Введение к работе
Актуальность исследования. Атеросклероз и его клинические проявления занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности в России. На основании эпидемиологических исследований выявлена группа факторов риска атеросклероза. Уровень холестерина в крови, артериальное давление, курение, образ жизни – модифицируемые факторы риска. Возраст, пол и семейный анамнез относятся к немодифицируемым факторам риска ИБС и атеросклероза. Воздействие на факторы риска является как способом первичной профилактики атеросклероза, так и непрямым лечением (Информационный бюллетень ВОЗ, 2011, №317).
Существует представление о прямом лечении атеросклероза, то есть таком воздействии на сосудистую стенку, которое предотвращает возникновение и прогрессирование атеросклеротических поражений в артериях человека, а в идеале – вызывает регрессию атеросклероза. Подходы к прямому лечению атеросклероза находятся в стадии разработки, и в настоящее время не существует лекарств, в полной мере обладающих прямым антиатеросклеротическим действием. Кроме того, отсутствует система единых взглядов на патофизиологические процессы формирования атеросклеротических поражений.
Тем не менее, общепризнанно, что ведущим признаком атеросклероза является накопление липидов, главным образом свободного холестерина и его эфиров, в сосудистой стенке ((Libby P et al., 2010; 2011; Soloperto G & Casciaro S, 2012). Источником накапливающихся липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП). При этом для проявления атерогенного эффекта необходима химическая модификация липопротеидных частиц, поскольку нативные ЛНП в большинстве случаев не вызывают накопления холестерина в клетках сосудистой стенки.
Патогенетический подход к профилактике и лечению атеросклероза определяется необходимостью устранения основной причины заболевания, а именно предотвращением накопления внутриклеточных липидов или удаления их избытка. Вариантов достижения этой цели может быть много. В настоящей работе мы остановились на четырех из них, что объясняется современными представлениями о молекулярно-клеточных механизмах атеросклероза. Согласно этим представлениям, важную роль в возникновении и развитии атеросклеротического поражения играют модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), процессы воспаления в сосудистой стенке, половые гормоны и липопротеиды высокой плотности (ЛВП).
1. Обнаруженная in vivo подфракция циркулирующих модифицированных ЛНП, способная вызывать накопление липидов в клетках интимы аорты человека, формируется за счет десиалирования. Наибольшую атерогенность проявляют мелкие плотные десиалированные цмЛНП (Orekhov AN et al., 1991).
2. Не вызывает сомнения связь между инициирующими событиями атерогенеза и вовлечением в этот процесс воспаления и клеточного иммунитета. Основанием для таких взглядов являются результаты исследований, подчеркивающих роль иммунокомпетентных клеток в атеросклеротических поражениях, а также присутствие в крови и сосудистой стенке аутоантител против ЛНП (Ridker PM et al., 2012).
3. Многочисленные данные позволяют заключить, что женские половые гормоны (эстрогены) являются эффективным естественным фактором защиты сосудов от атерогенеза (Bhma B et al., 2009). Преобладающей формой защитного действия эстрогенов является их влияние непосредственно на стенки сосудов, тогда как влияние эстрогенов на липопротеидный профиль крови обеспечивает лишь 25–40% защиты.
4. Наконец, способность липопротеидов высокой плотности (ЛВП) препятствовать развитию атеросклеротических поражений была убедительно документирована в лабораторных исследованиях (Waksman R et al., 2010). Данные эпидемиологических исследований указывают на возможность применения ЛВП-терапии для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний (Nissen SE et al., 2003).
Существенным препятствием для повышения эффективности терапии атеросклероза, в том числе на ранних стадиях его развития, является отсутствие современных патофизиологических моделей и цельного алгоритма поиска и создания лекарственных и нелекарственных средств прямого антиатеросклеротического действия.
Клеточный культуральный тест представляется нам наиболее адекватным способом моделирования ранних процессов атерогенеза. Он позволяет дать оценку антиатерогенного потенциала лекарственных кандидатов и провести серийные испытания, необходимые для потокового скрининга фармакологически активных веществ.
