не обладают подходящими для трансплантации венами или артериями в результате уже перенесенных операций, либо других заболеваний [2, 182].
Потребность в альтернативной замене аутотрансплантатов привела к появлению биологических и синтетических протезов. Сосудистые протезы в отличие от клапанов сердца, имеющих ксеногенное происхождение, используются гораздо реже. Дело в том, что глютаральдегид, применяемый для консервации биологического материала, негативно влияет на последующую эндотелизацию внутренней поверхности протеза [98]. Для улучшения их биосовместимости осуществляют тщательную децеллюляризацию биоматериала. Кроме того, для этих целей возможно проведение генетической модификации тканей, либо временной иммуносупрессии [184]. Снижение тромбогенности сосудистых биопротезов отмечается при связывании на внутренней поверхности имплантата молекул гепарина [133]. Относительно неплохие результаты клинического применения демонстрируют ксенопротезы, обработанные диглицидиловым эфиром этиленгликоля (диэпоксид).
Исследование в отдаленный период эпоксиобработанных протезов в бедренно-подколенно-берцовой позиции показало, что их проходимость в сроки до 6 месяцев, 3 и 7 лет составила 76,8%, 45,9% и 29,3%, соответственно. При этом в качестве осложнений преобладали тромбозы, а также неоинтимальные стенозы в зоне анастомозов [1].
В свою очередь, для реконструкции кровеносных сосудов достаточно широко применяются протезы из синтетических материалов. Наиболее известными являются трансплантаты из полиэтилентерефталата (polyethylene terephthalate, PET – Dacron) и политетрафторэтилена (polytetrafluoroethylene, PTFE – Teflon) [52]. Однако, данные графты демонстрируют свою эффективность при протезировании сосудов большого диаметра ( 6 мм) с высокой скоростью кровотока. Клиническое же применение синтетических протезов для аортокоронарного шунтирования с использованием графтов малого диаметра ( 5мм) привело к негативным последствиям. Низкая проходимость трансплантатов Dacron и Teflon в реконструкции артерий малого диаметра обусловлено низкой скорость кровотока в данных сосудах, что приводит к тромбозу и гиперплазии неоинтимы в зоне анастомоза. Во избежание подобных осложнений требуется проведение длительной антикоагулянтной терапии пациента [42]. Также многообещающими материалами для изготовления синтетических протезов являются полиуретаны, благодаря их тромборезистентности, способности препятствовать гиперплазии неоинтимы, а также стимулировать рост тканей вокруг имплантата [62]. Тем не менее, их клиническое применение ограничено низкой биологической стабильностью. В результате этого стали развиваться подходы по преодолению этого недостатка, например, улучшение стабильности протеза из полиуретанов с помощью поликарбонатного сегмента [40, 101]. Ограничения в использовании сосудистых аутотрансплантатов, а также низкая эффективность синтетических протезов малого диаметра способствовали возникновению тканеинженерных подходов к искусственному созданию кровеносных сосудов. Первые попытки использовать прогресс клеточной биологии в сосудистой хирургии были осуществлены в 1970-х годах. Mansfield предложил покрывать внутреннюю поверхность сосудистых графтов эндотелиальными клетками с целью снижения тромбогенности синтетического материала [124]. В последующем такие подходы к модификации синтетических протезов как покрытие внутренней поверхности эндотелиальными клетками, миофибробластами, клетками предшественниками, а также гепарином и полярными фосфолипидами продемонстрировали в экспериментальных и в клинических испытаниях, что использование биологического компонента приводит к улучшению проходимости графтов [106, 184]. Однако, даже после модификации протеза остается опасность осложнений, связанных с реакцией тканей на синтетический материал, которая может приводить к воспалению, стенозам или инфицированию.
На решение данных проблем направлена разработка тканеинженерных кровеносных сосудов. Главной целью сосудистой тканевой инженерии является создание жизнеспособного графта, со свойствами аналогичными нативным сосудам [165]. Для изготовления тканеинженерного сосудистого графта преимуществено применяют эндотелиальные и гладкомышечные клетки, а также фибробласты пациента или донора [147]. Наибольшее предпочтение отдается аутологичным клеткам, так как аллогенные могут быть причинной иммунной реакции и отторжения трансплантата [131]. До недавнего времени в большей части работ использовали дифференцированные аутологичные клетки, выделенные из зрелых тканей, например из сегмента вены.
