Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 14
1.1.Состояние эндотоксикоза при терминальных состояниях 14
1.2. Роль микроциркуляторных нарушений в развитии эндотоксикоза при терминальных состояниях 22
1.3. Роль процессов свободнорадикального окисления в развитии 29
эндотоксикоза постреанимационного периода 29
1.4. Механизмы обезвреживания эндотоксинов в организме при терминальных состояниях 34
1.5. Роль углеводсодержащих полимеров соединительной ткани в патологии.
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 44
2.1.Общая характеристика материала и методы моделирования терминальных состояний 44
2.2. Биохимические методы исследования 48
2.3. Биофизические методы исследования 52
2.4. Морфологические методы исследования 52
2.5. Статистические методы исследования 53
ГЛАВА III. Собственные данные 54
3.1. Динамика восстановительных процессов у крыс после перенесенной клинической смерти при разных моделях умирания 54
3.2. Особенности умирания и течния постреанимационного периода после перенесенной кровопотери у собак 60
3.3. Оценка состояния эндотоксикоза постреанимационного периода при различных моделях умирания 64
3.4. Влияние перенесенной клинической смерти на содержание гормонов в остреанимационном периоде при различных моделях умирания у крыс
3.5. Цитокиновый профиль у крыс в постреанимационном периоде при различных моделях умирания 79
3.5.1. Цитокиновый дисбаланс в постреанимационном периоде после пережатия сосудисто-нервного пучка 79
3.5.2. Цитокиновый дисбаланс после перенесенной клинической смерти от острой кровопотери 82
3.6. Влияние перенесенной клинической смерти на процессы свободнорадикального окисления в постреанимационном периоде при различных моделях умирания у крыс 87
3.6.1. Влияние перенесенной клинической смерти на процессы свободнорадикального окисления в крови 87
3.6.2. Влияние перенесенной клинической смерти на процессы свободнорадикального окисления в тканях мозга крыс 91
3.6.3. Влияние перенесенной клинической смерти на процессы свободнорадикального окисления в печени крыс 95
3.6.4. Состояние процессов свободно- радикального окисления в почках в постреанимационном периоде 99
3.6.5. Динамика процессов свободно-радикального окисления в тканях глазного яблока в постреанимационном периоде на различных моделях умирания 103
3.6.6. Состояние процессов свободно-радикального окисления в тканях сердца в постреанимационном периоде при различных моделях умирания 105
3.6.7. Влияние перенесенной клинической смерти на процессы свободнорадикального окисления в тканях легких при различных моделях умирания 107
3.7. Состояние ферментов антирадикальной защиты в различные сроки постреанимационного периода 109
3.8.Особенности метаболизма восстановленного глутатиона в постреанимационном периоде у крыс при разных моделях умирания 125
3.9. Динамика содержания метаболитов оксида азота в постреанимационном периоде при различных моделях умирания 138
3.10. Динамика содержания углеводсодержащих биополимеров в постреанимационном периоде при различных моделях умирания 153
3.11. Морфофункциональная характеристика микроциркуляции органов в постреанимационном периоде 171
3.11.1 Морфометрическая характеристика микроциркуляции пиальной оболочки собак после клинической смерти 171
3.11.2 Морфофункциональная характеристика микроциркуляторной сети головного мозга при двух моделях умирания у крыс 182
3.11.3 Динамика морфофункциональных изменений миокарда в постреанимационном периоде при различных моделях умирания 187
3.11.4 Морфофункциональные изменения печени в постреанимационном периоде при двух моделях умирания 191
3.11.5 Морфофункциональная характеристика микроциркуляторных изменений брыжейки и кишечника в постишемическом периоде 199
3.11.6. Морфофункциональная характеристика почек в постреанимационном периоде при двух моделях умирания 204
3.11.7. Морфофункциональная характеристика легких в постреанимационном периоде при двух моделях умирания у крыс 212
ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов 221
Выводы 252
Список литературы
- Роль микроциркуляторных нарушений в развитии эндотоксикоза при терминальных состояниях
- Биофизические методы исследования
- Оценка состояния эндотоксикоза постреанимационного периода при различных моделях умирания
- Состояние ферментов антирадикальной защиты в различные сроки постреанимационного периода
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Со времен первого многоцентрового отчета о реанимированных пациентах, опубликованного в 1954 году, прошло более 50 лет, однако уровень внутрибольничной летальности среди этой группы пациентов практически не изменился, несмотря на новые стандарты лечения (Nadkarni V.M., Larkin G.L.,2006). Согласно данным Национального регистра по сердечно-легочной реанимации США (National Registry of Cardiopulmonary Resuscitation — NRCPR) доля умерших пациентов в лечебных учреждениях после успешно проведенной сердечно-легочной реанимации составляет 67% среди взрослых (19 819 человек) и 55% среди детей (524ребенка). Сопоставимые результаты приводят J.P. Nolan et al. (2007), J.E. Fugate et al. (2012). Среди наиболее распространенных причин госпитальной летальности рассматриваются поражения мозга, сердца, а также ишемически-реперфузионный ответ, ведущий к выраженным метаболическим нарушениям и формированию синдрома эндогенной интоксикации.
