Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о роли эозинофильных гранулоцитов в развитии инфекционно-аллергического воспаления 13
1.1. Основные закономерности регуляции эозинофилопоэза в здоровом организме 13
1.2. Эволюция представлений о механизмах развития эозинофилий 23
1.3. Роль эозинофилов в развитии аллергических реакций 27
1.4 Роль эозинофилов в антипаразитарном иммунитете 32
Глава 2. Материал и методы исследования 34
2.1. Контингент обследованных 34
2.2.Методы исследования 37
Глава 3. Патофизиологические механизмы изменения цитоморфологического своеобразия и функционального состояния эозинофилов при эозинофилиях различного генеза 54
3.1. Активность эозинофилопоэза у взрослых и детей в зависимости от патофизиологического механизма эозинофилий 54
3.2. Морфологическое состояние эозинофильных гранулоцитов у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом различных возрастных групп 60
3.3. Закономерности изменения оптической плотности цитоплазмы эозинофилов в зависимости от генеза эозинофилии и возраста больных 66
3.4. Взаимосвязь морфологических и функциональных характеристик эозинофилов периферической крови взрослых и детей при эозинофилиях различного генеза 71
3.5. Механизм изменения морфофункциональных свойств эозинофилов в зависимости от степени выраженности эозинофилии 75
3.6. Анализ взаимосвязи морфофункциональных показателей эозинофилов периферической крови с механизмом развития эозинофилии у больных 84
3.7. Прогностические критерии развития патофизиологического механизма эозинофилии при амброзийном поллинозе и глистной инвазии 95
Заключение 105
Выводы 114
Список литературы 116
- Эволюция представлений о механизмах развития эозинофилий
- Роль эозинофилов в антипаразитарном иммунитете
- Морфологическое состояние эозинофильных гранулоцитов у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом различных возрастных групп
- Взаимосвязь морфологических и функциональных характеристик эозинофилов периферической крови взрослых и детей при эозинофилиях различного генеза
Введение к работе
Актуальность темы. Механизм инфекционно-аллергического воспаления является патогенетической основой многих социально значимых заболеваний современного общества. К ним относятся гельминтозы и аллергические заболевания.
Согласно данным официальной статистике, в нашей стране, аллергическими заболеваниями страдают от 15 до 20% населения. При этом на Северном Кавказе число больных достигает около 18% (Горячкина Л.А., 2011). За последние годы заболеваемость поллинозом у детей увеличилась в пять раз (Базанова Г.А., 2009). Изучение поллинозов приобретает особенно большое значение в связи с увеличивающимися масштабами озеленения городов, а также создания больших зон лесопарков, газонов и бульваров.
Другими, не менее социально значимыми заболеваниями, являются глистные инвазии. По данным крупномасштабных эпидемиологических исследований токсокароз является одним из распространенных тканевых гельминтозов. Высокая зараженность почвы яйцами собачей аскариды, теплый влажный климат делает эту проблему актуальной для Ставропольского края (Солдатова М.В., 2007).
Стойкая эозинофилия является постоянным показателем развития как аллергических заболеваний так и инвазирования организма. Изменения в эозинофильных гранулоцитах, возникающие в условиях развития заболевания, выражаются изменениями цитохимического состава клеток и их дегрануляцией (Новицкий В.В., 2006). Необходимо учитывать, что при обычных методах исследования невозможно оценить модификацию поверхности мембраны и оптических характеристик эозинофилов.
В доступной нам научной литературе не найдено четкой информации о зависимости морфофункционального состояния иммунокомпетентной клетки - эозинофила с развитием и течением эозинофилий различного генеза. Благодаря разнообразию исследований в лабораторной диагностике и внедрению новейших методов, появилась возможность глубокого изучения морфофункциональных особенностей эозинофильных гранулоцитов периферической крови с помощью методов компьютерной морфометрии эозинофилов и сканирующей зондовой микроскопии. В соответствии, с вышеизложенным, исследование количественных, морфометрических, оптических и функциональных особенностей эозинофилов имеет практический и теоретический интерес, что и определило цель и задачи исследования. Цель исследования: Изучение особенностей изменения морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях в зависимости от этиологических факторов, обусловливающих их патогенное воздействие на организм взрослых и детей. Задачи исследования:
-
Выявить зависимость активности эозинофилопоэза у взрослых и детей от этиологических факторов, обусловливающих патофизиологический механизм эозинофилий.