Дифференцированные клетки уже обладают специальными функциями, но существует ряд сложностей, связанных с их выделением и низкой пролиферативной активностью, что приводит к увеличению времени клеточной экспансии [170]. Также проблемой является низкая жизнеспособность клеток у пожилых пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями [33]. В результате чего поиск альтернативных клеток для тканевой инженерии привел к использованию стволовых клеток, а именно гемопоэтических клеток, мезенхимальных стволовых клеток и предшественников эндотелиальных клеток. Данные клетки более доступны для выделения, так как их источниками является аспират костного мозга, кровь, пуповина, жировая ткань, полученная при липосакции, а также пуповина [22, 79, 141, 174]. Независимо от того, какой источник клеток используется, в подходах тканевой инженерии сосудов можно выделить технологию самосборки клеточных пластов, а также создание графтов на основе матриксов.
Технология самосборки позволяет изготавливать тканевые пласты, состоящие из комплекса клеток и внеклеточного матрикса с механическими свойствами природного коллагена. Для этого фибробласты культивируют в среде, обогащенной аскорбиновой кислотой для стимуляции синтеза коллагена I типа [201]. После выработки достаточного количества внеклеточного вещества пласты последовательно скручивают в трубчатую конструкцию с помощью мандрела. После нескольких дней созревания внутреннюю поверхность полученного сосудистого графта эндотелизируют. В результате чего образуется три слоя: функциональный эндотелий, посаженный на «внутреннюю» мембрану, «медия», изготовленная из гладкомышечных клеток, а также «адвентиция» из живых фибробластов кожи [8]. «Внутреннюю мембрану» изготавливают путем нанесения фибробластов на цилиндрическую опору и культивируют до формирования гомогенной ткани. Затем полученную ткань децеллюляризируют. Роль внутренней мембраны заключается в предотвращении миграции гладкомышечный клеток в просвет графта и последующей гиперплазии неоинтимы.
Сканирующая электронная микроскопия поверхности сосудистых графтов
Сосудистые PCL графты диаметрами 2 и 4 мм изготавливали методом электроспиннинга. В основе электроспиннинга лежит процесс возникновения постоянных электростатических зарядов на молекулах полимера в растворе, помещенного в электрическое поле. Высокая плотность одноименных зарядов приводит к их отталкиванию друг от друга, вытягиванию из раствора струи и образованию тонкого полимерного волокна. Данный метод позволяет изготавливать пористые материалы, состоящие из нано- и микроволокон. Изготовление PCL графтов осуществляли на приборе Nanon-01A (MECC CO, Япония). Для этого раствор поликапролактона в хлороформе помещали в шприц объемом 5 мл, который соединяли с иглой диаметром 0,5 мм, имеющей тупой конец. В работе изучали несколько режимов работы элетроспиннинга: растворы полимера в концентрации 10%, 12%, 14% и 16%, напряжение на конце иглы 15 кВ и 25 кВ. Скорость подачи полимерного раствора составляла 1 мл/ч, расстояние до коллектора – 15 см, в качестве коллектора использовали вращающиеся штифты диаметром 2 и 4 мм. Процесс электроспиннинга продолжали до получения протеза с толщиной стенки 100-120 мкм. Сосудистый протез с такой толщиной стенки наиболее удобен для имплантации в аорту мелких лабораторных животных. Для инкорпорирования молекул ростового фактора в полимерное волокно использовали метод двухфазного электроспиннинга [169]. Раствор поликапролактона, выбранной концентрации, тщательно смешивали с раствором VEGF (1 мкг/мл) в соотношении 20:1 в течение 60 секунд с использованием вортекса до получения суспензии. Полученную смесь помещали в шприц (5 мл) и проводили электроспиннинг, как описано выше при выбранном оптимальном напряжении.
