Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Раневой процесс и основные направления его местного лечения (обзор литературы) 14
1.1. Патогенетические изменения в тканях при раневом процессе 14
1.2. Основные направления местного лечения ран 21
1.2.1. Сорбенты 22
1.2.2. Антиоксидантные препараты 28
1.2.3. Антисептики 33
1.2.4. Биоактивные раневые покрытия 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Лабораторные исследования 43
2.3. Экспериментальные исследования 52
2.3. Методы статистической обработки данных 56
Глава 3. Разработка абсорбирующих матриц для наноструктурных биоактивных раневых покрьггий 58
3.1. Разработка акриламидного гидрогелевого абсорбента, исследование его биосовместимости 58
3.2. Исследование сорбционной активности и биосовместимости нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum 61
3.3. Сравнительная характеристика сорбционной активности акриламидного гидрогелевого абсорбента и нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы 65
Глава 4. Патогенетическое обоснование комплекса лекарственных препаратов для иммобилизации его на раневых покрытиях 68
4.1. Биоактивные свойства кластера фуллерен Сбо/Tween 80 68
4.1.1. Антиоксидантная активность растворов кластера фуллерен Сбо/Tween 80 69
4.1.2. Иммунологические сдвиги в организме животных с глубокими ожогами при парентеральном введении кластера фуллерен C60/Tween80 72
4.1.3. Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутрибрюшинном введении кластера Сбо/Tween 80
4.2. Сравнительная оценка антимикробной активности наночастиц металлов, традиционных и новых антисептических препаратов 82
4.2.1. Антимикробная активность наночастиц металлов и новых препаратов в лабораторных условиях 82
4.2.2. Антимикробная активность наночастиц металлов и новых препаратов при гнойной инфекции в эксперименте на животных 91
4.3. Обоснование комплекса лекарственных препаратов, воздействующего на основные звенья патогенеза раневого процесса...92
Глава 5. Разработка и применение в эксперименте биоактивных раневых покрытий на основе наноматериалов 94
5.1. Разработка биоактивных раневых покрытий на основе гидрогелевого абсорбента и нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum 94
5.2. Сравнительная оценка эффективности применения биоактивных раневых покрытий на основе наноматериалов при раневом процессе .. 100
Заключение 111
Выводы 121
Практические рекомендации 123
Список литературы 125
- Антиоксидантные препараты
- Исследование сорбционной активности и биосовместимости нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum
- Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутрибрюшинном введении кластера Сбо/Tween
- Сравнительная оценка эффективности применения биоактивных раневых покрытий на основе наноматериалов при раневом процессе
Введение к работе
Актуальность. Лечение ран остается одной из наиболее актуальных проблем военно-полевой, гнойной хирургии и комбустиологии. Общее число пострадавших и больных с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями от общего числа больных хирургического профиля составляет 30–35% (Лещенко И.Г., 2003). Наиболее часто такие процессы наблюдаются при механической травме, в том числе при огнестрельных ранениях, вызванных снарядами с высокой кинетической энергией, а также при термической и электротравме (Никитин С.Р., 2004; Попов В.А., 2003). Данные виды патологии отличаются длительными сроками заживления ран, высокой частотой неблагоприятных исходов в виде генерализации патологического процесса, инвалидизации, стойкого ограничения трудоспособности (Толстых М.П., 2002).
Особое внимание обращает на себя постоянно наблюдающийся рост антибиотикорезистентности микроорганизмов и увеличение частоты гнойно-септических осложнений раневого процесса (Парамонов Б.А., 2000). При этом ассортимент и доступность отечественных перевязочных средств, многокомпонентно воздействующих на раневой процесс, остаются недостаточными (Горюнов С.В., 2004).
В настоящее время в мировой литературе всё большее внимание уделяется перспективам развития нанотехнологий. Материалы, полученные с использованием нанотехнологий, могут найти и уже находят применение в различных областях научного знания, в том числе и медицине (Balshaw D.M., 2005). Поскольку вещество в виде наночастиц обладает свойствами, часто радикально отличными от их аналогов в виде макроскопических дисперсий или сплошных фаз, наноматериалы представляют собой уникальный класс веществ, на основе которых возможно создание новых фармакологически активных препаратов (Пиотровский Л.Б., 2006).
Объектами нанотехнологий могут быть непосредственно низкоразмерные объекты – наноэлементы с характерными размерами как минимум по одному измерению (наночастицы, нанопорошки, нанотрубки, нановолокна, наноплёнки), отдельные элементы устройств и систем. При этом под устройствами или системами, изготовленными с использованием нанотехнологий, понимаются такие, в которых даже один компонент является объектом нанотехнологий.
