Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 18
1.1. Патогенетические аспекты развития гриппа. Молекулярные детерминанты патогенности вирусов и их вклад в иммунопатогенез заболевания 18
1.2. Генетические факторы восприимчивости к инфекции: их связь с патогенезом и особенностями клинического течения инфекционных заболеваний 35
1.3. Заключение 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Общая характеристика клинического материала .58
2.2. Методы исследования 74
2.3. Методы статистической обработки результатов 79
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований .80
3.1. Показатели иммунитета при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 3.1.1. Продукция цитокинов при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 81
3.1.2. Показатели клеточного и гуморального иммунитета при гриппе A H1N1pdm09 у детей 87
3.2. Изменения в системе «оксиданты-антиоксиданты» при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 95
3.3. Исследование маркеров активации эндотелия при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 99
3.4. Изменение показателей, отражающих деградацию коллагена при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей
.104 3.5. Исследование генетических полиморфизмов генов цитокинов и молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия при различных вариантах течения гриппа A H1N1pdm09 у детей 110
3.5.1. Исследование генетических полиморфизмов генов цитокинов при неосложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 115
3.5.2. Исследование генетических полиморфизмов генов цитокинов при осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей
3.5.3. Исследование генетических полиморфизмов молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия при неосложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 146
3.5.4. Исследование генетических полиморфизмов молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия при осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей 149
3.6. Влияние полиморфизмов генов цитокинов на уровень продукции цитокинов у детей при различных вариантах течения гриппа A H1N1pdm09 153
3.7. Влияние полиморфизмов генов молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия на продукцию эндотелина и оксида азота у детей при различных вариантах течения гриппа A H1N1pdm09 161
3.8. Особенности иммунного реагирования и патогенетические аспекты развития гриппа A H1N1pdm09 у детей-носителей полиморфизмов генов цитокинов 164
3.8.1. Патогенетические механизмы развития гриппа A H1N1pdm09 у детей носителей полиморфизма TNF-308G A 165
3.8.2. Патогенетические механизмы развития гриппа A H1N1pdm09 у детей носителей полиморфизма IL-17A-197G A, IL-17F-161His Arg 175
3.8.3. Патогенетические механизмы развития гриппа A H1N1pdm09 у детей носителей полиморфизма IL4-589C T 185
3.8.4. Патогенетические механизмы развития гриппа A H1N1pdm09 у детей носителей полиморфизма СD14-159C T 188 3.8.5. Патогенетические механизмы развития гриппа A H1N1pdm09 у детей Результаты исследования расширяют имеющиеся сведения о патогенезе гриппа A HlNlpdm09 у детей. В работе раскрыты патогенетические закономерности тяжелого и осложненного вирусно-бактериальной пневмонией пандемического гриппа в детском возрасте, основанные на комплексном изучении иммунитета, про- и антиоксидантной активности сыворотки крови, маркеров активации эндотелия и деградации коллагена.
Установлены новые данные о распространенности полиморфизма генов цитокинов (TNF-a-308G A, IL-4-5890T, IL-10-1082G A, IL-10-592OA, IL-10-8190Т, IL-17A-197G A, IL-17F-161His Arg\ антигена дифференциации моноцитов (CD14-159C T) и молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия {EDNl-198Lys Asn, NOS3-7860T) у детей при различных клинических вариантах гриппа A HlNlpdm09. Носительство генотипа 308А/А гена TNFa, генотипа -819Т/Т и генотипа -1082А/А гена IL10, генотипа -197А/А гена IL17A, генотипа -161Arg/Arg гена IL17F, генотипа -198Asn/Asn гена EDN1 и генотипа -159С/С гена CD 14 является фактором риска развития тяжелых и осложненных форм пандемического гриппа. Выявленные генотипы вносят вклад в понимание механизмов противовирусной защиты, что позволит определять категории пациентов с высоким риском развития тяжелых и осложненных вирусно-бактериальной пневмонией форм гриппа A HlNlpdm09.
Разработаны новые модели прогнозирования тяжелого и осложненного вирусно-бактериальной пневмонией гриппа A HlNlpdm09 у детей. Определение показателей, отражающих деградацию коллагена (ММР-9, MMP-9/MMPTI) и цитокинов (TGF-1, IL-10, IL-4, IL-1, TNF-) при гриппе A HlNlpdm09 у детей позволит осуществлять персонализированный подход к ранней клинической диагностике тяжелого течения и развития пневмонии при пандемическом гриппе.
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2011 -поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержднными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Данное диссертационное исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «ЧГМА» от 18.09.2013г. протокол №55.
Работа основана на результатах комплексного обследования 278 детей в возрасте от 3-х мес. до 6 лет, распределенных в две клинические группы.