Клинике, патогенезу и лечению эндогенной интоксикации, в том числе в постреанимационном периоде, посвящено большое количество публикаций (Неговский В.А., 1986; Рябов Г.А. с соавт., 2002; Костюченко А.Л., 2004; Мороз В.В. и соавт., 2007; Долгих В.Т. и соавт., 2009; Bone R., 1996), однако в основном рассматривается эндотоксикоз в первые сутки после воздействия этиологического фактора. Исследователи, осуществляющие более длительный мониторинг постагрессивных состояний, выделяют вторую волну эндотоксинемии, в частности, при ожоговой болезни (Jeschke M.G., et al., 2004), при тяжелой черепно-мозговой травме (Епифанцев Н.Н. и соавт., 2008). В постреанимационном периоде ряд авторов тоже отмечали повторное ухудшение самочувствия пострадавших, выведенных из критического состояния (Заржецкий Ю.З. и соавт., 2003; Соколова Т.Ф. и соавт., 2006; Шаповалова В.В. и Семченко В.В. и соавт., 2008), однако механизм регистрируемых нарушений остается неясным.
Источники интоксикации при постагрессивных состояниях различного генеза однотипны: ишемизированные ткани c очагами деструкции, зоны естественной вегетации микрофлоры в организме. Пристальное внимание уделяется маркерам эндогенной интоксикации – веществам низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ), обладающим высокой биологической активностью, оказывающим негативное воздействие на деятельность органов и систем (Золотов А.Н. и соавт., 2003; Епифанцев Н.Н. и соавт., 2008; Долгих В.Т. и соавт., 2009; Куликова Н.Ю. и соавт., 2009). Однако длительный мониторинг их содержания после оживления не проводился. В развитии эндотоксикоза значительное место отводится процессам перекисного окисления липидов (ПОЛ), рассматривающимся в качестве возможных механизмов цитолиза, и, соответственно, усиления катаболических процессов. Кинетика ПОЛ в длительном постреанимационном периоде, временные, количественные и амплитудные характеристики этого процесса, а также степень вовлечения органов и тканей в процессы липопероксидации изучены недостаточно (Биленко М.В., 1989; Кашуро В.А. и соавт., 2006). В качестве дополнительного фактора формирования эндотоксикоза можно рассматривать микроциркуляторные нарушения, определяющиеся на протяжении длительного постреанимационного периода (Еникеев Д.А.и соавт., 2004). Сам эндотелий сосудов является структурой, активно секретирующей биологически активные субстанции и, в частности, цитокины. Дисрегуляция цитокинового баланса при критических состояниях вызывает синдром системного воспалительного ответа (Зильбер А.П., 2006) с развитием деструктивных процессов, что в еще большей степени усиливает эндотоксикоз и развитие полиорганной недостаточности (Левит Д.А., Лейдерман И.Н., 2006). Данных о влиянии про- и противовоспалительных цитокинов на динамику эндотоксинемии в постреанимационном периоде в литературе мы не обнаружили.
Эндогенная интоксикация усугубляется нарушением детоксикационных механизмов, которые, по данным Л.А. Тиунова (1995), включают в себя ряд взаимосвязанных реакций: биотрансформацию токсинов при участии цитохром Р-450 зависимых монооксигеназ, конъюгацию реактивных метаболитов и гидрофильных соединений и антиоксидантную защиту. Молекулярные механизмы расстройств детоксикационных процессов в постреанимационном периоде в литературе освещены недостаточно.
Приведенный круг нерешенных проблем определил актуальность, цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы. Установить наиболее общие закономерности формирования раннего и позднего эндотоксикоза постреанимационного периода в эксперименте.
Задачи исследования:
-
Выявить особенности умирания, оживления, течения постреанимационного периода на двух моделях умирания у крыс и смертельной кровопотере у собак.
-
Определить уровень эндотоксикоза по содержанию ВНиСММ и олигопептидов в крови на 1-е, 3-и, 5-, 7-, 10-, 14-, 21-, 28- и 35-е сутки постреанимационного периода на двух моделях умирания у крыс.
-
Оценить состояние гипофизарно-адренало-тиреоидной системы у крыс при двух моделях умирания и проанализировать сопряженность гормонального дисбаланса с выраженностью эндотоксикоза постреанимационного периода.
-
Изучить активность свободно-радикального окисления, перекисного окисления липидов, систем антиоксидантной защиты и определить их значимость в механизмах формирования эндотоксикоза после оживления у крыс.
-
Определить содержание про- и противовоспалительных цитокинов с последующей оценкой взаимосвязей с уровнем эндотоксинемии и динамикой постреанимационного периода у крыс на двух моделях умирания.
-
Оценить роль гликозаминогликанов, глутатиона в процессах детоксикации организма в постреанимационном периоде.
-
Оценить характер расстройств микроциркуляции после перенесенной клинической смерти у собак и крыс с оценкой сроков формирования ишемически-реперфузионных изменений внутренних органов.
-
На основе полученных данных сформулировать концепцию механизмов формирования раннего и позднего эндотоксикоза в динамке постреанимационного периода (35 суток).
Научная новизна. Впервые с использованием принципов системного анализа механизмов формирования и динамики эндотоксемии были установлены общие закономерности, несмотря на имеющуюся специфичность биохимических и структурных нарушений со стороны органов и тканей на различных моделях умирания. Были выявлены две волны усиления эндотоксикоза: в первые сутки и на 7-10-е сутки после оживления. Первичное усиление эндотоксемии обусловлено накоплением и выбросом при реперфузии ишемизированных тканей продуктов нарушенного метаболизма, свободно-радикального окисления и липопероксидации на фоне несостоятельности антирадикальной и антиоксидантной защиты, а также иммуновоспалительными реакциями. Вторая волна имеет причинно-следственные связи с развитием полиорганной недостаточности, расстройствами микроциркуляции, неполноценным восстановлением метаболических механизмов адаптационных процессов, дисбалансом гормонов, цитокинов. Периоды усиления эндотоксинемии сопровождаются расстройствами ориентировочно-исследовательской деятельности, выражающимися в значительном угнетении всех ее составляющих.