– разновидность продукции в виде материалов, содержащих структурные элементы с нанометровыми размерами, наличие которых обеспечивает существенное улучшение или появление качественно новых механических, химических, физических, биологических и других свойств, связанных с проявлением наномасштабных факторов.
В литературе описано множество биологически активных эффектов различных нанопрепаратов: антибактериальный (Медведева С.А., 2002), иммуномодулирующий (Меджидова С.А., 2002; Lin Y.L., 2000), антиоксидантный (Толстых М.П., 2000; Тюнин М.А., 2009) и другие.
При этом, как правило, большинство наноматериалов и нанобиокомпозитов изучены недостаточно: не установлены, в частности, общие биологические эффекты и возможная токсичность при их использовании на живых объектах, оптимальные концентрации и пр.
Отмеченные обстоятельства определяют необходимость комплексного исследования ряда наноматериалов и разработки нанобиокомпозитов, обладающих широким спектром биологической активности и возможностью оптимизировать, в частности, динамику раневого процесса.
Цель исследования: экспериментальное изучение сорбционных, антимикробных, антиоксидантных, иммуномодулирующих и других свойств наноматериалов, обладающих биологической активностью, и разработка на их основе наноструктурных сорбирующих биоактивных раневых покрытий для лечения ран различной этиологии.
Задачи исследования:
1) разработать гидрогелевый абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида и исследовать его сорбционную активность в сравнении с нано-гель-плёнкой целлюлозы Acetobacter xylinum;
2) изучить антиоксидантную активность водных растворов кластера фуллерен С60/Tween 80;
3) исследовать морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов и иммунологические показатели крови при парентеральном введении кластера фуллерен С60/Tween 80;
4) исследовать антимикробную активность в лабораторных условиях и в эксперименте на гнойных ранах, а также биосовместимость ряда биоактивных наноматериалов в сравнении с известными антисептиками;
5) обосновать с патогенетических позиций применение комплекса лекарственных препаратов и его иммобилизацию на раневых покрытиях;
6) на основе изученных наноматериалов разработать биоактивные раневые покрытия, способные оказывать комплексное оптимизирующее воздействие на раневой процесс, предупреждать его осложнённое течение, и изучить в эксперименте на животных их эффективность на модели гранулирующих ран после глубоких ожогов.
Научная новизна исследования. Разработан гидрогелевый акриламидный абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида, изучены его физико-химические, сорбционные свойства и биосовместимость. Разработана тканевая хлопчатобумажная основа, предотвращающая фрагментацию гидрогелевого абсорбента и позволяющая извлекать его из раны единым блоком.
Оптимизирован синтез целлюлозы Acetobacter xylinum и изучена её сорбционная способность в различных средах. Установлено оптимальное время насыщения бактериальной целлюлозы лекарственными препаратами и определён срок перевязок при использовании её в качестве матрицы-основы для раневых покрытий.
В эксперименте на животных показана биосовместимость разработанного гидрогелевого сорбента и нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы.
Путём определения антирадикальной активности и супероксидпродуцирующей активности тканевых макрофагов выявлены антиоксидантные свойства кластера фуллерен С60/Tween 80.
При парентеральном введении кластера фуллерен С60/Tween 80 на фоне обширных глубоких ожогов установлена его иммуномодулирующая способность.
Исследование общерезорбтивных свойств кластера фуллерен С60/Tween 80 показало, что морфологические изменения в тканях внутренних органов при его внутрибрюшинном введении отсутствуют.
Определена антисептическая активность: неорганно-органических нанобиокомпозитов, содержащих металлы – серебро, золото, платину и железо, стабилизированных природным полисахаридом – арабиногалактаном; комплекса поливинилпирролидон-нано-Se0; коллоидных растворов (нанокластеров) серебра, цинка и меди; а также разработанного при нашем участии модифицированного катапола. Установлено, что наиболее выраженными антисептическими свойствами по отношению ко всем исследуемым референтным и контрольным штаммам микроорганизмов обладают аргентарабиногалактан и модифицированный катапол (определены их оптимальные антимикробные концентрации). Эффективность этих препаратов подтверждена в эксперименте на гнойных ранах.
Экспериментальным путём установлен наиболее эффективный химический состав разработанного модифицированного катапола (приоритетная справка на изобретение «Антисептический комплекс» – № 2010109156 от 11.02.2010).