Физико-механические испытания сосудистых графтов
Важными параметрами для сосудистых графтов являются их физико-механические свойства, обуславливающие адекватное функционирование в кровеносном русле и долговечность протезов. Для определения графта с наилучшими показателями прочности и упруго-деформативных свойств, а также для оценки изменения данных параметров после введения в полимер молекул ростового фактора проводили физико-механические испытания в условиях одноосного растяжения. Исследование осуществляли с использованием универсальной испытательной машины «Zwick/roell»-2.5Н (Германия) в соответствии с ГОСТ 270-75. Предварительно образцы вырезали из PCL графтов и PCL графтов с VEGF диаметром 4 мм с помощью пресса и вырубной матрицы S3 (Zwick/roell, Германия). Изучаемые образцы помещали в зажимы таким образом, чтобы длина рабочего сегмента составляла 1 см. Для большей точности измерений и правильного положения образцов к ним применяли предварительную нагрузку – 0,01 Н. При проведении испытания скорость перемещения траверсы составляла 10,0 мм/мин. Прочность оценивали по максимальному напряжению при растяжении по формуле (1), упруго-деформативные свойства – по относительному удлинению до нарушения целостности образца по формуле (2) и модулю упругости (Емод) по формуле (3).
Диаметр волокон и морфологию сосудистых графтов изучали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Для этого из PCL и PCL с VEGF графтов с помощью острых хирургических ножниц вырезали образцы размером 0,50,5 см. Полученные образцы покрывали золотым токопроводящим напылением толщиной в 30 нм и далее изучали на сканирующем электронном микроскопе S3400N (Hitachi, Япония).
Оценку высвобождения ростового фактора из полимера в процессе его деградации проводили путем инкубирования образцов протезов с VEGF в фосфатно-солевом буфере с определением количества биомолекул в растворе через определенные промежутки времени [169]. При этом из графтов диаметром 4 мм, содержащих молекулы VEGF, вырезали кусочки 12 см2 с помощью острых хирургических ножниц. Предварительно все матриксы обрабатывали 70% этиловым спиртом в течение 10 мин, а затем отмывали фосфатно-солевым буфером. Каждый образец помещали в пробирки с объемом 1,5 мл и инкубировали при 37С и 5% СО2. Через установленные промежутки времени (12ч, 24ч, 48ч и далее через каждые 48 часов) в течение 80 суток, из каждой пробирки отбирали 200 мкл раствора и восстанавливали исходный объем свежим буфером. В собранных образцах определяли количественное содержание ростового фактора с использованием наборов для иммуноферментного анализа VEGF (R&D System, США). Для этого в лунки 96-луночного планшета, покрытые моноклональными антителами к VEGF, вносили по 50 мкл каждого образца и стандарты VEGF и инкубировали в течении 2 часов при комнатной температуре. Далее планшет промывали и в лунки добавляли по 100 мкл антител к крысиному VEGF, конъюгированных с пероксидазой хрена, и инкубировали 1 час. После чего промывку лунок повторяли и в каждую вносили перекись водорода с тетраметилбензидином. Ферментативную реакцию останавливали через 30 минут добавлением раствора серной кислоты. Измерение поглощения проводили при длине волны 450 нм на планшетном спектрофотометре Униплан (Пикон, Россия). После чего определяли концентрацию ростового фактора в каждом из образцов с использованием полученной стандартной кривой. Расчет количества VEGF, вышедшего в каждую точку исследования, проводили с учетом ростового фактора в ранее взятых пробах для проведения анализа.
Влияние инкорпорирования VEGF в PCL на структуру и прочностные свойства сосудистого графта
Важной задачей в данной работе является подбор сосудистого графта с оптимальными физико-механическими свойствами, так как он должен выдерживать нагрузку, оказываемую током крови. Кроме того, большое значение имеет и морфология поверхности протеза, поскольку это один из факторов обуславливающих воспалительную реакцию ткани на имплантат. Известно, что воспалительный ответ на имплантацию пористых полимеров или биоматериалов является более интенсивным по сравнению с непористыми материалами [224].