Получены новые данные об особенностях функционирования гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной системы в постреанимационном периоде. При первичном усилении эндотоксикоза отмечались дизрегуляторные процессы центрального генеза, проявляющиеся в снижении выработки ТТГ на фоне низких значений Т3 и Т4, причем при смертельной кровопотере падение ТТГ более длительное и глубокое, чем при пережатии сосудисто-нервного пучка. Аналогичные сдвиги гормонального профиля отмечаются и при вторичном усилении эндотоксинемии, но менее выражены по степени диссоциации и снижения концентрации гормонов в крови экспериментальных животных. Установлена фазность колебаний гормонов оси гипофиз-кора надпочечников, соответствующая динамике эндотоксинемии.
Впервые были выявлены молекулярные и клеточные механизмы нарушений окислительно-восстановительных процессов, неоднозначный характер динамики реакций свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты в длительном периоде после оживления (до 35-х суток). Метаболические последствия окислительного стресса характеризуются усилением процессов липопероксидации головного мозга, печени, почек, легких и сердца, синхронно с маркерами эндотоксинемии. В динамике постреанимационного периода животных, перенесших смертельную кровопотерю, выявлено относительное ограничение активности радикалообразования, что может быть обусловлено более значительными нарушениями микроциркуляции и процессов оксигенации тканей.
Получены новые данные, свидетельствующие о повышении выраженности системной воспалительной реакции при усилении эндотоксинемии. На высоте первичной волны эндотоксинемии установлено повышенное содержание провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6) на фоне падения содержания противовоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-1РА), за исключением ИЛ-4. Аналогичные изменения цитокинового профиля были зарегистрированы при вторичном увеличении уровня эндотоксинов в крови на 10-е сутки.
Впервые выявлен фазовый характер нарушений органной микроциркуляции в длительном постреанимационном периоде. В ранние сроки наблюдались выраженные нарушения микроциркуляции пиальных микрососудов, играющих основную роль в регулировании кровоснабжения головного мозга, однако в органах, принимающих активное участие в детоксикационных процессах (печень, легкие, кишечник, почки), также выявлялись расстройства тканевого кровообращения. Вторичное ухудшение процессов микроциркуляции, приводящее к изменению биохимических показателей, вновь отмечалось на 7-10-е сутки после оживления и предшествовало развитию органной дисфункции.
Впервые изучены молекулярные механизмы расстройства процессов конъюгации, участвующих в обезвреживании эндотоксинов. Было установлено угнетение реакций глутатионовой конъюгации, что подтверждалось низкими значениями глутатионтрансферразы сыворотки крови в течение всего периода после оживления. Изучение глюкуронидной конъюгации показало значительное повышение содержания ГАГ в органах, что не является свидетельством усиления процессов обезвреживания токсинов, а скорее является отражением процессов деградации межклеточного матрикса из-за ишемических повреждений, а в более поздние сроки отражением усиления процессов фиброза в гипоксически измененных органах. Установлена корреляция высоких концентраций ГАГ в крови с интегральным индексом интоксикации.
Научно-практическая значимость. Полученные при проведении исследования результаты свидетельствуют о многофакторном характере формирования эндотоксинемии, имеющей определенную динамику в постреанимационном периоде. Обнаруженные существенные изменения в показателях гормонов, ПОЛ, цитокинового профиля, микроциркуляции, а также в реакциях обезвреживания эндотоксинов определяют необходимость непрерывного динамического наблюдения за пострадавшими на протяжении первых двух недель после оживления.
Доказанное наличие эндогенной интоксикации после перенесенной реанимации, коррелирующее с тяжестью течения постреанимационного периода, независимо от механизмов умирания обосновывает необходимость лабораторного мониторирования маркеров эндотоксинемии, а также применения методов и средств детоксикации в комплексной терапии больных.
Выявление ведущих патогенетических факторов формирования ранней и поздней эндотоксинемии служит теоретической основой для совершенствования принципов и подходов в клинической практике с целью прогнозирования и своевременного предупреждения развития тяжелых осложнений на отдельных этапах реабилитации пациентов, перенесших критические состояния.
Положения, выносимые на защиту
-
В динамике эндотоксикоза постреанимационного периода независимо от причины умирания прослеживаются общие закономерности, выражающиеся в формировании двух волн усиления эндотоксемии: в первые трое суток и на 7 – 10-е сутки, обусловленные накоплением ВНиСММ в плазме крови и на эритроцитах преимущественно катаболического происхождения.
-
Расстройства неврологического статуса и ориентировочно-исследовательской деятельности крыс, сопровождающие течение всего постреанимационного периода, имеют наибольшую выраженность, совпадающую по времени с двумя волнами эндотоксинемии.
-
Фазное течение эндотоксинемии протекает на фоне нарушений функционирования гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной (надпочечниковой) систем дизрегуляторного центрального генеза, повторяющих динамику эндотоксинемии с периодами наибольшей выраженности на 1 – 3-и 7 – 10-е сутки.
-
Перенесенное терминальное состояние вызывает накопление продуктов перекисного окисления липидов в крови, головном мозге, сердце, легких, печени, почках, изменение уровня глутатиона и активности ферментов антиоксидантной защиты. Их направленность и выраженность определяются тяжестью течения постреанимационного периода и фазами усиления эндотоксинемии.