-
Изучить морфологическое состояние эозинофильных гранулоцитов у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом различных возрастных групп.
-
Выявить закономерности изменения функционального состояния эозинофилов у взрослых и детей при инфекционно-аллергических состояниях.
-
Оценить взаимосвязь морфологических и функциональных характеристик эозинофилов периферической крови взрослых и детей при эозинофилиях различного генеза.
-
Установить механизм изменения морфофункциональных свойств эозинофилов в зависимости от степени выраженности эозинофилии.
-
Оценить взаимосвязь морфофункциональных показателей эозинофилов периферической крови у больных с эозинофилиями различного генеза.
-
Определить прогностические критерии развития механизма эозинофилии при атопических и паразитарных заболеваниях.
Научная новизна. Новизна работы подтверждается 1 патентом на изобретение. Полученные данные расширили представления о механизме развития изменений морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях различного генеза. Выявлены особенности патофизиологических механизмов развития изменения морфологических, функциональных характеристик эффекторных клеток инфекционно-аллергического воспаления - эозинофильных гранулоцитов в зависимости от генеза эозинофилии. Впервые было проведено комплексное изучение морфофункциональных характеристик эозинофилов и выявлена зависимость от этиологических факторов, обусловливающих генез эозинофилии и возрастных особенностей организма. Доказана возможность применения сканирующей зондовой микроскопии в исследовании эозинофильных гранулоцитарных лейкоцитов. Впервые с помощью данного метода микроскопии получены изображения плазматических мембран эозинофилов у лиц, страдающих аллергическими заболеваниями (амброзийный поллиноз) и лиц, больных токсокарозом. На основании полученных данных показаны характерные особенности высоты поверхности мембраны клетки в зависимости от цитохимического состава и оптических характеристик эозинофилов у здоровых и больных эозинофилиями различного генеза в разных возрастных группах. Впервые установлена корреляционная зависимость морфофункциональных показателей эозинофильных гранулоцитов при эозинофилиях различного генеза. Впервые с помощью последовательного анализа Вальда рассчитаны диагностические коэффициенты эозинофильных показателей, имеющие прогностическую значимость выявления инициирующих патогенетических механизмов развития эозинофилии.
Практическая значимость. Полученные результаты расширяют современные представления о значении морфофункционального состояния эозинофилов периферической крови в формировании противопаразитарного и противоаллергического иммунитета, что может быть использовано для дифференциальной диагностики эозинофилий. Выявлена возможность использования компьютерной цитоморфометрии эозинофилов сканирующей зондовой микроскопии для определения морфофункционального состояния эозинофилов у пациентов больных амброзийным поллинозом и токсокарозом. Установлены нормы методов компьютерной цитоморфометрии и сканирующей зондовой микроскопии для здоровых взрослых и детей. Разработан алгоритм обследования, включающий комплекс, позволяющий устанавливать патофизиологический механизм развития эозинофилии. Полученные данные не только расширяют знания о патогенетических механизмах развития эозинофилий, но и могут быть положены в основу для разработки методов патогенетической терапии. Оценка диагностических коэффициентов дает возможность дифференцировать механизм развития эозинофилии.
Положения, выносимые на защиту. 1. При эозинофилиях различного генеза имеются отличия в морфофункциональном состоянии эозинофилов.Так при атопии (амброзийном поллинозе) определяется усиление эозинофилопоэза, повышение функциональной активности эозинофилов, что определяется уменьшением размеров клетки (снижение средней площади, диаметра клетки, площади цитоплазмы и ядра) и увеличение удельной оптической плотности цитоплазмы. При эозинофилиях, вызванных глистными инвазиями отмечается большое количество клеток с низкой интегральной оптической плотностью и усиление фагоцитарной активнсоти гранулоцитарных лейкоцитов.
-
Независимо от этиологических факторов, обусловливающих механизм развития эозинофилии высота клетки, определяемая методом атомно-силовой микроскопии, увеличивается пропорционально снижению содержания миелопероксидазы и внутриклеточных катионных белков.
-
У больных с «эозинофилией > 500 кл/мкл» выявлены изменения морфофункционального состояния эозинофилов, обусловленные усилением эозинофилопоэза и длительности рециркуляцией эозинофилов.
-
Наиболее значимыми прогностическими критериями, характеризующими звенья патофизиологического механизма развития эозинофилии являются показатели морфофункциональной активности эозинофилов: снижение диаметра клетки (коэффициент Кубальта +6,21), увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения (+5,58), снижение содержания катионных белков (+3,4), снижение содержания миелопероксидазы (+2,85) и увеличение высоты клетки (+2,16).