Существуют различные методы создания полимерных пористых сосудистых графтов. Однако, выбор того или иного метода в значительной степени оказывает влияние на механические свойства, а также микро- и наноструктуру конечного продукта. С одной стороны, идеальный искусственный графт должен обладать механическими свойствами, соответствующими нативным артериям. С другой стороны, он также должен имитировать морфологию внеклеточного матрикса, что может быть обеспечено высокопористой поверхностью, состоящей из нано- и микроволокон [140].
Одним из методов, привлекающим внимание в решении данной проблемы, является электроспиннинг растворов и расплавов полимеров. Метод электроспиннига позволяет изготавливать трехмерные высокопористые полимерные матрицы, состоящие из микро- и нановолокон [185]. Для электроспиннига могут быть использованы природные деградируемые материалы, такие как коллаген, гиалуроновая кислота или фибриноген [61, 64, 190]. К сожалению, эти полимеры обладают низкой прочностью и чаще используются в качестве покрытий для синтетических сосудистых протезов. Синтетические же деградируемые полимеры, такие как большинство алифатических полиэстеров, сополимер молочной и гликолиевой кислот, а также производные карбонатов, хотя и используются в качестве биоматериалов и систем доставки лекарственных препаратов, но достаточно быстро теряют механическую прочность в результате ускоренной биодеградации in vivo [64, 65]. В отличие от упомянутых синтетических полимеров, поликапролактон известен хорошими физико-механическими свойствами, и механизм его деградации in vivo обусловлен медленным гидролитическим процессом, что делает этот материал наиболее приемлемым для изготовления сосудистых графтов [97].
Ранее было показано, что физико-механические свойства и морфология материала, изготовленного методом электроспиннинга, напрямую зависят от множества параметров, таких как молекулярная масса и структура полимера, свойства растворителя, режимы процесса и условия среды. Но особое влияние на морфологию и прочность оказывает изменение подаваемого напряжения и концентрация полимера в растворе [140].
В связи с этим, в настоящем исследовании проведено сравнение физико-механических свойств и морфологии сосудистых графтов из поликапролактона, изготовленных при напряжениях 15 кВ и 25кВ и в диапазоне концентрации раствора полимера 10-16%. Данные значения напряжения и концентрации полимера были выбраны на основе анализа литературных данных, как параметры, при которых происходит электроспиннинг поликапролактона.
Принимая во внимание, что сосудистые графты устанавливают в кровеносное русло, при изготовлении протеза необходимо учитывать его физико-механические свойства. Проведенные испытания показали, что наибольшей прочностью (p 0,05) среди исследуемых образцов обладали PCL графты из 14 и 16% растворов полимера как при напряжении 15 кВ, так и 25 кВ (Таблица 1). Наименьшую прочность продемонстрировали образцы из 10% PCL. При этом не наблюдалось достоверных отличий между графтами, изготовленными при 15 кВ и 25 кВ (p 0,05).
Кроме того, важной характеристикой для материала, имплантируемого в организм, является его упругость, то есть способность возвращать прежнюю форму после деформации. Упругость материала характеризуется модулем Юнга. Результаты проведенного исследования не показали отличий по упругости материала между всеми группами сосудистых графтов из PCL (p 0,05). Для образцов, изготовленных из высоких концентраций PCL 14 и 16% (15 кВ), среднее значение модуля Юнга в пределах физиологического давления составило 1,92 и 2,00 Н/мм2 соответственно, а для образцов, изготовленных при 25 кВ, – 1,65 и 2,01 Н/мм2.
Полученные данные демонстрировали значительное влияние концентрации полимера в растворе на физико-механические свойства графтов. В то же время, напряжение, подаваемое на полимер при проведении электроспиннинга, не оказывало существенного влияния на прочность и эластичность протезов. Хорошие прочностные и упруго-деформативные свойства имели сосудистые графты из 14 и 16% PCL, которые достоверно превосходили по данным параметрам образцы из 10 и 12% полимера.