-
Периоды подъема эндотоксинемии коррелируют с повышением содержания провоспалительных цитокинов, отражающих течение системного воспалительного ответа, микроциркуляторными нарушениями, а также высоким содержанием ГАГ в крови, являющихся компонентом соединительной ткани и маркером деструктивных процессов, происходящих в ней.
-
Усилению эндотоксинемии постреанимационного периода способствуют нарушения детоксикационных механизмов в виде расстройств реакций глутатионовой и глюкуронидной конъюгации.
Внедрение результатов исследования в практику. Материалы диссертации используются в учебной (научно-исследовательской) работе кафедр патофизиологии, биохимии, нормальной физиологии, патологической анатомии, военной и экстремальной медицины, кафедры анестезиологии и реаниматологии Башкирского государственного медицинского университета; кафедр патологической физиологии и биологической химии Тюменской государственной медицинской академии.
Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях: на III интернациональном конгрессе по патофизиологии (Финляндия, 1998), Международном симпозиуме, посвященном 90-летию со дня рождения академика РАМН В.А. Неговского (Москва,1999), научно-практической конференции, посвященной 150-летию со дня рождения П.М. Альбицкого «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов» (Санкт-Петербург, 2003), конференции “Основные общепатологические и клинические закономерности развития критических, терминальных и постреанимационных состояний. Принципы их коррекции” (Москва, 2003), межрегиональных научно-практических конференциях «Актуальные вопросы патологии», «Типовые патологические процессы» (Уфа, 2004, 2005), 2-й Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Реаниматология – наука о критических состояниях» (Москва, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Критические и терминальные состояния, постреанимационная болезнь (патогенез, клиника, лечение)» (Москва, 2007), Российском симпозиуме с международным участием по патофизиологии и клинике экстремальных и терминальных состояний (Уфа, 2009), Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине (Омск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, в том числе 16 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 301 странице, содержит 53 таблицы и 85 рисунков. Список литературы включает 445 источников (294 отечественных авторов и 151 зарубежных).
Роль микроциркуляторных нарушений в развитии эндотоксикоза при терминальных состояниях
Определяющим патогенетическим механизмом эндотоксикоза различного генеза является генерализированное нарушение микроциркуляции [155]. По данным многочисленных авторов, тяжесть течения и исход экстремальных состояний во многом определяются степенью изменений в микроциркуляторном русле [3, 72, 95, 125, 173, 175, 379]. Значительный дефицит перфузии органов после тотальной ишемии, несмотря на стабилизацию артериального давления, разнонаправленные нарушения гемокоагуляции, проявления внутрисосудисто-го свертывания крови, а также длительное сохранение гипоксии смешанного генеза, являются звеньями сосудистого механизмама поражения органов [10, 92]. Развитие феномена "no-reflow"nocne реперфузии, при котором отмечаются мозаичное выключение кровотока в микроциркуляторном русле и диффузноочаговое некротическое повреждение нейронной сети является крайней степенью проявлений микроциркуляторных расстройств головного мозга [60, 238, 303]. Формирование феномена обусловлено повышенной проницаемостью микрососудов, отеком периваскулярной глии [314], повышением тромбогенно-сти и снижением тромборезистентности сосудов [36, 386, 399], нарушением функциональных свойств эндотелия сосудов [204], а также адгезией к эндотелию лейкоцитов [162].
В механизмах развития эндотоксикоза важнейшими являются генерализированное поражение эндотелия [15, 173] и нарушение регуляции системы гемостаза с преимущественной активацией коагуляционных механизмов на фоне угнетения системы естественных антикоагулянтов и системы фибринолиза [310]. Ранее эндотелий сосудов считался слоем клеток, отделяющим кровоток от прилежащих тканей, а в настоящее время эндотелиоцит рассматривается как мощная секреторная клетка, продуцирующая множество биоактивных веществ: цитокинов, сигнальных молекул управления, действующих на окружающие ткани, а также на клетки протекающей крови [346]. В условиях ауторегуляции медиаторы защиты действуют в ничтожно малых количествах, осуществляя местную воспалительную реакцию, а при критических состояниях на фоне дисре-гуляции возникает синдром системного воспалительного ответа [49, 87]. Однако деструктивные эффекты действия цитокинов начинают преобладать над гуморальными и нейроэндокринными агентами противовоспалительной фазы при лавинообразном нарастании уровня провоспалительных цитокинов за счет широкого круга активированных клеток [216, 384]. Известно, что биологическая активность цитокинов в отношении клеток-мишеней реализуется тремя путями: дистантным, подобно гормонам, паракринным, воздействующим на клетки, расположенные рядом, и аутокринным, действующим непосредственно на клетки, в которых они образовались. Такие цитокины, как ИЛ-1, ФНО-а, могут действовать всеми тремя путями. ФНО-а продуцируется эндотелием, фиброб-ластами и купферовскими клетками печени, стимулируя образование ИЛ-1, который может выделяться и непосредственно в ответ на различные факторы травмы. С данными цитокинами связан пато- и танатогенез всех критических состояний. Большинство исследователей [17, 174, 291, 331] определяют ФНО-а в качестве основного медиатора шока, а ИЛ-1 рассматривается в качестве основного кофактора ФНО-а. Результатом взаимодействия ФНО-а и ИЛ-1 с эндо-телиоцитами, нейтрофилами и макрофагами являются такие сосудистые события, как повышенная сосудистая проницаемость, адгезия нейтрофилов на эндотелии и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. Под влиянием ИЛ-1а и Р эндотелиальные клетки сосудов секретируют полипептиды, подобные тромбоцитарному фактору роста, которые могут вызывать освобождение сосудистых медиаторов воспаления, стимулировать клеточную миграцию и пролиферацию, а их повышенная концентрация может привести к ДВС-синдрому. ИЛ-1 тормозит реакцию гладкой мускулатуры на сосудосуживающие стимулы, вызывая характерную для шока гипотензию, предупредить которую можно, используя протективный протеин (BPI) нейтрофилов человека, связывающий эндотоксин и тем самым нейтрализующий продукцию цитокинов [304, 373]. Стойкие нарушения гемодинамики при критических состояниях обусловлены также стимуляцией ФНОа продукции N0 макрофагами и эндотелием по пути активации индуцибельной NOS. ФНОа так же, как ИЛ-1, усиливает адгезию нейтрофилов к сосудистой стенке и их миграцию в ткани при воспалении, увеличивая проницаемость мембран, метаболические и структурные повреждения самой эндотелиальной клетки. С развитием системной эндотели-альной дисфункции, лежащей в основе патогенеза синдрома ранней полиорганной недостаточности, исследователи связывают высокий уровень ИЛ-6 [310].