Личный вклад диссертанта. Автором самостоятельно проведен сбор и анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации. Диссертантом лично проводились микроскопические и цитохимические исследования, расчет формул, статистическая обработка полученных результатов, их обобщение и написание текста диссертации, подготовлены публикации.
Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:
-
Основные результаты исследований, представленные в диссертации опубликованы в печатных работах, докладывались на международном и междисциплинарном конгрессах, научных и научно-практических конференциях по клинической лабораторной диагностике.
-
Результаты работы используются в диагностическом процессе клинико-диагностических лабораторий города Ставрополя.
-
Результаты работы используются при обучении студентов специальности «Медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» на кафедре медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский Федеральный Университет» (заведующий кафедрой профессор, д.м.н. Т.П. Бондарь).
Апробация диссертации.Материалы работы докладывались и обсуждались на: Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии» (Санкт-Петербург, 2010); 55 Научно – практической конференции «Университетская наука – региону» (Ставрополь, 2010); 56 Научно – практической конференции «Университетская наука – региону» (Ставрополь, 2011); XIX Итоговая научная конференция студентов с международным участием (Ставрополь, 2011); Научно-практическая конференция «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); VII съезд казахского физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной. Основа здоровья и долголетия», посвященного 100-летию академиков АН КАЗССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева (Алматы, 2011); XVI Форум «Национальные дни лабораторной медицины России – 1021» (Москва, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 в рецензируемых журналах перечня ВАК РФ, получен патент №2464559 «Способ оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии» от 20.10.2012, в соавторстве с профессором Бондарь Т.П. опубликована монография «Роль эозинофилов в развитии инфекционно-аллергического воспаления», Ставрополь, 2014, 106с.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов исследования, заключения, выводов, библиографического указателя, включающего 181 наименование (98 отечественных и 83 иностранных источника). Изложена на 133 страницах, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 24 рисунками.
Диссертация подготовлена и выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Развитие научного потенциала Высшей Школы» Министерства образования и науки РФ (2009-2012) «Биохимические и патофизиологические нарушения наноструктуры эозинофильных гранулоцитов при социально значимых болезнях» на кафедре медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский Федеральный Университет» (заведующий кафедрой профессор, д.м.н. Т.П. Бондарь).
Эволюция представлений о механизмах развития эозинофилий
В последние годы внимание специалистов всё больше привлекает изучение функциональных свойств таких клеток крови как лейкоциты. Немаловажная роль в данной структуре отводится эозинофилам, которые несут ответственность за обезвреживание чужеродного белка и принимают неотъемлемое участие в аллергических реакциях организма. В 1922г. был издан первый в Советском союзе научный труд, посвященный этой проблеме - монография «Большие эозинофилии крови» (Тимофеевский А.Д., 1922). Работа носила исключительно описательный характер и базировалась на результатах клинических наблюдений за пациентами с типовыми патологическими процессами, сопровождающимися явлениями эозинофилии (Гриншпун Г.Д., 1983). Эозинофилия - это увеличение абсолютного числа эозинофилов в периферической крови более 450 кл/мкл. Причин повышения количества эозинофилов множество, но чаще имеют место аллергическая реакция или паразитарные инфекции (Рабсон А., 2006). При аллергических состояниях эозинофилия обычно умеренная – от 0,2 до 1,5х109/л, но в некоторых случаях может быть и выше, например, при бронхиальной астме или ангионевротическом отеке.
Эозинофилию способна вызвать почти любая паразитарная инвазия тканей, исключение обычно составляют протозойные и неинвазивные метазойные возбудители (Рязанцева Н.В., 2007). Редкой причиной гиперэозинофилии (чаще у детей) может быть эозинофильная лейкемия. Она проявляется симптомами острого миелолейкоза; характерная особенность – быстрое развитие сердечной недостаточности вследствие поражения эндокарда и клапанов сердца. Выраженная и стабильная эозинофилия (от 10 до 60%) может быть при пемфигусе и герпетиформном дерматите Дюринга. Кроме того, эозинофилией сопровождается узелковый периартериит (около 18 % больных имеют уровень эозинофилов, достигающий 84 %), ревматоидный артрит, осложненный васкулитами и плевритами. Также встречается гиперэозинофильный синдром, при котором лейкоцитоз достигает 138,0х109/л, при этом на эозинофилы приходится 93 % клеток (Новицкий В.В., 2008).