Основную клиническую группу составил 201 пациент с осложненным (n=87) и неосложненным (n=114) гриппом A H1N1pdm09. Пациенты основной клинической группы распределены в следующие группы:
Контрольную группу составили 200 практически здоровых детей в возрасте от 6 мес. до 6 лет. Формирование групп больных осуществляли в соответствии с классификацией гриппа у детей, предложенной В.Ф. Учайкиным (2001) [93], достоверных критериев пневмонии, предложенных А.Г. Чучалиным и соавт. (2011) [12] и модифицированной шкалой тяжести внебольничных пневмоний у взрослых (2007) [420].
В данной работе использовались лабораторные (генетические, биохимические, иммунологические) и статистические методы исследования.
Объектом для исследования являлась цельная кровь и ее сыворотка/плазма; забор материала осуществлялся однократно в 1-2 сутки госпитализации.
1. В патогенезе неосложненных форм гриппа А H1N1pdm09 у детей важное значение принадлежит активации Т-клеточного и гуморального звена иммунного ответа, а в развитии тяжелых и осложненных форм - супрессии клеточного и активации гуморального ответа. Содержание провоспалительных (IL-1, IL-18, TNF-), противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов и ростового фактора TGF-1 носит разнонаправленный характер и зависит от тяжести течения пандемического гриппа и его осложнений.
2. Изменения в системе «оксиданты-антиоксиданты», маркерах активации эндотелия (метаболиты оксида азота, фактор фон Виллебранда, эндотелин-1) и деградации коллагена (коллагенолитическая активность сыворотки крови, металлопротеазы 2, 9, тканевой ингибитор металлопротеаз) зависят от особенностей клинического течения гриппа А H1N1pdm09 у детей.
3. Наличие генотипа 308А/А гена TNFa, генотипа -819ТТ и генотипа -1082АА гена IL10, генотипа -197АА гена IL17A, генотипа -161Arg/Arg гена IL17F, генотипа -198Asn/Asn гена EDN1 и генотипа -159СС гена CD14 у детей играет ведущую роль в развитии тяжелого и осложненного вирусно-бактериальной пневмонией гриппа A HlNlpdm09. 4. Носительство генотипа -308А/A гена TNF-, генотипа -197А/A гена IL-17A, генотипа -159С/С гена CD14 и генотипа -819Т/Т гена IL10 у детей способствует индивидуализации патогенетических механизмов тяжелого и осложненного вирусно-бактериальной пневмонией гриппа A H1N1pdm09. Прогностическим фактором тяжелых форм гриппа A H1N1pdm09 у детей является уровень ММР-9, а развития осложненных форм пандемического гриппа - содержание TGF-1, IL-10, IL-4 и MMP-9/MMPTI.
Материалы исследований доложены на X юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа A H1N1» (Чита, 2011), IX, Х конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 2010, 2011), II, III, IV, V, VI Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Итоги эпидемии гриппа А/H1N1», посвященной закрытию Всероссийского фестиваля науки (Челябинск, 2011), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Болезни органов дыхания: от ребенка к взрослому» (Чита, 2012), XI конгрессе детских инфекционистов «Педиатрия и инфекции» (Москва, 2012), Региональной научно-практической конференции «Осложнения гриппа и ОРЗ в практике терапевта, тактика на амбулаторном этапе» (Санкт-Петербург, 2012), Всероссийском конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (Санкт-Петербург, 2012, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию
носителей полиморфизма IL10-819C T 195
3.9. Прогностическое значение изучаемых показателей в развитии тяжелых и осложненных форм гриппа A H1N1pdm09 у детей .203
3.9.1. Прогностическое значение изучаемых показателей в развитии тяжести течения гриппа A H1N1pdm09 у детей .203
3.9.2. Прогностическое значение изучаемых показателей в развитии пневмонии при гриппе A H1N1pdm09 у детей 206
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов .210
Заключение. 238
Выводы 241
Практические рекомендации 244
Список литературы
- Генетические факторы восприимчивости к инфекции: их связь с патогенезом и особенностями клинического течения инфекционных заболеваний
- Продукция цитокинов при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей
- Исследование генетических полиморфизмов генов цитокинов при осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей
- Прогностическое значение изучаемых показателей в развитии тяжести течения гриппа A H1N1pdm09 у детей
Генетические факторы восприимчивости к инфекции: их связь с патогенезом и особенностями клинического течения инфекционных заболеваний
В настоящее время приоритетным направлением в молекулярной медицине считается поиск генетических маркеров предрасположенности к хроническому, тяжелому и осложненному течению социально значимых вирусных и бактериальных инфекций [86]. Многочисленные клинические наблюдения за больными с инфекционными заболеваниями свидетельствуют о разнонаправленной реализации воспалительного ответа, который может существенно различаться по интенсивности и продолжительности: у одних больных, протекая более остро и агрессивно, а у других иметь подострое течение и затяжной характер патологического процесса. Поэтому поиск генетических маркеров, контролирующих ключевые звенья патогенеза при инфекционных заболеваниях, несомненно, является одной из актуальных и перспективных задач медицинской генетики. При этом инфекционные заболевания представляют наиболее удобную модель для изучения роли молекулярных особенностей макроорганизма в развитии патологического процесса, так как позволяют разграничить влияние этиологического агента инфекционного заболевания и молекулярно-генетических особенностей инфицированного [7, 19, 20, 29].