Анализ литературных источников подтверждает высокий интерес исследователей к изучению роли цитокинов в патогенезе гемодинамических нарушений и повреждении клеток при экстремальных воздействиях [98, 133, 228, 301, 333, 396]. В динамике патологических процессов для оценки тяжести и прогноза заболевания целесообразно проводить совместное определение содержания как про-, так и противовоспалительных цитокинов[100]. В клинических исследованиях рост концентрации ФНО-а прямо коррелирует с тяжестью шокового процесса [348]. Значительное повышение уровней ИЛ-1 и ФНО-а наблюдается у больных с массивной хирургической травмой, что, по мнению авторов, может служить прогностическим критерием развития осложнений [301]. ФНО-а играет ключевую роль в развитии повреждений легких после кровопотери из-за нарушений внутрисосудистой гемодинамики [320], а применение анти-ФНО-а антител уменьшает уровень матричной РНК (м-РНК) ИЛ-1(3, ИЛ-6, ИЛ-10, хотя м-РНК ФНО-а не снижалась. На фоне использования анти-ФНО-а антител уменьшаются внутриальвеолярные кровоизлияния и повреждения паренхимы легких в основном вследствие улучшения внутрисосудистой проходимости. В качестве органа-мишени цитокиновой агрессии при критических состояниях наряду с легкими рассматривается кишечник. Через час после 30% кровопотери повышенный уровень ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-1(3 и ИЛ-5 обнаружен в легочных мононуклеарах и через 4 часа в мезенте-риальных лимфоузлах, что приводит к повреждению легких и кишечника. В повышении проницаемости кишечного барьера существенную роль играет также ИЛ-6 [363]. Цитокины ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8 участвуют в регуляции сердечной деятельности при критических состояниях [317].
В более поздние сроки постагрессивных состояний происходит избыточная продукция медиаторов противовоспалительной фазы из-за грубой дисрегу-ляции иммунных процессов, что существенно снижает способность моноцитов вырабатывать ФНО-а и ИЛ-6 в ответ на продолжающиеся катаболические процессы, поступление микробных токсинов в кровоток с развитием иммунодефи-цитного состояния и присоединением тяжелой суперинфекции [66]. Степень иммунной дисфункции зависит от глубины органной и клеточной гипоксии, объемов кровопотери и гемотрансфузии, тяжести полученного повреждения, а также состояния регуляторных цитокинов [75, 140, 230].
Биофизические методы исследования
В основе экспериментальной работы лежали хронические (5 недель) патофизиологические эксперименты на 910 беспородных половозрелых крысах-самцах. Клиническая смерть моделировалась путем пережатия сосудисто-нервного пучка (первая группа) и воспроизведением острой смертельной кро-вопотери (вторая группа), с последующим оживлением. В отдельной группе использовались собаки (51 животное), у которых изучались особенности микроциркуляции головного мозга в постреанимационном периоде после острой кровопотери. Все эксперименты проводились в соответствии с нормативными документами, регламентирующими гуманное обращение с животными (Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977, «Европейская конвенция по защите позвоночных животных», Страсбург, 1985).
Содержание животных осуществлялось при комнатной температуре воздуха 18-24 С в условиях вивария при соблюдении стандартного рациона и свободного доступа к воде. В эксперимент отбирали внешне здоровых животных, прекращая дачу пищи за сутки до опыта без ограничения потребления воды. Острая остановка кровообращения воспроизведена по методике [130] на 450 крысах-самцах массой 180-200 г. под общим эфирным наркозом. Пережатие сосудистого пучка проводилось специальным Г-образным крючком, который вводился справа по парастернальной линии на уровне второго межреберья в грудную полость. При данном методе прижимались к грудине нижняя полая, безымянные, легочные вены, легочная артерия, а также аорта. Хотя трахея не пережималась, кровообращение прекращалось полностью в венозной и артериальной системах, поэтому началом клинической смерти считали момент пережатия сосудистого пучка. Извлечение крючка из грудной клетки выполнялось через 3 мин, после чего проводилась интубация трахеи, а через 6-7 минут с момента пережатия начинали реанимационные мероприятия: наружный массаж сердца ударами указательного пальца по грудине на уровне четвертого межреберья с частотой 200 ударов в минуту и искусственная вентиляция. ИВЛ проводилась при помощи аппарата, создающего активный вдох с частотой 35-40 вдохов в минуту из расчета 1-1,5 мл воздуха на 100 г массы тела.