Тем не менее, широкое использование синтетических лекарственных средств с целью профилактики атеросклероза на ранних его стадиях является проблематичным в силу наличия узких показаний для их назначения, побочного действия и высокой стоимости лечения. Для ранней профилактики и лечения атеросклероза целесообразно использование нелекарственных и лекарственных препаратов природного происхождения (ППП), поскольку многие из них не оказывают побочного действия при достаточной терапевтической эффективности, привлекательны по ценовой доступности, что обепечивает возможность длительного или даже пожизненного применения. Кроме того, препараты природного происхождения часто обладают более широким спектром эффектов, чем лекарственные препараты, оказывая влияние на ряд звеньев развития атеросклероза и осуществляя, параллельно с прямым антиатеросклеротическим эффектом, непрямое антиатеросклеротическое воздействие (Frank J. et al., 2009; Lu N. et al., 2009; Tinahones et al., 2009).
Целью данной работы является исследование клеточных и молекулярных механизмов развития атеросклероза и создание на основе накопленных знаний ППП, обладающих высоким антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом.
Из этого следует, что для достижения цели работы необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить отдельные аспекты атерогенеза человека:
- механизмы возникновения атерогенности ЛНП;
- влияние эстрогенов на клеточные проявления атеросклероза;
- участие ЛВП в обратном транспорте холестерина;
- роль иммуно-воспалительных клеток в атерогенезе.
2. Разработать следующие модели для создания ППП, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом:
- модель для выявления антиатерогенной активности ППП, основанную на подавлении атерогенной модификации липопротеидов;
- клеточную модель для поиска богатых фитоэстрогенами ППП из растительного сырья, обладающего антиатеросклеротической активностью;
- клеточную модель для создания ППП, потенциально пригодных для ЛВП-терапии;
- клеточную модель для выявления антиатеросклеротической активности ППП, основанную на определении клеточных показателей иммуно-воспалительных реакций (экспрессии цитокинов).
3. С использованием разработанных моделей выявить натуральные продукты, пригодные для получения ППП, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом и разработать рецептуру таких ППП.
4. Апробировать универсальный алгоритм НИР, направленных на исследование, разработку и создание антиатеросклеротических препаратов.
5. Разработать рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики.
Научная новизна исследования. Все приведенные в работе данные получены впервые и опубликованы в высокорейтинговых отечественных и зарубежных научных изданиях. Разработанные подходы, методики и продукты являются инновационными и соответствуют современному мировому уровню.
Уточнена роль транс-сиалидазы в патогенезе атеросклероза – изучена субстратная и акцепторная специфичность транс-сиалидазы.
Изучено влияние женских и мужских половых гормонов на патогенез атеросклероза, в частности, на внутриклеточное накопление холестерина в клетках сосудов, инициированное какими-либо факторами.
Получены данные, подтверждающие, что путь оттока холестерина, использующий apoA-I в качестве акцептора, имеет доминирующий вклад в экспорт холестерина из макрофагов in vivo.
Проведено морфологическое исследование связи между накоплением липидов в клетках артериальной интимы и антигенпрезентирующей активностью этих клеток.
Дано экспериментальное обоснование профилактического и лечебного применения ряда растительных объектов при развитии атеросклероза. Проведена оценка эффективности этих объектов с использованием моделей, имеющих разные патогенетические основы, что позволило установить различные механизмы их действия и предложить алгоритм поиска наиболее перспективных ППП.
Инновационный характер потенциальных продуктов для антиатеросклеротической терапии определяется следующими особенностями: направленностью на процесс накопления холестерина в артериальной сосудистой стенке; плейотропным механизмом действия; патентоспособной рецептурой и технологией получения ППП.
Научно-практическая значимость. Получено экспериментальное подтверждение фармакологической эффективности (антиатерогенное и антиатеросклеротическое действие) ряда растительных объектов.
Экспериментально обоснована целесообразность применения указанных растительных объектов в составе моно- и комплексных препаратов для терапии атерослероза.
Созданы клеточные и ферментативные модели, которые целесообразно применять для оценки антиатеросклеротической активности растительного сырья для создания препаратов, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом.
Разработаны и утверждены в РМАПО методические рекомендации «Биологически активная добавка к пище «Алликор»: ингредиентный состав, биологические эффекты, рекомендации по применению».