К развитию умеренной эозинофилии может привести прием большого количества лекарственных препаратов. Лекарственная эозинофильная реакция может протекать бессимптомно и быть единственным проявлением гиперчувствительности к препарату или сочетаться с разнообразными синдромами: интерстициальным нефритом, лихорадкой, кожной сыпью, гепатоспленомегалией, артритом, синдромом Стивенса–Джонсона. Наиболее часто такое состояние вызывают антибиотики, противомикробные средства, цитостатики, нестероидные противовоспалительные средства и психотропные препараты. Через 7-10 дней после прекращения приема препарата число эозинофилов нормализуется (Чучалин А.Г., 2003). Итак, клинические, диагностические, лечебные и прогностические признаки различных легочных эозинофилий существенно различаются. Для окончательного понимания этих расстройств необходимо проведение дальнейших исследований.
Механизмы развития эозинофилий различны. Наиболее важными из них являются: 1) высокий уровень в крови интерлейкина-5; 2) антителозависимый хемотаксис эозинофилов, обусловленный гиперпродукцией IgE и IgG (наблюдается преимущественно при паразитарных инвазиях); 3) иммунный механизм с гиперпродукцией ІgЕ (развивается при аллергической реакции немедленного типа); 4) гиперпродукция хемотаксического эозинофильного фактора (при некоторых опухолях); 5) опухолевая пролиферация, патоморфологический субстрат которой составляют эозинофилы (при эозинофильной лейкемии и миелопролиферативных заболеваниях) (Охотникова, Е.Н., 2012). Кинетика эозинофильных гранулоцитов представлена на рисунке 3.
Ранее установлено, что при эозинофилиях изменяется кинетика эозинофилов. Так, на ранних стадиях созревания укорачиваются клеточные циклы, увеличивается митотический индекс, время генерации сокращается в три раза, эозинофилы появляются в периферической крови в два раза быстрее. Из циркуляции эозинофилы исчезают в течение 3 часов, а затем вновь возвращаются в кровоток из тканей. Длительность рециркуляции является одной из причин эозинофилии (Воробьев А.И., 2005). До сих пор недостаточно понятны механизмы, определяющие различия в ответе эозинофилов у разных людей на одни и те же патологические процессы. Доказано, что возникновение и выраженность эозинофилии при реактивных состояниях связано с ферментной активностью клеток или рецепторами их мембраны и выражается комплексом нарушений в виде дегрануляции и изменения цитохимического состава гранул эозинофилов (Бондарь Т.П., 2010).
При острых воспалительных процессах значительное количество эозинофилов выходит из циркуляции и накапливается по периферии очага воспаления. Содержание эозинофилов в межтканевом пространстве человека приблизительно в 100 раз превышает таковое в кровотоке. Пока не выяснены механизмы, обуславливающие избирательное поступление в кровь созревших клеточных элементов костного мозга (Козинец Г.И., 2008). Исполнительные механизмы регуляции количества и качества клеточных элементов крови связаны с процессами депонирования крови, в том числе изменениями скорости кровотока, сосудистого тонуса, объема кроветворения и кроверазрушения. Процесс дифференцировки эозинофилов сопровождается качественными и количественными изменениями морфологии клеток и внутриклеточных структур (Дягилева О.А., 2008).
Роль эозинофилов в антипаразитарном иммунитете
Не смотря на широкое развитие медицины, количество глистных заболеваний человека не уменьшается. Особое место среди них занимает токсокароз - паразитарное заболевание, вызываемое личинками аскарид животных. Для него характерно длительное течение с рецидивами и полиорганными поражениями иммунной системы (Слободенюк, А.В., 2005). Токсокароз - инфекция, вызванная попаданием в организм глистов (гельминтов) токсокар. Окончательными хозяевами этих паразитов являются, в основном, собаки (Toxocara canis) и кошки (Toxocara cati). Человек является не окончательным, а резервуарным хозяином для токсокар, поэтому они не развиваются дальше личинок размером около 0,3 мм. Личинки путешествуют по организму человека и оседают в печени, легких, сердце, глазах, мозге и других органах, образуя вокруг себя капсулы (гранулемы). Защищенные капсулами, личинки могут находиться в человеческом организме многие годы. Гранулемы могут вызвать аллергические реакции и нарушения в работе органов (Абдулазизов А.И, 2007; Дроздов А.А., 2008; Фадеева Т.Г., 2009 ).