Сигналом к прекращению аппаратного дыхания являлось появление и стабилизация самостоятельного дыхания. При оживлении регистрировалось время появления сердечной деятельности, первого вдоха, роговичных рефлексов.
В другой группе (460 крыс) использовалась модель острой смертельной кровопотери. После обезболивания (внутримышечное введение кетамина в дозе 0,25 мл на 100 г. массы и дополнительная дача эфирного наркоза) препарировалась левая сонная артерия, фиксировалась поливиниловая канюля и вводился гепарин (5000 ЕД в 1 мл) отечественного производства, разведенный 1:10 физиологическим раствором. Обескровливание начиналось через 5 минут, выполнялось при помощи шприца, создающего небольшое отрицательное давление, до наступления клинической смерти, временем начала которой считался последний вдох. К реанимации приступали через 5 минут, нагнетая кровь внутри-артериально с помощью шприца. Вентиляция легких проводилась, как и в первой группе. После восстановления самостоятельного дыхания удаляли канюлю и, перевязав сосуд, зашивали рану. В эксперименте фиксировали длительность умирания, клинической смерти, а также время восстановления жизненных функций.
Динамика общего состояния животных оценивалась на протяжении 5 недель в обеих группах с использованием балльной оценки восстановления неврологического статуса (таб. 1) по методу [97, 152]. Исследование ВНД велось по уровню ориентировочно-исследовательской активности и эмоционально-психических реакций (тест «открытое поле»). Для количественной оценки неврологического статуса крыс использовался показатель, представляющий сумму баллов на момент исследования. Тяжелым состояние считалось при уровне в 90-130 баллов, средней тяжести - при 60-90 баллах, легкой степени - менее 60 баллов.
Тонус мышц верхних конечностей (D+S) отсутствует 6+6 нормальный 0 23 Экзофтальм 10 повышенный 2+2 нет пониженный 2+2 есть отсутствует 4+4 24 Зрение Судороги есть отсутствуют 0 нет клонические 2 25 Характер сердцебиения 11 тонические 6 нормальное Поддержание темп гомеостаза учащенное удовл (35,5 - 37 5) 0 замедленное гипертермия ( 37,5) 2 остановка 6 12 гипотермия ( 35,5) 4 26 Характер дыхания Патопогические самопроизвольные движе- нормальное учащенное ния в конечн замедленное или с нет 0 участием вспомог 13 есть 4 мускулатуры апноэ Сумма бачлов 4 DJ-S - активность рефпексов спрва и счева, груминг - рефчекс умывания
В группе собак в качестве модели умирания воспроизводилась острая одномоментная кровопотеря с последующим оживлением аутогенной кровью по комплексной методике [181]. В группе собак в качестве модели клинической смерти воспроизводилась острая одномоментная кровопотеря с последующим оживлением аутогенной кровью по комплексной методике [181]. За сутки до эксперимента прекращалась дача пищи без ограничения доступа к воде. В качестве обезболивания применялся внутримышечно кетамин из расчета 8-13 мг/кг массы тела, а препарирование сосудов проводилось под местной анестезией 0,25% раствором новокаина. После канюлирования бедренных артерий и вен через правую бедренную артерию регистрировалось артериальное давление с помощью ртутного манометра, а через левую - осуществлялось кровопускание и затем, центрипетальное нагнетание крови. Левую бедренную вену применяли для внутривенного нагнетания. Объем кровопотери рассчитывался по отношению к массе тела в миллилитрах, кровь стабилизировалась 4% раствором гепарина "Биохеми" ( 250-300 Ед/кг). За начало клинической смерти принимался момент последнего вдоха, после чего осуществляли ритмичное внутриартери-альное нагнетание аутогенной крови под давлением 110-120 мм. рт. ст. до восстановления работы сердца, а последующее восполнение кровопотери велось внутривенно под давлением 10-15 мм рт. ст. С началом мероприятий по оживлению до стабилизации самостоятельного дыхания проводилась аппаратная ИЛВ с частотой 25-35 вдохов в минуту из расчета 40-50 мл воздуха на 1 кг массы тела. В ходе эксперимента регистрировали уровнь АД, объема смертельной кровопотери, времени угасания и появления дыхания, сердечной деятельности, роговичных рефлексов, биоэлектрической активности головного мозга. При нарушении работы сердца и дыхания применялись камфара, сульфокамфокаин с рассчетом доз согласно указаниям [137].
Последующий мониторинг состояния животных проводился в течение 35 суток с оценкой неврологического статуса по модифицированным таблицам A.M. Гурвич и соавт., (1979), приведенных в таблице 2. Удовлетворительное состояние констатировалось при сумме боллов от 0 до 15, относительно удовлетворительное от 16 до 30, средней тяжести от 31 до 45, тяжелое от 46 до 60 баллов, крайне тяжелое от бідо 75 и терминальное от 76 баллов и выше. Оценка состояния животных и забой осуществлялся на 1-е, 3-й, 7-, 10-, 14-, 21-, 28-, 35-е сутки по балльной системе.
Оценка состояния эндотоксикоза постреанимационного периода при различных моделях умирания
Данная область складывается из полос поглощения продуктов обмена пу-риновых азотистых оснований, что, вероятно, может быть обусловлено либо их повышенным выходом в кровь, либо уменьшением их экскреции с мочой. О справедливости данного предположения говорит тот факт, что катаболический пул был увеличен в данной группе животных во все сроки наблюдения, что обусловлено гипоксическими повреждениями органов и тканей, так же как и в модели ПСНП. Профиль спектрограммы супернатанта после осаждения эрит-роцитарной массы в основном не отличался от контрольной группы.
