Введение к работе
Актуальность исследования
Бронхиальная астма (БА) является глобальной медико-социальной проблемой [GINA, 2009]. Сегодня в мире насчитывается около 300 миллионов больных БА. Согласно прогнозам к 2025 г. этот показатель может составить 400 миллионов. В России ежегодно регистрируется около 115 тысяч впервые выявленных больных. В 2007 г. на учете состояло более 1,2 миллионов больных астмой. Эта болезнь является причиной более 2 миллионов дней временной нетрудоспособности работающего населения и 4 миллионов дней госпитализации ежегодно на территории России (по данным Федерального государственного статистического наблюдения). В структуре инвалидности удельный вес БА среди болезней органов дыхания составляет 64,9%, а в трудоспособном возрасте 80,9% [Чучалин А.Г., 2009].
Проблемы диагностики и лечения БА связаны с выраженным клиническим полиморфизмом болезни [Anderson G.P., 2008; Holgate S.T., 2008; Buc M. et al., 2009]. Выделяют аллергический и неаллергический фенотип БА, с быстрым и медленным прогрессированием снижения функции легких, с эозинофильной и нейтрофильной инфильтрацией, терапевтически чувствительную и терапевтически резистентную. Неблагоприятным прогнозом отличается тяжелая терапевтически резистентная БА, что связано с неконтролируемым воспалением. В последние годы предметом пристального внимания пульмонологов всего мира является проблема тяжелого, неконтролируемого, резистентного к лечению течения БА, сопровождающегося высокой частотой инвалидизации и смертности больных [Чучалин А.Г., 2007; Огородова Л.М. и соавт., 2008; Цой А.Н., Архипов В.В., 2008, Bousguet J. et al., 2007; Bateman E.D. et al., 2008]. Недостаточная эффективность базисной терапии в условиях регулярного лечения может быть ассоциирована как с генетически детерминированной кортикостероидной резистентностью, так и снижением ответа на кортикостероиды, связанным с прогрессированием воспаления и ремоделирования дыхательных путей (ДП), в значительной мере обусловливающих сохранение у пациентов симптомов бронхиальной гиперреактивности и обструкции бронхов [Черняк Б.А., Воржева И.И., 2008].
Сегодня сформулированы клинические критерии фенотипов БА, но патофизиологические аспекты их развития остаются не до конца ясными [Фассахов Р.С., 2005]. В связи с этим выяснение фундаментальных аспектов клинического полиморфизма БА является актуальным, поскольку невозможно с позиции современных знаний предложить персонифицированные подходы к терапии этой болезни. Результаты последних исследований привели к пониманию важной роли оксида азота в развитии БА [Гельцер Б.И. и соавт., 2003; Brune B., 2003; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Li C.Q., Wogan G.N. 2005; Gaston B. et al., 2008; Ichikawa T. et al., 2008]. Известно, что молекула оксида азота (NO), будучи реакционно-способным соединением, участвует в развитии БА путем прямого и непрямого вклада в аллергическое воспаление [Осипов А.Н., 2007; Giustarini D. et al., 2003]. Прямой заключается в том, что оксид азота, как сигнальная молекула, регулирует функции бронхиального дерева и является одним из релаксирующих факторов эпителиального происхождения, регулирует функцию реснитчатого эпителия, бронхиальную и легочную гемодинамику. Непрямой путь участия оксида азота в механизмах БА реализуется при помощи биохимических превращений метаболитов NO в реакциях воспаления [Bove P.F., Vliet A., 2006]. Около 85% от общего уровня NO-содержащих веществ в организме здорового человека составляют нитраты и нитриты и примерно 10% - S-нитрозосоединения, которые рассматриваются как депо NO [Hess D.T., 2005; Kutzia A. et al., 2006; Gaston B., 2007].
Нитриты, будучи стабильными метаболитами аэробного окисления NO, отражают как продукцию NO (ферментативную и неферментативную), так и активность воспаления в ДП [Невзорова В.А. и соавт., 2001; Гельцер Б.И. и соавт., 2003; Филиппова Н.А. и соавт., 2006; Козырицкая Д.В. и соавт., 2007; Gookin J.L. et al., 2002; Kharitonov S.A. et al., 2004; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Paredi P., 2005; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2006; Barnes P.J. et al., 2009; Brindicci C. et al., 2009]. В отношении других метаболитов NO исследования находятся в стадии накопления данных и носят в основном экспериментальный характер [Saleh D. et al., 1998; Dweik R. et al., 2001; Ischiropoulos Н., 2003; Celio S. et al., 2006; Ichikawa Т. et al., 2008; Maarsingh H. et al., 2009].