С патогенетических позиций определён комплекс лекарственных средств для абсорбции на раневых покрытиях, включающий нанопрепараты, воздействующие на основные звенья патогенеза раневого процесса.
Разработаны биоактивные наноструктурные раневые покрытия, обладающие высокой сорбционной, антисептической, антиоксидантной, антиферментной активностью, способные оказывать комплексное воздействие на основные звенья патогенеза раневого процесса как в первой, так и во второй его фазах: 1) трёхслойное гидрогелевое раневое покрытие, наиболее эффективное при раневом процессе с выраженной экссудацией (патент на полезную модель № 73198, БИ № 14, 2008, патент на изобретение № 2372944, БИ № 32, 2009) и 2) раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки целлюлозы Acetobacter xylinum (приоритетная справка на изобретение «Раневое покрытие с лечебным действием» – № 2010133389 от 09.08.2010). Экспериментально установлена эффективность их местного применения при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов.
Теоретическая и практическая ценность. Выявленная сорбционная активность и биосовместимость гидрогелевого абсорбента на основе акриловой кислоты и акриламида, а также перфорированных нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы позволяет рекомендовать их применение в качестве сорбентов при раневом процессе и в качестве матрицы-носителя биоактивных компонентов.
Исследование антирадикальной активности кластера фуллерен С60/Tween 80 и его влияния на супероксиданионпродуцирующую активность тканевых макрофагов показало целесообразность абсорбции данного кластера в качестве антиоксидантного препарата на раневых покрытиях.
При исследовании иммунологических показателей крови на фоне обширных глубоких ожогов после внутрибрюшинного введения кластера фуллерен С60/Tween 80 установлена его иммуномодулирующая активность, способствующая оптимизации раневого процесса.
При морфологических исследованиях внутренних органов после парентерального введения кластера фуллерен С60/Tween 80 выявлено отсутствие острой токсичности данного препарата.
Проведённые сравнительные исследования антимикробной активности ряда нанопрепаратов выявили целесообразность местного применения серебра, стабилизированного арабиногалактаном, и модифицированного катапола в качестве антисептических средств при раневом процессе на этапах медицинской эвакуации.
Разработаны первые отечественные наноструктурные биоактивные раневые покрытия, обладающие высокой сорбционной, антиоксидантной, антисептической и антиферментной активностью, местное применение которых оптимизирует раневой процесс, предотвращает его осложнённое течение и сокращает сроки заживления гнойных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов. Раневые покрытия могут быть рекомендованы для местного лечения неинфицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных, огнестрельных, гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах, пролежней и трофических язв.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Фуллерен С60 в составе комплекса с Tween 80 проявляет антиоксидантную активность, максимально выраженную в водных растворах с содержанием С60 0,05–0,1%.
-
Парентеральное введение фуллерена С60 в составе комплекса с Tween 80 не проявляет острой токсичности, а при внутрибрюшинном введении на фоне глубоких ожогов вызывает иммуномодулирующий эффект.
-
Раствор серебра, стабилизированный арабиногалактаном, и модифицированный катапол обладают выраженной антимикробной активностью в отношении основных госпитальных штаммов микроорганизмов в концентрациях 2,5% и 1,5% соответственно.
-
Биоактивные наноструктурные раневые покрытия на основе акриламидного гидрогеля и нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum с иммобилизованными в их составе кластером фуллерен С60/Tween 80, обладающего антиоксидантным и иммунотропными свойствами, антисептическим препаратом (диоксидин или серебро, стабилизированное арабиногалактаном, или модифицированный катапол), некролитическим (мочевина), антиферментным и гемостатическим (-аминокапроновая кислота) препаратами являются эффективным средством местного лечения инфицированных, гнойных ран и гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах. Их применение предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран на 17,5%.
Реализация работы. По теме исследования опубликовано 28 печатных работ. Получен патент на полезную модель «Гидрогелевое покрытие для лечения ран» (№ 73198, БИ № 14, 2008), патент на изобретение: «Покрытие для лечения ран» (№ 2372944, БИ № 32, 2009), получены приоритетные справки по заявкам на изобретения: «Антисептический комплекс» (№ 2010109156 от 11.02.2010) и «Раневое покрытие с лечебным действием» (№ 2010133389 от 09.08.2010). Зарегистрировано 16 рационализаторских предложений. Результаты исследований внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской работе кафедры патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (ВМА).
Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования изложены в докладах на Итоговых конференциях Военно-научного общества курсантов и слушателей ВМА 2008, 2009, 2010 (I место на конкурсе научных работ) годов, на научно-практической конференции в честь 71-летия со дня основания IV факультета ВМА (2009), Международных научно-практических конференциях «XXXVIII и XXXIX недели науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Изобретатели и инновационная политика России» – I место в секции медицина и биология (Санкт-Петербург, 2010).
Результаты работы представлены в виде постерных докладов на Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2007); Конференции Политехнического симпозиума «Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2007); 2-ом Санкт-Петербургском Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); Конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение» (Ташкент, 2008); XIII Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции (Промышленные инновации)» (Санкт-Петербург, 2008); Международных Салонах промышленной собственности – «Архимед 2009» (Серебряная медаль), «Архимед 2010»; X Московском Международном Салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2010).
Объём и структура работы. Материалы диссертационного исследования представлены на 151 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных лабораторных и экспериментальных исследований (3, 4 и 5 главы), выполненных на 216 крысах, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Работа содержит 35 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 201 источник, из них 128 отечественных и 73 иностранных авторов.
Антиоксидантные препараты
Серьёзные достижения последних лет в области молекулярной биологии и патофизиологии позволили более глубоко раскрыть ранее неизвестные меха низмы патогенеза воспалительного и, в частности, раневого процесса. Показано, что причиной нарушения регуляции заживления ран, его осложнённого течения, перехода ран в разряд долго не заживающих является вторичная альтерация, в основе которой лежит нарушение баланса систем продукции активных форм кислорода и эндогенной антиоксидантной защиты [107, 185]. В то же время, несмотря на достаточно большое количество известных химических соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, арсенал эффективных препаратов для местного лечения ран с такой активностью существенно ограничен [78].
Известно, в частности, использование с этой целью дибунола [16, 121], ди-этона [56], мексидола [38], а-токоферола (витамин Е), витамина А, желчных кислот, липоевой кислоты [78]. Большие перспективы связывают с разработкой антиоксидантов на основе супероксиддисмутазы [40, 45]. В то же время, липо-филыюсть некоторых антиоксидантов является их значительным недостатком, так как делает невозможным их применение в первой фазе раневого процесса [32, 70]. В связи с этим предпринимаются попытки создания водорастворимых форм липофильных антиоксидантов, например, а-токоферола [149].
Использование в лечебных целях антиоксидантов стабилизирует собственную многокомпонентную систему антиоксидантной защиты и тормозит развитие свободнорадикального перекисного окисления липидов, клеточных и капиллярных мембран, предотвращая повреждение клеток и тканей, ограничивая распространение воспалительных изменений и вторичного некроза тканей [113]. При этом значительно усиливается фагоцитарная активность макрофагов и повышается неспецифический иммунитет [16, 107]. Применение антиоксидантов при лечении огнестрельных ран через 1 час после ранения уменьшает количество иссекаемых тканей при первичной хирургической обработке в 1,3-1,85 раза [121].
Расширение ассортимента антиоксидантов, в первую очередь на основе наноматериалов, и их дальнейшее применение при лечении воспалительного процесса, по нашему мнению, должно способствовать предотвращению развития осложнений и скорейшему заживлению ран.
В связи с этим особый интерес представляют фуллерены, открытые в 1985 году коллективом учёных: Н. Kroto (Англия), S. O Brien, R. Curl, R. Smalley (США) [158]. До открытия фуллерена считали, что углерод образует три аллотропных формы: алмаз, графит и карбин. Фуллерены принципиально отличаются от них тем, что во-первых, представляют собой новую форму углерода не только по структуре (алмаз, графит, карбин - бесконечные системы, а фуллерены - семейство индивидуальных полиэдрических молекул), но и по существу, так как его молекула содержит фрагменты с пятикратной симметрией (пентагоны), которая не характерна для неорганических соединений (рисунок 5).
О высоком потенциале использования фуллеренов в медицине и биологии учёные заговорили практически с момента их открытия. В настоящее время установлено, что фуллерены, обладая антиоксидантной [193], нейропротек-тивной [146, 147], мембранотропной [7, 158], противовирусной [60, 168, 176], антибластомной [197], антимикробной [189] и фотодинамической активностью [156, 191], являются перспективным материалом для создания новых высокотехнологичных медицинских материалов и лекарственных препара тов [87]. Фуллерены были обнаружены, в том числе и в шунгитовых породах [95, 96], углерод из которых нашёл применение в различных отраслях медицины [77, 123].