Согласно данным зарубежных авторов, самая высокая серопораженность токсокарами людей отмечена в Колумбии (68,2 %), а самая низкая - в Японии (3,6 %) (Андронова Т.А., 2009; Онищенко Г.Г 2007). Для России, регионами, в которых чаще всего регистрируются случаи заболевания, являются Северо-Кавказский, Южный, Центральный, Уральский и Западно-Сибирский регионы. В Ставропольском крае зараженность почвы яйцами собачей аскариды составляет 67,3-69,4% (Солдатова М.В., 2007).
Глистная инвазия является причиной значительной и длительной эозинофилии. При инвазии кишечных паразитов эозинофилия редко бывает выраженной. Однако увеличение относительного содержания эозинофилов до 10-30 % и даже до 69 % возможно при стронгилоидозе, токсокарозе (Лобзин Ю.В,. 2007). В последние годы формируются представления о выраженном цитотоксическом потенциале эозинофилов, превышающем другие клетки крови, что объясняет первостепенное значение эозинофилов в антипаразитарных реакциях. Эозинофилы осуществляют внеклеточное уничтожение крупных паразитов, типа гельминтов. Гранулы клеток имеют рецепторы для C3b, который, фиксируясь на мембранах паразита, через специфический рецептор активируют эозинофилы. Это приводит к выделению главного, основного белка и катионного белка, а также «дыхательному взрыву», сопровождающемуся выработкой активных форм кислорода. Происходящий процесс приводит к повреждению мембраны гельминта (Iddawela R.D., 2007; Kirman J.,2009).
При длительно протекающем или длительно существующем хроническом течении паразитозов организм приспосабливается к существованию паразита, формируя состояние неустойчивого равновесия, что подтверждается наличием функционально активных эозинофилов. В настоящее время благодаря значительному расширению методов лабораторных исследований и внедрению новых технологий в клинической практике появилась возможность детального изучения морфометрических и морфологических особенностей эозинофилов и их плотностных характеристик (Семенкова Е.Н. 2004). В изученной нами литературе не имеется четких представлений о зависимости размеров эозинофилов и их функциональной активности в периферической крови пациентов с различными эозинофилиями от возраста и уровня гиперэозинофилии. Особый интерес представляют эти данные для прогнозирования развития заболеваний инфекционно-аллергического генеза в условиях активно развивающихся высокотехнологичных методах диагностической медицины.
Для решения поставленных в исследовании задач и в соответствии с принципами доказательной медицины (Хенеган К.,2011), в течение 2010-2012 гг. было обследовано 218 человек. В обследовании приняли участие 73 пациента городского аллергологического кабинета с установленным клиническим диагнозом Амброзийный поллиноз. Вторую группу составили 47 пациентов гельминтологического центра Ставропольской Краевой клинической инфекционной больницы с положительной серологической реакцией крови к токсокарозу и клинически подтвержденным диагнозом Токсокароз, висцеральная форма. Все пациенты были обследованы при первом обращении за медицинской помощью в специализированное лечебно-профилактическое учреждение, после установления клинического диагноза до назначения патогенетической терапии. Критериями отбора явились установленный диагноз и относительная эозинофилия более 6-7%
Контрольную группу составили 98 добровольцев с сопоставимыми возрастными и половыми характеристиками, не имеющих аллергических заболеваний в анамнезе, специфических антител к антигенам токсокар и нормальным уровнем эозинофилов в периферической крови. Распределение пациентов по возрасту и полу представлены в таблице 1.
Средний возраст 7,4±0,3 9,3±0,5 8,4±1,6 ВСЕГО 98 73 47 2 Все пациенты были обследованы при первом обращении за медицинской помощью в специализированное лечебно-профилактическое учреждение до назначения соответствующей терапии (кортикостероидов и других противоаллергических препаратов). Методами кожных проб и определением титра специфических антител к аллергенам выявляли сенсибилизацию на цветение сорных трав (лебеда, полынь, амброзия). Исследование проводилось в период цветения причинно-значимых аллергенов (август - сентябрь).