Для обозначения механизмов развития воспаления, включающих повышенную генерацию активных форм азота (АФА) и повреждение высокоактивными соединениями азота молекулярных компонентов клетки, в работах J.S. Stamler et al. (1998), по аналогии c оксидативным стрессом (oxidative stress), предложен термин «нитрозилирующий стресс (nitrosative stress)». Изучение закономерностей нитрозилирующего стресса является сегодня одним из развивающихся научных направлений [Klatt P., 2000; DalleDonne I. et al., 2005; Chiappetta G., 2009]. В частности, регуляция образования метаболитов NO и причины нарушения депонирования NO Sнитрозотиолами при аллергическом воспалении ДП, с точки зрения формирования нитрозилирующего стресса, до сих пор остаются малопонятными.
В развитии мультифакториальной болезни, к которой относится БА, участвуют несколько факторов (механизмов). Конечный фенотип формируется в результате взаимодействия генетических особенностей индивида и внешнесредовых факторов [Пузырев В.П., 2003]. Морфологические и молекулярные особенности, лежащие в основе этой гетерогенности, не известны. На сегодняшний день показано сцепление БА и ее клинических проявлений со многими хромосомными регионами [Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., 2007; Schwartz D.A., 2004; Gao L., Barnes K.C., 2009]. Однако вследствие сложного клинического фенотипа БА, полигенной модели наследования и значительной роли воздействий внешней среды в развитии и прогрессировании этого заболевания, большее число генов подверженности к астме до сих пор остается до конца не идентифицированным и требует дальнейшего исследования.
Несомненно, не только выраженность воспаления, но и генотип больного БА влияет на процессы превращения метаболитов NO и их накопление в ДП. Однако данных об участии генов, контролирующих образование и метаболизм NO, в настоящее время недостаточно. Несмотря на значительные достижения и большое число публикаций в области респираторной медицины [Nevin B.J., Broadley K.J., 2002; Bove P.F., Vliet A., 2006; Valko M. et al., 2006; Fitzpatrick A.M., 2009; Lewis S.J., Gaston B., 2009], некоторые пути превращений NO при БА с этих позиций не изучены вообще.
Предположительно уровень экспрессии и полиморфизм генов NO-синтаз (NOS) ассоциированы с нарушением метаболизма NO и персистенцией аллергического воспаления в ДП, а снижение активности глутатионSтрансферазы (GST), участвующей в реакции редокс-циклирования глутатиона, может быть причиной нарушения депонирования NO Sнитрозотиолами. В этой связи получение новых научных знаний о закономерностях регуляции нитрозилирующего стресса при воспалении ДП создаст теоретические предпосылки для разработки новых диагностических и лечебных технологий. Определение патогенетического значения полиморфных вариантов генов NOS и GST, закономерностей экспрессии NOS при БА позволит сформулировать принципиально иные вмешательства в патологический процесс, основанные на разработке новых фармакологических мишеней персонифицированной терапии БА.
Цель исследования:
Установить общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновать его значение в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы.
Задачи исследования:
-
Определить содержание метаболитов нитрозилирующего (нитриты, нитрозоглутатион, 3-нитротирозин) и оксидативного (малоновый диальдегид) стрессов, а также активность (супероксиддисмутаза, каталаза) и содержание (глутатион) компонентов антиоксидантной системы в дыхательных путях у больных бронхиальной астмой с разной тяжестью и в разные периоды болезни. Установить их роль в механизмах нарушения функции легких при бронхиальной астме.
-
Установить специфические тканевые и клеточные маркеры структурно-функциональных нарушений слизистой оболочки бронхов больных бронхиальной астмой в зависимости от тяжести, периода болезни и содержания метаболитов оксида азота в дыхательных путях.
-
Изучить содержание цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-, ИНФ-) в бронхиальном смыве у больных бронхиальной астмой и проанализировать ассоциацию количества этих цитокинов с уровнем метаболитов нитрозилирующего стресса.
-
Обосновать участие генов NOS в регуляции продукции метаболитов оксида азота и формировании аллергического воспаления дыхательных путей путем оценки уровня мРНК NOS1, NOS2, NOS3 в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой. Выявить взаимосвязь экспрессии генов NOS1, NOS2 и NOS3 с тяжестью бронхиальной астмы, нарушениями функции легких и содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.
-
Установить взаимосвязь полиморфизма 276С/Т и 186А/С гена NOS1, -954G/C и 343C/- гена NOS2, 894G/T и 260GCCC/- гена NOS3 c содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.