Как известно, индивидуальная восприимчивость организма к инфекции определяется совокупностью факторов (патогенность возбудителя, объем инфицирующего материала, реализация возбудителем механизмом ускользания от иммунного надзора и т.д.), однако ключевую роль в цепи патофизиологических событий играют индуцированные возбудителем эндогенные реакции, и первой линией реагирования являются система гемостаза и иммунитета. В значительной степени вариабельность ответа на воздействие патогена обусловлена полиморфизмом генов, детерминирующих ключевые реакции врожденного и приобретенного иммунитета. Считается, что своеобразной организующей системой, формирующей и регулирующей весь комплекс защитных реакций организма при внедрении патогенов служат цитокины [34]. В настоящее время активно ведется поиск генетических полиморфизмов генов цитокинов у пациентов с инфекционной патологией, в том числе и для определения цитокинопосредованной межклеточной коммуникации. Благодаря чему удалось установить, что у носителей полиморфных мутаций воспалительная реакция может сопровождаться различной продукцией цитокинов и, таким образом, обуславливать индивидуальные особенности течения инфекционного процесса и влиять на его исход [122, 139, 140, 247, 308, 323, 341, 402].
Но, несмотря на очевидный интерес специалистов к этой проблеме [181, 225, 236, 286, 299, 301, 304, 336, 350, 364, 442], остаются нерешенными вопросы, касающиеся предрасположенности и резистентности организма человека к вирусным инфекциям, приводящие к разным исходам встречи макроорганизма с инфекционным агентом (выздоровление, формирование грозных осложнений, летальный исход).
Проводимые в широком масштабе исследования полиморфизмов генов молекул, обеспечивающих ключевые реакции иммунитета, практически не коснулись изучения генетических полиморфизмов генов цитокинов и маркеров, характеризующих дисфункцию эндотелия при гриппе у детей. Как указывалось выше, разные штаммы вирусов гриппа человека обуславливают и разную степень патогенности, а также штамм-специфический иммунный ответ организма [35]. Молекулярные детерминанты патогенности вируса гриппа детально изучены в опытах in vitro [73, 107, 108, 249, 337, 375, 388], а также в сопоставлении с клинической картиной гриппозной инфекции у человека [11, 36, 314,349]. В то же время молекулярно-генетические особенности иммунного реагирования самого инфицированного вирусом гриппа, в том числе и штаммом A H1N1pdm09, изучены к настоящему времени не достаточно, в связи с чем их поиск представляет значительный интерес, как для клинической, так и для фундаментальной медицины.
Молекулярная медицина, являясь качественно новым разделом медицинской науки, сосредоточила крупномасштабные результаты исследований генома человека, результаты которых включены в базы данных 5641 значимых ассоциаций SNP-фенотипа с патологией человека [296]. Именно SNP (single-nucleotide polymorphism, SNP) используется в молекулярной медицине для ассоциаций с наиболее значимыми полигенными многофакторными болезнями человека, т.к. полиморфизм единичных нуклеотидов является частым изменением структуры генов [48, 75]. При этом необходимо помнить, что в отличие от моногенных наследственных заболеваний, которые развиваются у носителей аллелей в одном конкретном гене (муковисцидоз, фенилкетонурия и пр.), генетическая предрасположенность к полигенным заболеваниям связанна с наследованием определенных аллелей обычных «здоровых» генов. По этим причинам анализ генетических основ, обуславливающих индивидуальные реакции организма, представляет собой сложную задачу, заключающуюся в том, что генетическая предрасположенность определяет развитие заболеваний только на 20-40%, в остальном они обусловлены фенотипическими (средовыми, эпигенетическими) особенностями [46, 78].