Цитохимический Полуколичественное определение в эозинофилах пероксидазы и катионных белков Микроскопия по методу Эпштейна и определение пероксидазы; Микроскопия по методу Шубича с определениемКатионных белков 436
Атомно-силовая микроскопия Изучение закономерности изменения структурных свойств мембраны эозинофилов АСМ Интегра Прима (Россия): Измерение высоты профиля мембраны эозинофила 218
Статистический Статистическая оценка полученных результатов, достоверность различий, корреляционный анализ X, m. , p, t(коэф. Стюдента), r (коэф. Кубальта) Всего в работе проведено 4360 лабораторных исследований. Взятие крови и приготовление препаратов
Снижение до минимума возможных ошибок и обеспечение высокого качества гематологических исследований возможно при стандартизации преаналитического и аналитического этапов работы. Преаналитический этап исследований проводили в соответствии с существующими приказами и рекомендациями МЗ РФ по контролю качества лабораторных исследований (ГОСТ Р 531 33.2-2008).
В качестве биологического материала использовалась венозная кровь, взятая в состоянии физического покоя утром натощак. Взятие крови осуществлялось с применением специальных одноразовых вакуумных систем с напыленным на стенки пробирки К2-ЭДТА в качестве антикоагулянта, что гарантировало отсутствие в образце посторонних примесей.
С целью установления изменений морфофункциональных свойств эозинофилов, нами разработана схема определения комплекса лабораторных критериев диагностики, что более эффективно для диагностики, чем исследование отдельных показателей. В схему были включены современные методы исследования, с использованием новейших технологий, при этом отобраны такие, при которых количество крови, необходимое на одно определение было минимальное.
Морфологическое состояние эозинофильных гранулоцитов у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом различных возрастных групп
Безусловно доказано, что морфология клетки была и остается «золотым стандартом» гематологии. В настоящее время использование метода световой микроскопии для оценки морфологических и цитохимических признаков исследуемого клеточного материала носит субъективный характер. С появлением современных компьютерных технологий принципиальным образом расширились возможности количественного и качественного изучения клеточной морфологии (Плясунова, С.А., 2006).
Для диагностики функционального состояния, характера и степени дисфункции клеточного иммунитета информативным показателем служит оценка морфометрических параметров его клеточного состава (Погорелов, В.М., 2003). Морфология клеток крови признана важным клиническим показателем, однако, сравнение морфометрических характеристик эозинофилов при эозинофилиях различного генеза по данным изученной нами литературы носят фрагментарный характер. В этой связи, в данном разделе, нам представляется актуальным с использованием современных цитометрических методов получить сравнительную характеристику эозинофилов периферической крови в группах детей и взрослых пациентов с амброзийным поллинозом и токсокарозом.
В результате статистической оценки изменения геометрических параметров цифровых изображений эозинофилов установлено, что размер циркулирующих эозинофилов у пациентов с эозинофилией паразитарного и непаразитарного генеза характеризуется снижением размеров клеток за счет уменьшения площади цитоплазмы эозинофила, причем изменения размера ядра наблюдается не во всех случаях сравнения (таблица 7). Примечание: Р – уровень достоверности внутригрупповых различий показателей здоровых и больных с аллергией; Р1 – уровень достоверности внутригрупповых различий показателей здоровых и больных токсокарозом; Р2 – уровень достоверности внутригрупповых различий показателей больных с аллергией и больных токсокарозом; Р3 – уровень достоверности межгрупповых различий показателей здоровых взрослых и детей; Р4 – уровень достоверности межгрупповых различий показателей больных с аллергией взрослых и детей; Р5 – уровень достоверности межгрупповых различий показателей больных токсокарозом взрослых и детей Как видно из таблицы 7, наименьшая площадь наблюдается в группах взрослых пациентов и детей с амброзийным поллинозом (107,0±5,4 и 91,1±7,1 мкм2), изменение размеров клетки происходит за счет снижения площади ядра (42,7±1,8 и 38,1±2,2 мкм2) и площади цитоплазмы (64,3±2,3 и 52,9±2,7 мкм2). При этом достоверные различия аналогичных показателей в разных возрастных группах характерны только для показателя средняя площадь цитоплазмы (р 0,001). Расчет ядерно-цитоплазматического соотношения и коэффициента выпуклости ядра показал, что для эозинофилий аллергического генеза характерна однонаправленность и пропорциональность уменьшения геометрических размеров внутриклеточных структур эозинофильных гранулоцитов, преобладающих в периферической крови пациентов независимо от возраста.