-
Выявить взаимосвязь полиморфизма GSTT1*1/0 и GSTM1*1/0 генов GST с уровнем метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве, клинико-функциональными и морфологическими характеристиками бронхиальной астмы. Оценить вклад полиморфизма этих генов в контроль образования нитрозоглутатиона в дыхательных путях.
-
Разработать концепцию, раскрывающую общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновывающую выбор молекулярных мишеней терапии клинических фенотипов бронхиальной астмы.
Научная новизна
В результате выполнения настоящей диссертационной работы получены новые теоретические знания и сформулирована концепция клинического полиморфизма бронхиальной астмы с позиции нитрозилирующего стресса. Впервые проведен системный анализ инициации, формирования и регуляции нитрозилирующего стресса и полученные результаты сопоставлены с клинико-функциональными, морфологическими и фармакологическими характеристиками болезни.
Впервые обоснована фундаментальная концепция нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, заключающаяся в том, что нарушение образования Sнитрозотиолов сопровождается избыточным накоплением 3-нитротирозина и нитритов в дыхательных путях и приводит к персистенции воспаления и повреждению слизистой бронхов.
Приоритетными являются данные о том, что нитрозилирующий стресс может проявляться накоплением в бронхиальном смыве преимущественно нитритов, что ассоциировано с легкими и обратимыми симптомами болезни и обратимыми нарушениями функции легких. В случае реализации нитрозилирующего стресса преимущественно за счет повышения уровня 3нитротирозина в бронхиальном смыве регистрируются необратимые тяжелые, резистентные к терапии симптомы и функциональные проявления болезни.
Новыми являются результаты, полученные методом дискриминантного анализа, показавшие, что среди изученных метаболитов нитрозилирующего стресса наибольший вклад в формирование клинического полиморфизма бронхиальной астмы вносят показатели уровня нитрозоглутатиона. Прогрессирование тяжести заболевания происходит при усугублении дефицита нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве.
Впервые показано, что интенсивность нитрозилирующего стресса при воспалении на фоне бронхиальной астмы ассоциирована с развитием оксидативного стресса и с существующим дисбалансом в сторону интенсификации нитрозилирующего стресса (кратное увеличение 3нитротирозина в сравнении с малоновым диальдегидом в бронхиальном смыве).
Абсолютно приоритетными являются данные о молекулярно-генетических механизмах нитрозилирующего стресса. Так, установлено, что аллель -954С гена индуцибельной NOS ассоциирован с формированием нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме. Патогенетический вклад данного полиморфизма подтвержден высоким уровнем мРНК индуцибельной NOS в бронхобиоптатах больных и высоким уровнем нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве.
В результате обобщения клинических, функциональных, генетических характеристик пациентов с привлечением многофакторного дискриминантного анализа получены приоритетные данные об ассоциации экспрессии конститутивных изоформ (нейрональной NOS, эндотелиальной NOS) в бронхиальных биоптатах с улучшением паттерна воспаления и показателей функции легких при бронхиальной астме, а в случае повышенной экспрессии гена индуцибельной NOS в ткани бронхов - с ухудшением состояния слизистой оболочки бронхов и низкими значениями показателей функции внешнего дыхания при бронхиальной астме.
Впервые установлено участие генов GST в регуляции нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме. Показано, что функционально неактивная комбинация GSTT1*0/GSTM1*0 характеризуется нарушениями метаболизма оксида азота, а именно, преимущественным образованием 3-нитротирозина и дефицитом нитрозоглутатиона в связи с ферментативным дефицитом GST. У пациентов с данной комбинацией аллелей зарегистрирован экстремально высокий уровень 3-нитротирозина и низкий уровень нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве. Данный молекулярный механизм является фактором риска тяжелой бронхиальной астмы в связи с необратимым характером накопления 3нитротирозина, низким бронходилатационным потенциалом на фоне дефицита нитрозоглутатиона и плохим ответом на терапию.
Новыми являются результаты о роли нитрозилирующего стресса в ремоделировании дыхательных путей при бронхиальной астме. Так, установлено, что повышенное содержание 3-нитротирозина ассоциировано с текущим воспалением, уменьшением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитов, снижением относительного объема желез, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани. Увеличение уровня 3-нитротирозина в дыхательных путях ассоциировано с более высокой плотностью провоспалительных клеточных элементов и провоспалительных цитокинов (гистиомакрофагальные элементы, нейтрофилы, лимфоциты, ИЛ-8, ФНО-). Таким образом, метаболит нитрозилирующего стресса 3-нитротирозин является маркером необратимого повреждения дыхательных путей.