Благодаря молекулярно-генетическим исследованиям стало возможным выделить группы генов (около 150 генов-кандидатов), ответственных за индивидуальную восприимчивость организма к инфекции, определяющих характер течения болезни, эффективность медикаментозной терапии и вероятность развития осложнений. Так, удалось определить генетические маркеры, связанные с SNP-локусами в генах хемокинов, HLA 1 класса, цитокинов, ферментов метаболизма, демонстрирующие убедительную связь с фенотипом многих инфекционных заболеваний (ВИЧ-инфекция, парентеральные вирусные гепатиты, лихорадка Денге, малярия, лепра, менингококковая инфекция, прионные болезни) и определяющие основные закономерности в виде восприимчивости и предрасположенности к инфекции, прогрессирования заболевания и развития осложнений [110, 214, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 246, 330, 419].
Гены-кандидаты, ответственные за индивидуальную восприимчивость организма к инфекции, условно объединяют в две основные группы. Первая группа генов кодирует белки, отвечающие за функционирование иммунной системы (интерфероны, интерлейкины, рецепторы распознавания, хемокины и пр.). К ним относят, в первую очередь, гены цитокинов (TNF-, IL-1, IL-10, TGF-), хемокинов и их рецепторов (CCR5, RANTES), гены неспецифической резистентности (IFNA, PKR, OAS1-3). Вторая группа генов чрезвычайно многообразна и кодирует ферменты и их регуляторы [86].
К настоящему моменту накоплены неоспоримые доказательства того, что инфекционный процесс сопровождается многоуровневой дезорганизацией иммунной системы [3, 65]. Особую роль в этом играют нарушения программированной гибели и межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток, функционирование последних может быть генетически детерминировано. На сегодня определено, что одним из ключевых механизмов, обуславливающих исход инфекционной патологии, является дисбаланс межклеточной кооперации, определяемый во многом состоянием системы цитокинов [25, 34]. В связи с чем, молекулярно-генетические механизмы дисбаланса цитокинопосредованных межклеточных взаимодействий при инфекционной патологии заслуживают особого внимания. Достижения в области молекулярной генетики позволили идентифицировать гены молекул цитокинов, продукты экспрессии которых оказывают непосредственное влияние на развитие инфекционного процесса, формирование осложнений и исходов (от стертого течения инфекции до хронизации).
Несмотря на широко представленные сведения в отечественной и зарубежной литературе о полиморфизме генов цитокинов и их роли в патологии человека, мы постараемся систематизировать имеющиеся данные применительно к патогенезу инфекционных заболеваний.
Как указывалось выше, цитокины являются важными составляющими иммунного ответа, регулирующего его интенсивность и длительность [34]. Примечательно, что эти показатели могут значительно варьировать у разных индивидов и коррелировать с функционально значимыми полиморфизмами цитокинов и тяжестью течения инфекции, т.е. аллельные варианты генов цитокинов могут модифицировать экспрессию или основные биологические функции синтезируемых веществ [16]. Различные паттерны экспрессии цитокиновых генов на уровне РНК и белка ассоциированы с физиологическими процессами, но могут обуславливать изменения интенсивности иммунного ответа. Известно, что синтез основных двух групп цитокинов - провоспалительных цитокинов и интерферонов 1-го типа (главным образом, IFN-/) начинается после взаимодействия TLR со структурными паттернами микроорганизмов и запуска внутриклеточного каскада передачи сигнала, приводящего к усилению функциональной активности лейкоцитов. Ключевым по значимости событием является синтез комплекса провоспалительных цитокинов из семейства IL-1, IL-6, TNF и хемокинов, стимулирующих дальнейшие механизмы в развитии воспалительной реакции и обеспечивающих активацию различных типов клеток (все типы лейкоцитов, дендритные клетки, Т- и В-лимфоциты, эпителиальные и эндотелиальные клетки, фибробласты и др.), участвующих в поддержании и регуляции воспаления. Это обеспечивает последовательные этапы развития воспалительной реакции с реализацией, первоначально, механизмов врожденного иммунитета, а в последующем, благодаря синтезу IL-12 дендритными клетками, реакций специфического иммунного ответа, связанных с распознаванием специфических антигенных структур микроорганизмов [34].
Продукция цитокинов при неосложненном и осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей
В качестве показателей, отражающих процесс деградации коллагена, как компонента внеклеточного матрикса, исследовали содержание матриксных металлопротеаз (ММР) и их специфического тканевого ингибитора (MMPTI), а также оценивали коллагенолитическую способность сыворотки (КАС), отражающую активность коллагеназоподобных протеаз и соответственно, протеолитическую деградацию фибриллярных белков соединительной ткани.
В ходе исследований установлено, что уровень ММР-2, ММР-9, MMPTI и показатель их соотношения отличались от группы здоровых лиц только у пациентов с тяжелым и среднетяжелым течением гриппа А H1N1pdm09 (табл.14).