Таким образом, в модели умирания от СК уровень ВНиСММпл и ВНиС-ММэр, индекс интоксикации на протяжении всего периода наблюдения был выше контроля и, так же, как и в модели ПСНП отмечалось 2 волны более выраженного подъема,- в первые трое суток и на 7 -10-е сутки. Показатели спектрограммы и показатели катаболического пула свидетельствуют о катаболиче-ском происхождении данных молекул.
В целом, несмотря на различные модели умирания, динамика эндотокси-коза постреанимационного периода аналогична, что свидетельствует о наличии общебиологических механизмов выхода организма из постагрессивных состояний, имеющих свою динамику, свои временные рамки
Тиреоидные гормоны - тироксин и трийодтиронин - определяют основной обмен в организме, действуют на рецепторы клеточного ядра, изменяя скорость транскрипции РНК и, соответственно, влияют на синтез различных белков. Гормоны щитовидной железы увеличивают число и размеры митохондрий и активность ферментов дыхательной цепи, оказывают непосредственное влияние на транспортные механизмы мембран [286]. Поскольку тиреоидные гормоны, стимулируя окислительно-восстановительные процессы, являются мощными регуляторами адаптационных реакций, представляется важным исследование состояния гипофизарно-тиреоидной системы при эндотоксикозе постреанимационного периода.
Как показали наши эксперименты, состояние гормонального профиля в постреанимационном периоде при умирании от ПСНП свидетельствует о значимом снижении выработки ТТГ практически во все сроки после оживления, за исключением 5-х суток, когда уровень ТТГ имел тенденцию к повышению. Достоверным снижение было в 1 -е сутки на 40% (р=0,0494), а также начиная с 10-х суток и до конца периода наблюдения (табл. 8). Этот же показатель в группе после СК был ниже уровня контроля во все сроки наблюдения, причем на 5-е и 7-е сутки он составлял лишь 20% от уровня контроля (табл. 9). Поскольку данный гормон вырабатывается по принципу обратной связи, в зависимости от содержания гормонов щитовидной железы в крови, было бы логичным наблюдать высокие значения гормонов ТЗ и Т4. Однако исследование гормонального профиля щитовидной железы показало совершенно иную динамику.
Содержание Т406Щ в группе после СК (табл. 9) до 5-х суток сохранялось на уровне контроля, а его свободной фракции до 14-х суток после оживления было ниже контрольных величин. В группе после ПСНП, напротив, содержание и свободной и общей фракции тироксина превышало данные контрольных значений (табл. 8). Таблица 8. Содержание гипофизарно-тиреоидных гормонов в постреанимаци онном периоде после ПСНП Me [25%75] (п=Т0).
Так как содержание тироксина отражает в основном гормоносинтези рующую функцию щитовидной железы, данные показатели свидетельствуют о нарушениях функциональной активности щитовидной железы в постреанимационном периоде, особенно в группе после перенесенной СК. Таблица 9. Содержание гипофизарно-тиреоидных гормонов в постреанимаци онном периоде после СК Me [25%75] (п=10) .
В постреанимационном периоде развиваются выраженные гемодинами-ческие нарушения, изменяющие функциональную активность наиболее зависимых от состояния кровотока органов и систем. Щитовидная железа имеет интенсивное кровообращение, соответствующее по интенсивности почечному кровотоку, в связи, с чем в условиях нарушенной микроциркуляции после реанимации развивается ее. Кроме того, скорость образования тиреоидных гормонов определяется процессом транспорта тироглобулина, при этом перенос ТЗ и Т4 является энергозависимым процессом и определяется доступностью АТФ [243]. В условиях гипоксии смешанного генеза после оживления имеется и дефицит энергетических субстратов.
Уровень ТЗ отличался при различных моделях умирания. Как общая, так и свободная фракции данного гормона в группе после СК имели тенденцию к снижению вплоть до 21-х суток, а на 3-й сутки были достоверно ниже контроля на 39,8% (р=0,0233) и на 33,3% (р=0,0211) соответственно. В группе же после ПСНП содержание общей и свободной фракций гормона лишь на 5-е и 7-е сутки после оживления были ниже исходных значений, а в остальные сроки либо приближались к контролю, либо превышали его. Если Т4 и образуется преимущественно в щитовидной железе, то тиреоидный синтез ТЗ составляет лишь 20% от общего количества этого гормона. Преимущественное образование ТЗ происходит в результате монодейодирования Т4 в периферических тканях [80]. ТЗ и Т4 вызывают качественно одни и те же изменения метаболизма и активности клеток. Но биологически активным является ТЗ, так как для реализации эффектов Т4 требуется в 10 раз большая его концентрация и значительно больше времени. Выявленное в ходе исследования снижение ТЗ на фоне повышенного Т4 показывает нарушение метаболических превращений в результате ухудшения микроциркуляции и формирования энергодефицита. Развитие гипотиреоза при терминальных состояниях относится большинством авторов к неблагоприятному течению постреанимационной патологии [45, 289].