Важно, чтобы тканеинженерный графт обладал физико-механическими свойствами близкими к свойствам нативных сосудов [63]. Для того, чтобы определить, как соотносятся прочность и эластичность PCL графтов с биологической тканью, данные показатели сравнивали с результатами физико-механических испытаний ксенопротезов. Эти биологические сосудистые протезы, изготовленные из грудной артерии крупного рогатого скота и консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля, в настоящее время применяют в хирургической практике для реконструкций кровеносных сосудов малого и среднего диаметра [3]. Средние значения для ксенопротезов составили: прочность – 1,26 МПа, относительное удлинение – 95,4%, модуль Юнга – 0,28 Н/мм2. Полученные данные характерны для большинства биологических материалов и связаны с наличием в тканях эластина, коллагена и гликозаминогликанов, которые обеспечивают прочность и эластичность стенки кровеносного сосуда. В частности эластиновые волокна вносят основной вклад в эластичность ткани, а плотно расположенные волокна коллагена влияют на способность выдерживать напряжение, оказываемое током крови. И наконец, гликозаминогликаны являются ключевыми компонентами для обеспечения упругости ткани [219].
В свою очередь однокомпонентный материал из PCL не способен повторить сложные биомеханические свойства нативной ткани. Однако, благодаря своей высокой эластичности и прочности, которые превышают показатели для биопротезов в данном исследовании (p 0,05), сосудистый графт из PCL может быть использован в качестве временного сосудистого протеза при имплантации в кровеносное русло. Заселения PCL графта клетками в месте имплантации должно способствовать синтезу компонентов внеклеточного матрикса и постепенному замещению полимера с улучшением биомеханики сосуда.
Формирование кровеносного сосуда на основе имплантированного PCL графта с VEGF
Проведенное исследование с имплантацией PCL графта в брюшную аорту крыс показало сохранение структурной целостности полимерных трансплантатов в течение 10 месяцев без признаков образования аневризм и разрыва стенки. Результаты проведения операции по имплантации, УЗИ с допплерометрией, а также макроскопическое исследование после эксплантации позволяют предположить, что графт из PCL не подвергается деформациям, обусловленным деградацией полимера и способен функционировать в гемодинамических условиях in vivo достаточно длительное время. Кроме того, PCL графты, содержащие икорпорированные молекулы VEGF, демонстрировали аналогичные свойства. Несмотря на снижение прочности и эластичности материала после введения ростового фактора по сравнению с образцами из чистого PCL (гл. 3, п. 3.2), физико-механические свойства данных графтов были оптимальны для их функционирования в физиологичных условиях.
Одной из основных проблем использования синтетических сосудистых графтов является тромбоз и тромбоэмболические окклюзии. В некоторой степени все синтетические сосудистые трансплантаты являются тромбогенными [197]. Практически всегда обтурации тромботическими массами подвергаются графты диаметром меньше 2 мм, кроме того трансплантаты 4-6 мм часто демонстрируют полную или частичную окклюзию, даже не смотря на антикоагулянтную терапию. Причинами этого является низкая скорость тока крови в сосудах малого диаметра, местное изменение гемодинамики, повреждение стенки кровеносного сосуда в результате хирургического вмешательства и низкая тромборезистентность самого материала [118]. На сегодняшний день исследуются различные подходы к снижению тромбогенности сосудистых графтов: разработка новых тромборезистентных полимерных материалов, покрытие внутренней поверхности трансплантата эндотелиальными клетками, местная доставка антикоагулянтов, а также биологически активных молекул для ускорения эндотелизации [19, 48, 128]. Инкорпорирование в сосудистые графты из PCL молекул VEGF, проведенное в настоящем исследовании, способствовало снижению тромботической окклюзии трансплантата. Так в просвете графтов, не содержащих ростовой фактор, отмечалось наличие пристеночного тромба, значительно закрывающего просвет имплантата. В то время как графты с VEGF имели пристеночный тромб в области анастомоза с сохранением просвета. Вероятной причиной тромбообразования как с окклюзией в случае трансплантатов из чистого PCL, так и с образованием пристеночных тромбов в образцах с VEGF, может быть несовпадение диаметров графта и аорты, так как диаметр аорты крысы не достигает 2 мм, что приводит к нарушению гемодинамики в зоне анастомоза и образованию турбулентных потоков крови. В то же время во всех случаях в тромботических массах отмечалось наличие каналов, что возможно объясняет проходимость графтов, наблюдаемую в течение 10 месяцев на УЗИ с допплерометрией.