Полученные данные иллюстрирует рисунок 11, на котором показатели в группах взрослых и детей - пациентов с амброзийным поллинозом выражены для наглядности в процентном отношении к данным здоровых людей соответствующего возраста. В таблице 7, представляющей данные статистической обработки результатов компьютерной цитоморфометрии эозинофильных гранулоцитов, показано, что различия размеров клетки и внутриклеточных структур в группах взрослых больных токсокарозом и здоровых людей не достоверны. Однако, отмечаются тенденции к уменьшению площади клетки и количества цитоплазмы на фоне увеличения площади ядра, при этом данные подтверждаются увеличением ядерно-цитоплазматического соотношения (0,70±0,04 у больных токсокарозом и 0,55±0,03 в группе сравнения, р 0,001). Сравнение геометрических показателей эозинофилов периферической крови в группе детей, страдающих токсокарозом, позволило выявить несколько отличающиеся от данных взрослых пациентов тенденции. Установлена большая реактивность эозинофилов, которая выражается в достоверном уменьшении площади клетки (р0,05) и количества цитоплазмы (р0,001). При этом, у детей, в отличие от взрослых, наблюдается достоверное уменьшение площади ядра эозинофила (р0,01), однако изменения размеров клетки происходят в большей степени за счет уменьшения количества цитоплазмы, что подтверждает снижение ядерно-цитоплазматического соотношения (0,70±0,04 у взрослых и 0,59±0,07 у детей). Полученные данные иллюстрирует рисунок 12, на котором показатели в группах взрослых и детей - пациентов с токсокарозом выражены для наглядности в процентном отношении к данным здоровых людей соответствующего возраста.
Взаимосвязь морфологических и функциональных характеристик эозинофилов периферической крови взрослых и детей при эозинофилиях различного генеза
Известно, что существующая между эозинофилами и клетками иммунной системы взаимонаправленность эффектов обусловлена, с одной стороны, иммунорегулирующим действием иммуноцитов и определяет эозинофилы как эффекторное звено иммунных реакций, а с другой – способностью эозинофильных гранулоцитов синтезировать широкий спектр медиаторов, что указывает на их иммуномодулирующую функцию. Основываясь на факте, что обусловливающее значительное усиление цитотоксичности эозинофилов может быть повышение их дегрануляции (Федорова, М.З., 2008), нами проведено изучение цитохимического состава эозинофилов на присутствие в клетках пероксидазы, внутриклеточных катионных протеинов и зависимость высоты клеток от содержания медиаторов.
Активация циркулирующего пула эозинофилов приводит к выделению из клеток повышенного количества пероксидазы, что отражает существующее мнение об усилении кислородозависимых механизмов киллинга в эозинофилах периферической крови, и может быть связано с их повышенной функциональной активностью. Сравнивая значения катионного белка в исследуемых группах, следует отметить тенденцию к снижению показателя в группах пациентов с эозинофилией инфекционно-паразитарного генеза. Результаты статистической обработки полученных материалов представлены в таблице 9.
Как видно из таблицы 9 средний цитохимический коэффициент пероксидазы для здоровых взрослых и детей несколько различается (2,50±0,10 у.е. и . 3,2±0,09 у.е., соответственно). При амброзийном поллинозе значения пероксидазы снижаются как у взрослых (2,32±0,08 у.е.), так и у детей (2,8±0,07 у.е.). В группах больных токсокарозом у взрослых и у детей показатель пероксидазы также снижается (1,97±0,05 у.е. и 1,6±0,06 у.е., соответственно). Все различия достоверны. Внутриклеточные катионные белки (СЦККБ) в группах здоровых взрослых и детей особо не отличаются (2,6±0,13 у.е. и 2,4±0,02 у.е., соответственно). При амброзийном поллинозе количество внутриклеточных катионных белков снижается в группах и взрослых и детей (1,95±0,11 у.е. и 2,1±0,04 у.е., соответственно). Также снижаются они и при токсокарозе (2,2±0,06 у.е. и 2,1±0,03 у.е., соответственно), различия достоверны. Анализ данных высоты профиля мембраны эозинофила показал, что в норме у здоровых взрослых и здоровых детей высота клетки примерно одинакова (290±30,0 нм и 230±20,0 нм). При амброзийном поллинозе высота клетки увеличивается как в группе взрослых так и в группе детей (580±40,0 нм и 490±40,0 нм, соответственно). У больных токсокарозом взрослых и детей высота клетки также увеличивается (670±50,0 нм и 580±30,0 нм, соответственно), различия достоверны. Следует отметить, что наиболее яркие изменения наблюдаются при токсокарозе. Наглядно эти изменения представлены на рисунке 15.