Серьёзным осложняющим фактором при исследовании биологических свойств самого фуллерена и большинства его производных является их практически полная нерастворимость в полярных растворителях [131]. Растворение фуллеренов в воде может быть достигнуто с помощью детергентов типа Tween 80 [55], фосфолипидов [132], аминопропанола [27] или полимеров типа N-поливинилпирролидона [61, 196]. В этих случаях не происходит образования ковалентных связей, и молекула фуллерена остаётся неизмененной. В связи с нерастворимостью фуллеренов большинство сведений об антиоксидантной активности были получены при работе с химически модифицированными водорастворимыми производными (фуллеренол, карбоксифуллерен и др.). Способность фуллеренола действовать в биологических системах в качестве ловушки для свободных радикалов подтверждается тем, что он снижает концентрацию свободных радикалов в крови и может быть использован как ловушка для супероксидных радикалов 02 , генерируемых in vitro ксантином и ксантин-оксидазой [137, 139]. В других исследованиях фуллеренол блокировал вызванное перекисью водорода ингибирование передачи нейрональных сигналов [188], спазм бронхов [164], предупреждал некроз тканей при ишемически-реперфузионном повреждении кишки [162, 163]. Другое водорастворимое производное фуллерена — карбоксифуллерен - также проявляет выраженные анти-оксидантные свойства. Показано, что он является эффективной ловушкой для гидроксил-радикала ОН и супероксид анион-радикала Ог " [145, 193]. Введение карбоксифуллерена в боковые желудочки мозга при реперфузионной ишемии снижало поражение коры головного мозга и предупреждало повышение уровня перекисного окисления липидов [166].
Исследование сорбционной активности и биосовместимости нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum
При разработке раневых покрытий важной задачей является возможность абсорбции ими биоактивных компонентов. По нашему мнению, наиболее целесообразным является использование при этом эффективных вульнеросорбен-тов. Такие сорбенты могут использоваться как каркасная основа для лекарственных препаратов десорбирующихся в рану с последующей сорбцией раневого отделяемого.
По опубликованным данным и нашим наблюдениям наиболее эффективными вульнеросорбентами являются гидрогелевые и гидроколлоидные материалы. Такие сорбенты легко моделируются на ранах со сложным рельефом, проявляют пластифицирующее воздействие на ткани, создают в ране влажную среду, оптимальную для нормального течения процессов регенерации, способствуют элиминации раневого отделяемого и микрофлоры. В то же время, существенным недостатком таких сорбентов является их фрагментация в ране с последующим возникновением местных осложнений, а также недостаточная паро- и воздухопроницаемость. Слабая активность таких сорбентов делает невозможным их применение при раневом процессе с выраженной экссудацией.
Отмеченные обстоятельства определили необходимость разработки нового гидрогелевого сорбента на основе акриловой кислоты и акриламида, а также изменений условий синтеза известного природного абсорбента - целлюлозы Acetobacter xylinum.
Известно, что для получения супервлагоабсорбента (СВА) с высокими абсорбционными характеристиками и приемлемыми механическими свойствами необходимо синтезировать особую молекулярную структуру путём: - сополимеризации гидрофильных мономеров с гидрофобными в различных соотношениях: первые обеспечивают высокое набухание, вторые способствуют улучшению механических свойств [157,178, 199]; - варьирования природы и плотности сшивки гидрогеля: увеличение плотности сшивки обычно повышает модуль упругости и структурные свойства, но уменьшает абсорбционную способность СВА [124, 126, 154, 201]; -варьирования условий полимеризации [142, 200].
При разработке гидрогелевого абсорбента на основе акриловой кислоты и акриламида со сшивающим агентом персульфатом аммония были учтены данные условия и получен СВА. Особенностью разработанного гидрогелевого абсорбента является то, что для нейтрализации местного тканевого ацидоза он содержит в своём составе раствор бикарбоната натрия, позволяющий поддерживать показатель рН в пределах 7,0-7,5.
Сорбционная способность гидрогелевого акриламидного абсорбента была проверена в различных средах, одновременно проведена сравнительная его оценка со сходным по химической структуре гидрогелем «Апполо» и дренирующим сорбентом «Диовином». Общее число наблюдений составило 84 (таблица 3). Гель сравнения «Апполо» содержит 95% влаги, эластичностью не обладает. Абсорбент «Диовин» - порошок с содержанием влаги - менее 1%. Разработанный гидрогелевый абсорбент отличается эластичностью, в связи с его фиксацией на тканевой основе (см. раздел 5.1) и влагосодержанием 75%.