Примечание: р - статистическая значимость различий с контролем; р1 -статистическая значимость различий с группой сравнения; р2 -статистическая значимость различий с группой при легком течении гриппа; р3 -статистическая значимость различий с группой при среднетяжелом течении гриппа.
В группе детей с сезонным гриппом, а также при легком течении пандемического гриппа уровень исследуемых металлопротеаз не только не отличался от группы здоровых детей, но и не нарушалось физиологическое отношение данных металлопротеаз к их специфическому ингибитору. Продукция ММР-2, ММР-9 у детей со среднетяжелой формой гриппа A H1N1pdm09 превышала показатели контроля и аналогичные показатели при сезонном гриппе в 2,4 и 2,3 раза, соответственно. Тогда как, тяжелое течение пандемического гриппа сопровождалось более высоким содержанием ММР-2, ММР-9, превышая показатели здоровых детей в 3,1 раза, а уровень больных с гриппом A H3N2 – в 2,8 раза (p=0,0001). При тяжелом течении гриппа A H1N1pdm09 значения ММР-2, ММР-9 превышали аналогичные показатели группы больных при среднетяжелом течении инфекции в 1,3 и 1,2 раза, соответственно. Кроме того, отмечено, что при тяжелом и среднетяжелом течении гриппа наблюдалась не только гиперпродукция металлопротеаз, но и нарушалось их физиологическое отношение с продукцией MMPTI по сравнению с контролем, группой сравнения и легким течением гриппа. Изменение данного равновесия возникало вследствие увеличения продукции MMPTI при среднетяжелых и тяжелых вариантах течения пандемического гриппа. Однако, между группами со среднетяжелыми и тяжелым течением пандемического гриппа статистическая разница в содержании ингибитора металлопротеаз не обнаружена. Вследствие чего, соотношение ММР 107
9/MMPTI между данными группами также не отличалось. Показатель отношения ММР-2/MMPTI при тяжелых формах гриппа превышал значения среднетяжелых его вариантов в силу регистрации максимального уровня ММР-2 у детей с тяжелым течением инфекции. Обнаружив изменение уровня металлопротеаз исключительно у детей при пандемическом гриппе в случае тяжелого и среднетяжелого его течения, мы прогнозировали выявить увеличение коллагенолитической активности сыворотки в этих же группах пациентов. Но, увеличение коллагенолитической активности сыворотки наблюдалась даже при легких вариантах течения пандемического гриппа. При этом, изменения этого показателя не наблюдались в группе сравнения – у больных сезонным гриппом (р=0,524). Величина коллагенолитической активности сыворотки повышалась по мере утяжеления клинических проявлений гриппа A H1N1pdm09 и ее отличия при разных вариантах течения инфекции показывали статистическую значимость.
Данные о содержанииММР-2, ММР-9, MMPTI и показатели КАС у больных с осложненным течением гриппа представлены в табл.15.
Уровень исследуемых металлопротеаз повышался во всех исследуемых нами группах больных с пневмонией относительно здоровых индивидуумов. При этом обнаружено, что если при пневмонии, этиологически не связанной с пандемическим гриппом, уровень ММР-2 и ММР-9 превышал контрольные значения в 1,8 и 2,5 раза, независимо от тяжести ее течения, то значения исследуемых металлопротеаз при осложненном гриппе A H1N1pdm09 превышали аналогичные показатели соответственно, в 3,4 и 4,1 раза. Причем, тяжелое течение пневмонии при пандемическом гриппе сопровождалось более значимым повышением уровня ММР-2 и ММР-9 не только по сравнению с контролем и группой сравнения, но и относительно детей с нетяжелыми формами пневмонии при гриппе A H1N1pdm09 (р=0,0001).
Значения ингибитора тканевых металлопротеаз повышались во всех исследуемых группах больных относительно группы контроля. Снижение уровня MMPTI отмечено у больных тяжелой пневмонией при гриппе A H1N1pdm09 относительно показателей при нетяжелом ее течении (р=0,0001). А сопоставление значения MMPTI у больных с тяжелой пневмонией, ассоциированной с гриппом A H1N1pdm09 и группы сравнения (тяжелая пневмония в постпандемический сезон) не выявило статистической разницы (р=0,584).
Повышение показателей соотношения ММР-2 и ММР-9 к MMPTI также отмечены во всех исследуемых группах больных с пневмонией. Однако соотношения ММР-2 и ММР-9 к MMPTI регистрировались на одинаковых значениях, независимо от тяжести пневмонии в постпандемический период. Максимальное повышение соотношений ММР-2 и ММР-9 к MMPTI отмечено у больных тяжелой пневмонией, ассоциированной с пандемическим гриппом, отличаясь от соответствующих значений больных при нетяжелом ее течении (р=0,0001). Кроме того, физиологическое соотношение уровня металлопротеаз к их специфическому ингибитору нарушалось при пневмонии, ассоциированной с гриппом и по отношению к группам сравнения, независимо от тяжести течения пневмонии.