Определение функциональной активности лейкоцитарных гранулоцитов методом НСТ-теста показал, что максимально повышение показателей отмечается у взрослых и детей больных токсакарозом (74±8,5% и 78±9,2%, соответственно). При амброзийном поллинозе также увеличивается количество функционально активных клеток, по сравнению со здоровыми, но в меньшей степени, чем при токсокарозе. Достоверных различий этого показателя у взрослых и детей больных амброзийным поллинозом не установлено.
Таким образом, результаты цитохимического исследования эозинофилов согласуются с данными проведенной цитоморфометрии эозинофилов. Реакция, происходящая в клетке напоминает «кислородный взрыв» (Алексеев Н.А., 2002), появляется большое количество вакуолей, за счет чего и происходит увеличение высоты эозинофила и снижение насыщенности гранул, увеличение фагоцитарной активности эозинофильных гранулоцитов. 3.5. Механизм изменения морфофункциональных свойств эозинофилов в зависимости от степени выраженности эозинофилии
В литературе понятие эозинофилии неоднозначно: разные авторы классифицируют по разному. Нами была использована классификация профессора А.Г. Чучалина, согласно которой в норме абсолютное количество эозинофилов в периферической крови составляет 120-350 кл/мкл, 350-500 кл/мкл является умеренной эозинофилией, а свыше 500 кл/мкл – гиперэозинофилия. (Чучалин А.Г., 2003). Считается, что выраженность патологических изменений, опосредованных эозинофилами зависят не столько от их количества, сколько от их активности. Особенностью эозинофилии инфекционно-аллергической природы является повышение фагоцитарной активности эозинофилов. Современная наука рассматривает эозинофил как одну из ключевых клеток воспаления в связи с наличием кислороднезависимого, обусловленного действием белков больших и малых гранул, и кислородзависимого механизмов микробицидности. Говоря о роли эозинофилов, нужно отметить, что их функция сводится к предупреждению проникновения антигена в сосудистое русло, то есть генерализации иммунного ответа (Bletry O., 1990).
Относительное количество эозинофилов, 106/л 7,3±0,6 12,2±0,8 6,1±0,4 16,7±3,3 Лейкоциты, 109/л 5,4±0,4 8,5±0,4 6,6±0,4 13,7±1,5 Эозинофильный индекс, у.е. 0,73±0,03 0,57±0,03 0,89±0,02 0,51±0,09 Индекс аллергизации, у.е. 1,94±0,23 3,05±0,27 1,3±0,1 4,3±0,3 Примечание: – уровень достоверности внутригрупповых различий показателей больных самброзийным поллинозом; – уровень достоверности внутригрупповых различий показателей больных токсокарозом; Анализируя данные таблицы 10, видно, что относительное количество эозинофиловповышено при «эозинофилиях 500 кл/мкл» как при амброзийном поллинозе так и при токсокарозе (12,2±0,8 106/л и 16,7±3,3 106/л, соответственно), но при токсокарозе эти изменения наиболее выражены. Общее количество лейкоцитов также выше при «эозинофилиях 500 кл/мкл » и при амброзийном поллинозе и при токсокарозе (8,5±0,4 109/л и 13,7±1,5 109/л, соответственно). Также наиболее ярко выраженная картина наблюдается при токсокарозе. Эозинофильный индекс ниже в группах с «эозинофилией 500 кл/мкл » как при амброзийном поллинозе так и при токсокарозе (0,73±0,03 у.е. и 0,51±0,09 у.е., соответственно).
Индекс аллергизации повышен во всех группах, но в группах с «эозинофилией 500 кл/мкл» показатель наиболее повышен (3,05±0,27 у.е. и 4,3±0,3 у.е.). Полученные результаты наглядно иллюстрируют рисунок 16, на котором данные представлены в процентном отношении к результатам соответствующих возрастных групп.
Таким образом, при амброзийном поллинозе процент с «эозинофилией 500» – 73%, а при токсокарозе – 49%. При этом установлены различия эозинофильных показателей при разном уровне эозинофилии следующие: при «эозинофилии 500 кл/мкл» –увеличение общего количества лейкоцитов, снижение эозинофильного индекса, увеличение индекса аллергизации. Однако, имеются различия в группах с «эозинофилией 500 кл/мкл» в зависимости от причины развития эозинофилии. Так при амброзийном поллинозе у больных с «эозинофилией 500 кл/мкл» отмечается: увеличение интегральной оптической плотности, повышение СЦКП. Полученные результаты свидетельствуют о различном участии эозинофилов в механизме аллергического и паразитарного иммунитета.