Установлено, что разработанный гидрогелевый абсорбент (рисунок 8) обладает более высокой сорбционной активностью в биологических средах по сравнению с гидрогелем «Апполо» и «Диовином», что может позволить в течение длительного времени осуществлять сорбцию раневого отделяемого, предупредить его застой в полости раны и возможное последующее нагноение.
При применении акриламидного абсорбента в эксперименте на модели кожно-плоскостных условно асептических ран на спине крыс клинически воспалительно-дегенеративных явлений в ране в послеоперационном периоде не отмечено. Исследуемый сорбент активно впитывал раневое отделяемое (рисунок 9). По данным гистоморфологических исследований на 7-е сутки на поверхности ран определяли незначительный по объёму некротический слой с очаговыми кровоизлияниями, формирование грануляционной ткани с разрастаниями в отдельных участках новообразованной жировой ткани. Грануляционная ткань была неравномерно отечна с большим количеством тонкостенных сосудов, часть из которых вертикально ориентирована к поверхности раны при аппликации на условно асептической ране (А) и после сорбции раневого отделяемого (Б). В - вид раны на 7-е сутки Таким образом, выявлена классическая картина неосложнённого регенеративного процесса, что позволило сделать вывод о биосовместимости и биоинертности гидрогелевого акриламидного абсорбента. Для установления времени насыщения нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum (НГП ЦАХ) лекарственными препаратами и оценки сорбционной способности кинетика сорбции отжатых гель-плёнок была определена во времени по массе в различных средах: 1) растворы лекарственных препаратов - 1% раствор мочевины, 1% раствор диоксидина, 2,5% раствор аргентарабиногалактана; 2) биологические среды - плевральный экссудат, желчь, свежезаготовлен ная донорская кровь, раствор аминокислот («Аминоплазмаль Е»); 3) другие среды - дистиллированная вода, физиологический раствор.
Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутрибрюшинном введении кластера Сбо/Tween
Внутрибрюшинное введение фуллерена крысам с термическим ожогом приводило к достоверному снижению показателей РТМЛ с Кон-А на 21% и с ФГА - на 13%, что свидетельствовало о повышении лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов. Фагоцитарная активность нейтрофилов увеличивалась на 46%, при этом фагоцитарное число, равное среднему числу микробов, поглощённых одним активным нейтрофилом, снижалось на 22%, показатель завершённости фагоцитоза оставался неизменным.
Применение препарата сопровождалось изменением активности кислородзависимых антиинфекционных систем лимфоцитов, характеризующих степень активации гексозомонофосфатного шунта и связанное с этим образование свободных радикалов. В группе животных, получавших фуллерен, показатели спонтанного НСТ-теста повышались по сравнению с нелечеными термическими ожогами на 5%. Наряду с этим, происходило снижение активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов на 23%.
Иммунологические показатели были исследованы также на 8-е сутки, но в связи с однократным введением кластера фуллерен C60/Tween 80 оказались не достоверными.
Установлено, что парентеральное однократное введение в ранний срок при термическом ожоге у крыс кластера фуллерен Сбо/Tween 80 оказывает выраженное иммунотропное действие, вследствие чего изученные иммунологические показатели приближались к значениям, характерным для интактных животных. Результаты проведённых исследований являются дополнительным основанием целесообразности применения фуллеренов при раневом процессе в составе комплексной патогенетически обоснованной терапии.
Исследование общерезорбтивных (общетоксических) свойств различных водорастворимых форм фуллерена Сбо является важной задачей в изучении их влияния на биологические системы [87, 171, 176]. Это обусловлено, во-первых, недостаточным количеством публикаций по данному вопросу и, во-вторых, противоречивостью опубликованных результатов [113], что связано с формой водорастворимого фуллерена, используемого в эксперименте, и непосредственно с технологией синтеза, так как при этом применяются достаточно токсичные вещества, и при недостаточной очистке от них в опытах на животных возможно получение спорных результатов.
Исходя из важности вышеперечисленных обстоятельств, с помощью морфологических методов нами были изучены общерезорбтивные свойства кластера фуллерен Сбо/Tween 80.