Таким образом, постреанимационный период независимо от причины умирания сопровождается выраженными расстройствами эндокринной регуляции. При СК обращает внимание снижение общей и свободной фракций гормона ТЗ и свободной фракции гормона Т4 до 5-х суток. На этом фоне остаются низкими и значения ТТГ, что свидетельствует о дизрегуляторных процессах центрального генеза. В группе после перенесенной клинической смерти от ПСНП в 1-е и 3-й сутки центральная регуляция функции щитовидной железы сохраняется, однако к 5-7 суткам отмечается угнетение, а к 10-м суткам резкий всплеск - выработки гормонов щитовидной железы.
Состояние ферментов антирадикальной защиты в различные сроки постреанимационного периода
Следовательно, активность глутатионпероксидазы была угнетена при обеих моделях умирания практически во все сроки, что существенно снижало антиоксидантный потенциал крови после оживления.
Исследование показателей общей антиоксидантной активности (ОАА) в течение постреанимационного периода после ПСНП показало резкое их угнетение во все сроки (табл.33). Достоверное понижение наблюдалось на 1-е сутки - на 41,7%) (р=0,0002), затем показатели несколько повысились, но оставались достоверно ниже исходных: на 3-й сутки после клинической смерти - на 37,4% (р=0,0002) и на 5-е сутки - на 41,7% (р=0,0002). В дальнейшие периоды подобная динамика сохранялась. На 14-е сутки падение было еще более выраженным - 48,8% (р=0,002), затем показатель несколько повысился, но даже к концу периода наблюдения определялось значимое понижение значений на 28,6% (р=0,0009) от контроля.
Изменения показателей ОАА после клинической смерти вследствие кро-вопотери были аналогичными (табл. 33). Во все сроки наблюдения данный показатель был достоверно ниже контроля: на 1-е сутки на 37,7% (р=0,0002), к 3-м суткам на 28,5% (р=0,0007) и в последующие сроки наблюдалось снижение антиоксидантной активности на 20-30% в сравнении с контролем. Нормализации ОАА не произошло и к концу периода наблюдения. На 35-е сутки его значения были на 21,7%) (р=0,0052) ниже уровня контроля.
Глутатион выполняет в организме млекопитающих многообразные и очень важные функции: защищает от активных форм кислорода, участвует в метаболизме чужеродных соединений; повышает резистентность клеток к вредным воздействиям; влияет на биосинтез нуклеиновых кислот, белков и пролиферацию клеток; модулирует геномные эффекты стероидных гормонов; восстанавливает и изомеризует дисульфидные связи; поддерживает функции мембран; изменяет активность ферментов и других белков; выполняет кофер-ментные функции; участвует в обмене эйкозаноидов, предотвращает преждевременное старение [136, 417]. Практически все перечисленные процессы в той или иной степени вовлечены в ответ на образование в организме эндотоксинов, продуктов извращенного обмена веществ из-за гипоксических и реперфузион-ных нарушений, процессов катаболического распада тканей. Изменения их взаимодействия с системой глутатиона могут предопределять направленность и исход патологического процесса. Приведенные сведения убедительно демонстрируют необходимость оценки состояния системы глутатиона в постреанимационном периоде, в связи, с чем нами было предпринято исследование содержания уровня восстановленного глутатиона (GSH).
Уровень восстановленного глутатиона в ткани мозга животных, перенесших клиническую смерть от ПСНП, достоверно снижался в 1-е - 3-й сутки эксперимента (табл. 34). В последующие 5 - 28-е сутки содержание восстановленного глутатиона сохранялось приблизительно на одном уровне - на 40-50% ниже контрольного (различия достоверны), и лишь в конце эксперимента несколько повышалось, приближаясь к исходным значениям.
У животных, перенесших СК, динамика изменений показателя была несколько отличной (табл.34). Достоверно низкие значения отмечались при первой волне эндотоксинемии - на 1-е сутки, составляя лишь 27,1 % от уровня контроля (р=0,0156). Второе значимое снижение произошло на второй волне эндотоксинемии, причем на 7-е сутки падение составило 47,9% (р=0,0007), а на 10-е- 59,3% (р=0,0073).
Последующее снижение в содержании G-SH было отмечено в более поздние сроки, оно составило на 21-е сутки 63,6%» (р=0,0003), на 28-е сутки -54,3% (р=0,0113), а к концу периода наблюдения содержание G-SH даже несколько превышало исходные значения.
Сравнительная оценка содержания восстановленного глутатиона между группами показала (рис. 20), что в постреанимационном периоде после ПСНП содержание данного показателя достоверно ниже в периоды между подъемами эндотоксинемии. Это свидетельствует о его интенсивном расходовании на конъюгацию с токсическими метаболитами, также на переход в окисленную
Таким образом, если в группе ПСНП снижение содержания восстановленного глутатиона было достоверным практически во все сроки наблюдения, за исключением 35-х суток, то в группе СК четко регистрировалась фазность изменений, проявляющаяся в достоверном снижении уровня изучаемого метаболита как при первой волне эндотоксинемия, так и при второй. Подобная динамика может объясняться активным участием восстановленного глутатиона в процессах детоксикации, которые были, по всей видимости, эффективными, так как показатели эндотоксинемии после периодов подъема шли на спад.
В ткани сердца у крыс после ПСНП на протяжении длительного постреанимационного периода не наблюдалось нормализации содержания восстановленного глутатиона (табл.35). Так, на 1-е сутки отмечалось достоверное снижение показателя до 42,8% (р=0,0041), затем на 3-й сутки произошло достоверное его увеличение на 50,0% (р=0,0140). На 7-10-е сутки уровень его вновь достоверно снижался в сравнении с контролем на 51,1% (р=0,0211) и 46,2% (р=0,0025) соответственно. На 21-е и 28-е сутки содержание восстановленного