Теоретическая и практическая значимость
Работа выполнена в области клинической патофизиологии бронхиальной астмы. В результате выполнения работы предложена концепция, раскрывающая значение нитрозилирующего стресса как базисного механизма аллергического воспаления дыхательных путей. Концепция описывает закономерности участия метаболитов оксида азота в поддержании аллергического воспаления с учетом активности воспаления (тяжесть, период болезни), тканевых и клеточных маркеров ремоделирования бронхов, цитокинопосредованной коммуникации (Th1/Th2-цитокины) и генотипа больного (NOS, GST).
Установленные в исследовании новые патогенетически важные молекулярные маркеры клинического полиморфизма бронхиальной астмы (генотип GSTT1*0/GSTM1*0 генов GST, генотипы СС и GC полиморфизма 954G/C гена NOS2) с позиции функциональности NOS и GST могут стать молекулярными мишенями для разработки новых терапевтических подходов персонифицированной патогенетической терапии и новых клеточных технологий в лечении бронхиальной астмы.
Важное практическое значение имеют результаты исследования, раскрывающие взаимосвязь закономерностей развития нитрозилирующего стресса с формированием клеточных и тканевых паттернов воспаления, в том числе ассоциированных с феноменом «терапевтическая резистентность».
Результаты исследований могут быть использованы при подготовке врачей-терапевтов, клинических фармакологов, пульмонологов, иммунологов-аллергологов, педиатров.
Положения, выносимые на защиту:
1. Нитрозилирующий стресс является одним из ведущих механизмов аллергического воспаления дыхательных путей при БА и характеризуется повышением образования нитритов (при легкой и среднетяжелой формах болезни) или 3-нитротирозина (при тяжелых формах болезни) в бронхиальном смыве, конденсате выдыхаемого воздуха. Преимущественное повышение нитритов в бронхиальном смыве ассоциировано с увеличением плотности эозинофильного инфильтрата в бронхобиоптатах. Преимущественное повышение 3-нитротирозина - с увеличением содержания нейтрофилов, снижением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и базальных эпителиоцитов, снижением относительного объема железистой ткани, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани.
2. Участие гена NOS2 в регуляции продукции метаболитов оксида азота является базисным механизмом развития и поддержания аллергического воспаления. Уровень мРНК NOS2 снижается у больных после стандартной противовоспалительной терапии с использованием глюкокортикостероидов в течение 6 месяцев. Повышенный уровень экспрессии NOS2 ассоциирован с увеличением содержания как нитритов, так и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве и в конденсате выдыхаемого воздуха.
3. Полиморфизм генов GST ассоциирован с дефицитом нитрозоглутатиона и избирательным накоплением 3-нитротирозина в дыхательных путях при аллергическом воспалении, что является фактором риска формирования тяжелой БА в связи с развитием специфического паттерна воспаления - ремоделирования дыхательных путей. Развитие необратимого ремоделирования слизистых бронхов, ассоциированное с повышенным уровнем 3-нитротирозина и низким уровнем нитрозоглутатиона, определяет участие нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма БА.
Апробация и реализация работы
Основные результаты работы обсуждены на XVI Европейском респираторном конгрессе (Мюнхен, 2006), представлены на конгрессе терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2009), 18 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), 19 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), 4 национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на конгрессе педиатров России (Томск, 2009), на проблемной комиссии по патофизиологии, на теоретических семинарах кафедр патофизиологии, педиатрии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Диссертация апробирована на заседании апробационного совета НИИ фармакологии СО РАМН (Томск, 2010). Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биохимии и молекулярной биологии, госпитальной терапии, терапии ФУВ, педиатрии ФУВ, факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре биологии и химии Камчатского государственного университета имени Витуса Беринга, на кафедре иммунологии и аллергологии Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета.
В работе приводятся результаты исследований, выполненных при поддержке грантов 6ой рамочной программы Евросоюза GABRIEL, РФФИ 0904-99121-р_офи и ФЦП ГК № 02.512.11.2281.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 10 полнотекстовых статей - в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста, содержит 94 таблицы, 49 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследования, результатам собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель содержит 376 источников литературы, из которых 79 отечественных и 297 зарубежных.
![Течение бронхиальной астмы в зависимости от полиморфизма гена ADRB2 Arg16Gly [Электронный ресурс]](/i/i/4458/194817.png "Течение бронхиальной астмы в зависимости от полиморфизма гена ADRB2 Arg16Gly [Электронный ресурс] Саркисян Левон Камоевич")