По результатам работы получен патент № 2484841 от 20 июня 2013 г. «Способ профилактики атеросклероза, основанный на подавлении атерогенной модификации липопротеидов». Подана заявка на выдачу патента: «Способ профилактики атеросклероза, основанный на оттоке холестерина из клеток сосудистой стенки».
Положения, выносимые на защиту
1. Уточнены патофизиологические механизмы, которые реализуются в возникновении и развитии атеросклеротического поражения с участием транс-сиалидазы, процессов воспаления в сосудистой стенке, половых гормонов и липопротеидов высокой плотности (ЛВП).
2. Представленные в работе клеточные модели позволяют адекватно воспроизводить важнейшие проявления атерогенеза и могут использоваться для создания эффективных препаратов природного происхождения с целью терапевтического воздействия на течение атеросклероза.
3. Транс-сиалидазная активность и ее подавление является перспективной мишенью для действия антиатеросклеротических средств. Метод определения транс-сиалидазной активности применен в ферментативной модели (тест-системе) для оценки эффективности и исследования механизмов антиатеросклеротического действия ППП.
4. Первичная культура макрофагов человека служит основой для клеточной модели с целью поиска источника фитоэстрогенов как альтернативы заместительной гормональной терапии для менопазуальных женщин.
5. Для создания препаратов ЛВП-терапии, вызывающих отток холестерина, целесообразно использовать первичные культуры субэндотелиальных клеток интимы аорты человека, полученные из атеросклеротических поражений.
6. Обнаруженная связь между инициирующими событиями атерогенеза и вовлечением в атерогенез воспаления и клеточного иммунитета позволяет рассматривать антицитокиновые средства как потенциальные антиатеросклеротические препараты. Для оценки противовоспалительных свойств таких препаратов может использоваться модель с измерением экспрессии провоспалительных молекул накопление липидов в культивируемых интимальных клетках аорты человека.
Реализация результатов работы. Разработаны рецептуры четырех препаратов и лабораторные регламенты получения этих препаратов.
Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов. Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики. Вся нормативная документация передана для производства ППП компании ООО «ИНАТ-Фарма».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции по биологически активным добавкам к пище, Красноярск, 20–22 июня 2001; 8-й научно-практической конференции по биологически активным добавкам РАЕН «Эффективность применения БАД в различных областях медицины», Москва, 21–23 мая 2002; X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: парафармацевтики, нутрицевтики, космецевтики» 2 декабря 2003, Москва; на 10-й научно-практической конференции «Эффективность применения БАД в практической медицине» в рамках международной выставки Здравоохранение-2003, декабрь 2003, Москва; научно-практической конференции «Человек и здоровье: применение биокорректоров», Москва, 22–23 ноября 2004; 17th International Conference on Environmental Bioindicators, Moscow, 18–22 May 2009; Международных научно-практических телеконференциях в 2010–2012 гг., Томск; 9-й Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» 22–23 апреля 2010, Санкт-Петербург, Россия; XVI International Symposium on Atherosclerosis, 25–29 march 2012, Sedney, Australia; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions, May 1–3, 2013, The Dolphin Hotel, Lake Buena Vista, Florida, USA; Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis: Possible Role of Stem cells and Osteoblasts. Cell Science & Stem Cell Research, 12–14 Nov 2012, San Antonio, USA и др.
Личное участие автора в выполнении исследования. Исследования выполнены на базе НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН и НИИ Атеросклероза Инновационного центра «Сколково». Автором был произведен обширный анализ отечественных и зарубежных работ по теме диссертации, планирование экспериментов. Автор явился инициатором и исполнителем основных разделов работы, что выразилось в руководстве и выполнении патофизиологических, биохимических, фармакологических исследований, проведении оценки эффективности препаратов и изучении их механизмов действия.
Публикации по теме диссертации. По результатам диссертационных исследований опубликовано 27 работ в отечественных и международных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК. Общее количество публикаций по теме диссертации, включая тезисы научных конференций, составляет 44. Автором также выпущены три монографии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 260 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав полученных результатов, обсуждения, выводов, списка литературы (450 источников), иллюстрируется таблицами и рисунками.