В ходе проводимого исследования нас интересовали и возможные различия между содержанием изучаемых показателей в сыворотке крови у детей с неосложненным течением пандемического гриппа и при уже развившейся пневмонии. Нами зафиксировано, что различия всех исследуемых показателей у детей с тяжелой пневмонией при пандемическом гриппе значительно превышали аналогичные у детей при тяжелом гриппе (р=0,0001). Помимо этого, уровень ММР-2, ММР-9 у детей с тяжелым течением гриппа превышал таковые показатели у детей с пневмонией, этиологически не связанной с гриппом А H1N1pdm09, а MMPTI снижался у больных тяжелой пневмонией при гриппе по сравнению с тяжелым течением неосложненного гриппа.
Коллагенолитическая активность сыворотки возрастала по сравнению с контролем во всех исследуемых группах больных с пневмонией, независимо от тяжести течения и связи с вирусом пандемического гриппа. Максимальная ее активность, с увеличением в 2,1 раза по сравнению с контролем, зарегистрирована в группе больных при тяжелом течении пневмонии, ассоциированной с гриппом. При пневмонии в постпандемический период коллагенолитическая активность сыворотки не менялась у пациентов при разных вариантах течения патологического процесса (р=0,123). Тогда как при тяжелой пневмонии, ассоциированной с гриппом, показатели коллагенолитической активности сыворотки превышали в 1,2 раза соответствующие значения больных нетяжелой пневмонии. Статистические отличия выявлены в значениях коллагенолитической активности сыворотки в группах с различными вариантами течения пневмонии при гриппе, а также в сопоставлении с соответствующими группами сравнения.
Следовательно, изменение показателей, отражающих деградацию внеклеточного матрикса, выявлены при осложненном и неосложненном течении пандемического гриппа, даже в случае нетяжелого его течения.
Исследование генетических полиморфизмов генов цитокинов при осложненном гриппе A H1N1pdm09 у детей
В последнее время описаны аллельные полиморфизмы структурных генов, некодируемых участков - интронов, промотора, мутации которых изменяют экспрессию и количество кодируемого белка [34].
В связи с чем, нами изучено влияние полиморфизмов генов TNFa-308G A, IL4-5890T, IL10-592OA, IL10-819OT и IL10-1082G A на уровень продукции кодируемых цитокинов в здоровой популяции детей и при различных вариантах течения гриппа AHlNlpdm09.
При изучении влияния полиморфизма гена TNFa-308G A на уровень продукции TNF-a выявлено, что у здоровых лиц - носителей разных генотипов наблюдались достоверные различия в его экспрессии (табл.39).
Примечание: р - статистическая значимость различий между генотипами GG и GA; р! - статистическая значимость различий между генотипами GG и АА; р2 -статистическая значимость различий между генотипами GA и АА.
Здоровые носители генотипа -308GG демонстрировали достоверно низкий уровень секреции TNF- (34,3±4,6 пг/мл) относительно здоровых лиц с гетерозиготным генотипом -308GА гена TNF- (р=0,003).
Выявленные особенности разнонаправленной продукции TNF- у здоровых носителей разных генотипов полиморфизма гена TNFa-308G A распространялись и на всех исследуемых с гриппом A HlNlpdm09, независимо от тяжести и характера течения инфекционного процесса. У больных, являющиеся носителями генотипа -308GG гена TNF-, уровень экспрессируемого цитокина снижался в 1,3 раза относительно пациентов с гетерозиготным генотипом -308GА (р=0,0001). По мере нарастания тяжести клинических проявлений гриппа концентрация TNF- увеличивалась в сыворотке крови. Однако показатели этого цитокина у носителей генотипа -308GА всегда достоверно превышали аналогичные значения больных-носителей гомозиготного генотипа -308GG гена TNF-.
Генотип -308АА гена TNF- обнаруживался у больных только в случае тяжелого течения гриппа и развития осложненных его форм (в здоровой популяции детей данный генотип не обнаруживался). Отмечено, что именно в этих клинических группах исследуемых наблюдалась максимальная экспрессия TNF-. Так, при тяжелом течении гриппа у носителей генотипа -308АА гена TNF- содержание секретируемого цитокина повышалось в 1,4 раза относительно больных с этой же тяжестью течения инфекции, но являющихся носителями гомозиготного вариантом генотипа -308GА. Аналогично этому, среди носителей генотипа -308АА гена TNF- с клиническими проявлениями нетяжелой пневмонии, ассоциированной с вирусом гриппа A H1N1pdm09, уровень TNF- достоверно превышал соответствующие значения больных с генотипами -308GG и -308GА гена TNF-. Предельная экспрессия TNF- зарегистрирована среди пациентов-носителей генотипа -308АА гена TNF- при тяжелом течении пневмонии. В этом случае тестируемый уровень TNF- в сыворотке крови превышал в 3 раза аналогичные значения носителей генотипа -308GG и в 2 раза – носителей генотипа -308GА гена TNF-.