Общерезорбтивные свойства кластера фуллерен C60/Tween 80 были определены с помощью гистоморфологического исследования тканей после внут-рибрюшинного введения его 0,25 и 0,5 мл 10% раствора, что соответствовало 0,05% содержанию фуллерена С6о в сравнении с 10% раствором Tween 80. Животные были разделены на 4 группы: внутрибрюшинное введение 0,25 и 0,5 мл 10% раствора кластера Сбо/Tween 80 (опыт), а также 0,25 и 0,5 мл 10% раствора Tween 80 (контроль).
В ходе исследования проводили оценку общего состояния животных (особенности поведения, двигательная активность, аппетит, естественные выделения, состояние волосяного и кожного покровов, видимых слизистых оболочек). Парентеральное введение растворов кластера фуллерен Сбо/Tween 80 не вызывало изменений в состоянии животных. Масса тела во всех группах имела устойчивую положительную динамику. Потребление животными жидкости и пищи, естественные отправления, нарушены не были. Кожные покровы и видимые слизистые оболочки были не изменены.
При вскрытии большинства животных опытных и контрольных групп на 4-е и 9-е сутки отличий в макроскопической картине внутренних органов не обнаружено. Относительная масса органов во всех группах достоверных различий не имела. Выявленные изменения во внутренних органах представлены в таблице 11. Гистоморфологические исследования показали, что введение 10% раствора кластера C6o/Tween 80 вызывало следующие изменения. В миокарде на 4-е сутки наблюдали контрактурные сокращения групп кардиомиоцитов, незначительный отёк межуточной стромы. Сосудистые расстройства проявлялись незначительным отёком межуточной ткани и полнокровием капилляров. На 9-е сутки дополнительно наблюдали изменения и фрагментацию единичных кардиомиоцитов, анизотропию, незначительный отёк, геморрагии (рисунок 15). В тканях лёгких на 4-е сутки изменения отсутствовали. На 9-е выявлено неравномерно выраженное полнокровие капилляров межальвеолярных перегородок. В печени на 4-е сутки отмечены умеренные дистрофические изменения гепатоцитов в виде зернистой дистрофии, неравномерном кровенаполнение синусоидальных капилляров, незначительной лимфоцитарной инфильтрации портальных трактов. Архитектоника печёночных балок была не изменена. В почках были выявлены умеренные дистрофические изменения нефроци-тов в виде зернистой дистрофии и полнокровия мозгового вещества почек (рисунок 16). В тонкой кишке на 4-е сутки наблюдали незначительный отёк собственной пластинки слизистой оболочки и полнокровие сосудов брыжейки. В селезёнке на 4-е сутки белая пульпа была представлена лимфатическими узелками, в некоторых из которых имелись белые центры. Отмечено полнокровие красной пульпы. На 9-е сутки в печени, тонкой кишке и селезёнке были выявлены незначительные нарушения кровоснабжения. Введение 10% раствора Tween 80 вызывало следующие морфологические изменения. В миокарде на 4-е и 9-е сутки определяли контрактурные сокращения единичных кардиомиоцитов, анизотропию, незначительный отёк, единичные диапедезные кровоизлияния. В селезёнке, тонкой кишке, почках значительных изменений по сравнению с 1-й группой выявлено не было.
Сравнительная оценка эффективности применения биоактивных раневых покрытий на основе наноматериалов при раневом процессе
В настоящее время в мировой литературе уделяется много внимания развитию и внедрению наноразмерных объектов и частиц, размеры которых находятся в пределах приблизительно от 1 до 100 нанометров. Современная тенденция к миниатюризации позволила выявить, что вещества, использующиеся в данном диапазоне, способны приобретать ранее не установленные свойства. Материалы, созданные на основе наночастиц, могут найти и уже находят применение в различных областях научного знания, в том числе и медицине [6,129, 133].
Использование нанотехнологий в биологических системах, прежде всего, предполагает создание новых биосовместимых наноразмерных материалов и комплексное исследование их биологических свойств. Существенное значение при этом имеют природа наночастиц, а также реализованные механизмы их стабилизации. Использование природных полимеров в качестве наностабили-зирующих матриц привело к созданию раздела наноразмерного материаловедения - нанобиокомпозитам [88].
В литературе описано множество биологически активных эффектов различных нанопрепаратов: антибактериальный [59, 84], иммуномодулирующий [60, 168], антиоксидантный [113, 107] и другие, которые могли бы использоваться при раневом процессе, при этом, проблема лечения ран продолжает оставаться одной из наиболее актуальных в современной медицине. Общее число пострадавших и больных с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями от общего числа больных хирургического профиля составляет 30-35% [41, 52, 111]. С нашей точки зрения, оптимизация раневого процесса является одной из наиболее актуальных проблем военно-полевой и гнойной хирургии, комбустиологии в том числе из-за постоянного роста анти-биотикорезистентности микроорганизмов и увеличения частоты осложнений раневого процесса [78]. Клиническая практика подтверждает, что ассортимент и доступность отечественных перевязочных материалов, многокомпонентно воздействующих на основные звенья патогенеза раневого процесса, остаются недостаточными [28].