Известно, что основным фактором, предупреждающим тромбообразование в сосудистых протезах малого диаметра является наличие монослоя эндотелиальных клеток, который обеспечивает тромборезистентность поверхности при непосредственном контакте с кровью. Эндотелизация сосудистого графта развивается несколькими путями: миграция эндотелиальных клеток в просвет графта из участков нативного сосуда, прилегающих к анастомозу, проникновение клеток через микропоры имплантата из капилляров гранулематозной ткани, инфильтрирующей стенку графта, а также осаждение клеток из циркулирующей крови [224]. Среди факторов роста потенциально способных модулировать заживление сосудистых графтов, особую роль играет VEGF в связи с его свойствами, обеспечивающими стимуляцию миграции и пролиферации эндотелиальных клеток [130]. В работе Pektok с соавторами было показано, что полная эндотелизация немодифицированного сосудистого PCL графта диаметром 2 мм происходила через 6 недель после имплантацию в аорту крысы [55]. Принимая во внимание митогенные свойства VEGF в отношении эндотелиальных клеток и формирование эндотелиального слоя в первые месяцы после имплантации графта, можно предположить, что локальная доставка ростового фактора в настоящем исследовании посредством его инкорпорирования в биодеградируемый полимер, вероятно, привела к более быстрой эндотелизации трансплантата на начальных этапах, что способствовало снижению тромбообразования.
Важными характеристиками заживления сосудистого графта являются образование внутренней эндотелиальной выстилки, инфильтрация стенки трансплантата клетками и его прорастание капиллярной сетью. Усиление клеточной инфильтрации и ангиогенеза в материале графта без воспалительной реакции тканей на полимер может способствовать увеличению биосовместимости и, следовательно, сохранению проходимости и функциональности имплантата. Имплантация PCL графтов с VEGF и без ростового фактора в брюшную аорту крыс продемонстрировала интегрирование сосудистых полимерных трансплантатов в нативные ткани с глубокой клеточной инфильтрацией стенки. Клеточные элементы преимущественно были представлены фибробластами, окруженными большим количеством синтезированного межклеточного матрикса. Межклеточное вещество, состоящее из волокон коллагена и эластина, располагалось по всей толщине и длине графта. В свою очередь, коллаген в достаточном количестве должен выступать в качестве основы, способствующей укреплению стенки имплантата, в то время как происходит деградация синтетического полимера. Образование обширных участков межклеточного вещества между волокнами биодеградируемого полимера обеспечивает механическую прочность графта в процессе формирования тканей кровеносного сосуда до их полного созревания. В случае если деградация материала будет осуществляться слишком быстро, это может стать причиной образования аневризм или разрыва стенки графта [120]. В проведенном исследовании низкая скорость разрушения PCL и активный синтез фибробластами внеклеточного вещества в графтах с VEGF и без ростового фактора способствовали целостности имплантата в условиях кровообращения на протяжении 10 месяцев.
Неоваскуляризацию стенки сосудистого графта отмечали в образцах с инкорпорированным VEGF, при этом в имплантатах без биомолекул значительного количества капилляров обнаружено не было. Интересно, что похожую картину наблюдали и ученые в работе Valence S. по имплантации сосудистого PCL графта в брюшную аорту крысы, где было показано, что через 6 месяцев после имплантации наступает регрессия капилляров [119]. Это происходит в результате того, что через 6 месяцев из грануляционной ткани начинают постепенно исчезать макрофаги, которые секретируют ангиогенные факторы, стимулирующие образование новых сосудов и поддерживающие капиллярную сеть. Однако, как было показано в настоящем исследовании, выделение VEGF из PCL графта может обеспечивать васкуляризацию стенки имплантата в течении как минимум 10 месяцев. В свою очередь поддержание ангиогенеза в стенке имплантата способствует доставке кислорода и питательных веществ к клеткам.