При исследовании роли полиморфизма гена IL4-589C Т в изменении секреции IL-4 в здоровой популяции выявлено, что достоверной разницы в уровне его экспрессии у лиц-носителей разных генотипов не наблюдалось (табл.40).
Примечание: р - статистическая значимость различий между генотипами CC и CT; р1 - статистическая значимость различий между генотипами CCи TT; р2 -статистическая значимость различий между генотипами CT и TT.
Подобно этому, не изменялась секреция IL-4 у больных-носителей разных генотипов полиморфизма гена IL4-589C Т при встрече с вирусом гриппа A H1N1pdm09, независимо от клинических вариантов ее исхода. Исключения из этого коснулись только группы больных с нетяжелыми формами пневмонии, ассоциированные с вирусом пандемического гриппа. В этой группе среди лиц-носителей генотипа -589ТТ концентрация IL-4 достоверно снижалась относительно больных с генотипами -589СС и -589СТ гена IL-4.
Учитывая отсутствие изменений в продукции IL-4 у носителей генотипа -589ТТ в других клинических группах (тяжелая пневмония при гриппе), а так же среди здоровых резидентов, выводы о снижении экспрессии данного цитокина при генотипе -589ТТ гена IL-4 преждевременны. Хотя, проводя молекулярно-генетический анализ полиморфизма гена IL4-589C Т, нами установлено повышение относительного риска развития пневмонии при гриппе у лиц-носителей генотипа -589ТТ гена IL-4. В данном случае остается непонятным влияние полиморфного варианта гена цитокина IL-4, вероятно увеличение числа наблюдений позволит внести ясность в эту ситуацию.
Разнонаправленная секреция IL-10 в сыворотке крови наблюдалась при различных вариантах генетических полиморфизмов его гена.
Здоровые носители СС и АА генотипов полиморфного локуса -592C A гена IL10 демонстрировали сходный уровень спонтанного выделения IL-10 (р=1,000) или приводили к достоверному уменьшению секреции IL-10 в 2 раза только клетками с генотипом -592СА (табл. 41).
Прогностическое значение изучаемых показателей в развитии тяжести течения гриппа A H1N1pdm09 у детей
Уровень матриксных металлопротеаз (MMP-9) у носителей генотипа -819СТ гена IL-10 достоверно уменьшался относительно генотипа -819СС (267,6±15,8 нг/мл; р=0,0001). Величины MMP-9 и MMP-2 уменьшались у носителей генотипа -819ТТ гена IL-10 относительно гетерозиготного генотипа. Содержание MMPTI увеличивалось при генотипе -819СТ гена IL-10 относительно гомозиготного генотипа -819СС и генотипа -819ТТ гена IL-10. Выявленное снижение уровня MMP-9 и ММР-2 у носителей генотипа -819ТТ гена IL-10 нивелировалось сопоставимым с генотипом -819СС показателем MMPTI, соответственно не обнаруживались изменения в их соотношении, чего не наблюдалось у носителей генотипа -819СТ гена IL-10. В этой группе изменялись физиологические соотношения между матриксными металлопротеазами и их ингибитором.
Уровень про- и антиоксидантной активности сыворотки крови у носителей разных генотипов полиморфизма -819C T гена IL10 у больных тяжелой пневмонией при пандемическом гриппе не изменялся.
Суммарная величина метаболитов оксида азота достоверно уменьшалась среди носителей генотипа -819ТТ гена IL-10 относительно генотипа -819СС (43,7 мкмоль/л; р=00001). Значение этого показателя не изменялось между группами с генотипами -819ТТ и -819СТ гена IL-10 (р=0,114).