Нам представлялось, что решению этой проблемы может способствовать исследование биологической активности наноматериалов и нанобиокомпози-тов, свойства которых изучены недостаточно (не установлены, в частности, их биологические эффекты и возможная токсичность при их использовании на живых объектах, оптимальные концентрации и прочее).
Отмеченные обстоятельства определили необходимость комплексного исследования ряда наноматериалов, обладающих различным спектром биологической активности, их комбинаций и влияния на динамику раневого процесса.
Целью исследования явилось экспериментальное изучение сорбционных, антимикробных, антиоксидантных, иммуномодулирующих и других свойств наноматериалов, обладающих биологической активностью и разработка на их основе наноструктурных сорбирующих биоактивных раневых покрытий для лечения ран различной этиологии.
Современные представления о патогенезе раневого процесса, знание основных закономерностей, определяющих его течение, позволили сформулировать патогенетически обоснованные принципы местного медикаментозного лечения ран. Как известно, при местном лечении ран в первую очередь решают следующие задачи: подавление инфекции в ране, нормализация местного го-меостаза, активация отторжения некротических тканей, сорбция продуктов микробного и тканевого распада. Для этого в хирургической практике применяют антисептики, сорбенты, антиоксиданты и другие препараты, преимущественно зарубежного производства [73, 78, 92, 94].
Первым этапом нашего исследования стала разработка несущих матриц для наноструктурных раневых покрытий. Необходимость такого исследования была обусловлена тем, что важной задачей при разработке покрытий для лечения ран является реализация абсорбции на них биоактивных компонентов. Мы считаем, что наиболее целесообразным является использование в качестве таких несущих матриц эффективных вульнеросорбентов. Такие сорбенты могут использоваться как каркасная основа для лекарственных препаратов, десорби-рующихся в рану с одновременной сорбцией раневого отделяемого.
На базе кафедры синтетических каучуков и элементоорганических соединений Санкт-Петербургского Технологического института при нашем непосредственном участии был разработан гидрогелевый супервлагоабсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида, со сшивающим агентом персульфатом аммония, особенностью которого является то, что он для нейтрализации местного тканевого ацидоза содержит в своём составе раствор бикарбоната натрия, позволяющий поддерживать показатель рН в пределах 7,0-7,5.
При исследовании его сорбционных свойств было установлено, что гидрогелевый абсорбент обладает более высокой сорбционной активностью в биологических средах по сравнению с использующимися в хирургической практике гидрогелем «Апполо» и «Диовином», что может позволить в течение длительного времени осуществлять сорбцию раневого отделяемого, предупредить его застой в полости раны и возможное последующее нагноение.
Исследование сорбционных свойств нано-гель-плёнок целлюлозы Aceto-bacter xylinum проведено нами совместно с сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН. Выбор целлюлозы Acetobacter xylinum был обусловлен тем, что её надмолекулярная организация существенно отличается от растительной целлюлозы, обычно используемой в медицине. Сложная ультраструктурная архитектура нано-гель-плёнок позволяет удерживать недоступное для растительной целлюлозы количество воды - от 100 до 200 г воды на 1 г сухого полимера, сохраняя при этом высокую собственную прочность на разрыв (до 2 кгс/мм") [118]. Указанные выше характеристики позволяют насыщать её практически любыми лекарственными препаратами и использовать в качестве матрицы-носителя для раневых покрытий [13, 78, 79].
Сорбцию нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы оценивали во времени по массе в различных средах 1) растворы лекарственных препаратов — 1% раствор мочевины, 1% раствор диоксидина, 2,5% раствор аргентарабиногалак тана; 2) биологические среды - плевральный экссудат, желчь, свежезаготовленная донорская кровь, раствор аминокислот («Аминоплазмаль Е»); 3) другие среды — дистиллированная вода, физиологический раствор.
Анализ полученных результатов позволил установить, что наиболее оптимальным временем для насыщения нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы лекарственным препаратом составляет 120 минут, а патологическое отделяемое из раны может максимально сорбироваться такими плёнками на протяжении суток, что определяет сроки перевязок.