Оценивая состояние клеточного иммунитета, установлено, что общее количество Т-клеток при гомозиготном генотипе -819ТТ гена IL-10 уменьшалось относительно генотипа -819СТ (р=0,011). Относительное содержание Т-хелперов с фенотипом CD3+CD4+ у лиц генотипом -819ТТ и -819СТ гена IL-10 уменьшалось только относительно генотипа -819СС гена IL-10. А сителотноьный уровень Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+CD8+ уменьшался при генотипе -819ТТ гена IL-10 по сравнению с генотипом -819СС (26%; р=0,012). Соотношение CD4+/CD8+ уменьшалось при генотипе -819ТТ гена IL-10 относительно других генотипов, составив 0,9 единиц. Рост популяции активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) отмечен у пациентов-носителей генотипа -819СТ гена IL-10 (4,9±1,2%; р=0,001). Общее относительное содержание В-клеток (CD3-CD19+) достоверно увеличивалось при генотипе -819ТТ гена IL-10 (34,8%; р=0,0001 и р=0,004, относительно генотипов -819СС и -819СТ). Содержание субпопуляции клеток, имеющих фенотип CD3+CD16+56+ (NKТ-клетки) CD3-CD16+56+ (NK-клетки) у носителей разных генотипов полиморфизма -819C T гена IL10 не менялось.
Гуморальный ответ характеризовался увеличением содержания иммуноглобулинов М и G у больных тяжелой пневмонией при гриппе у носителей генотипа -819ТТ относительно гомозиготного генотипа -819СС гена IL-10.
Таким образом, результаты наших исследований убедительно продемонстрировали роль генетического полиморфизма генов цитокинов в индивидуализации феномена общей воспалительной реакции, эндотелиальной дисфункции и иммунного реагирования при различных вариантах течения гриппа A H1N1pdm09 у детей.
Прогностическое значение изучаемых показателей в развитии тяжелых форм гриппа A H1N1pdm09 у детей В настоящее время общепринятыми критериями определения тяжести гриппозной инфекций в детском возрасте является выраженность симптомов интоксикации, степень патологический процесс других органов и систем (нервная, сердечно-сосудистая и пр.) [93]. Как правило, существующие классификации гриппа содержат исключительно клинические критерии, часть из которых носит субъективный характер, тем самым затрудняя объективную оценку степени тяжести течения инфекционного процесса. В связи с вышесказанным, определенный интерес представляет поиск расширенных клинико-лабораторных критериев для объективной оценки тяжести течения гриппаА H1N1pdm09 у детей.
Для решения поставленной задачи проведен многофакторный пошаговый регрессионный анализ. Связь данных анамнеза, клинических показателей, результатов лабораторного и инструментального обследования с тяжестью течения гриппа А H1N1pdm09 у детей оценивалась в регрессионной модели, включающей 87 показателей.
В оцениваемые показатели анамнеза включали указания на контакт с больным гриппом, факт предшествующей противовирусной терапии, сроки госпитализации от манифестации заболевания, наличие преморбидных состояний у детей раннего возраста (анемия, паратрофия, гипотрофия, тимомегалия и прочие), организованность детей. Клинику гриппа анализировали по следующим параметрам: степень повышения температуры тела и длительность температурной реакции, топика поражения респираторного тракта, вовлечение в патологический процесс других органов и систем, наличие признаков инфекционного токсикоза, нарушение сознания и пр. Витальные функции оценивались по частоте дыхательных движений (ЧД) и сердечно-сосудистых сокращений (ЧСС), величине систолического (САД) и диастолического артериального давления (ДАД), диурезу, показателям сатурации кислородом капиллярной крови (SpO2).
Лабораторная составляющая в регрессионной модели включала традиционные показатели общеклинического исследования периферической крови, биохимические параметры (аспартатаминотрансфераза – АСТ, лактатдегидрогеназа – ЛДГ, С-реактивный белок), коагулограммы, а также исследования уровней про- и противовоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-, IL-4, IL-10, IL-18, TGF-1), металлопротеаз (ММР-2, ММР-9), показателей дисфункции эндотелия (vWF, метаболиты оксида азота, эндотелин), коллагенолитической, про- и антиоксидантной активности сыворотки крови. Кроме того, регрессионная модель охватывала данные о наличии полиморфизма в генах цитокинов (TNF-a-308G A, IL-4-5890T, IL-10-1082G A, IL-10-5920А, IL-10-819OT, IL-17A-197G A, IL-17F-161His Arg), а также в генах эндотелина (EDNl-198Lys Asn), эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3-7860T) и мутации антигена дифференциации моноцитов CD14(CD14-159C T).
Результаты многофакторного пошагового регрессионного анализа показали, что наиболее близко связанным с тяжестью течения пандемического гриппа у пациентов детского возраста оказался уровень ММР-9 (шаг 1). Точность предсказания увеличивалась при добавлении данных о содержании в сыворотке крови АСТ (шаг 2), концентрации провоспалительного цитокина IL-i (шаг 3), фактора фон Виллебранда (шаг 4) и провоспалительного цитокина TNF- (шаг 5). При добавлении других показателей в дополнение к уже отобранным, нарастания значимой прогностической мощности не отмечалось (табл.55).
