Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Одной из важных проблем физиологии и патофизиологии беременности является выяснение механизмов обеспечения своевременного и адекватного развития плаценты и децидуальной оболочки матки. В процессе подготовки эндометрия к имплантации бластоцисты происходит усиленная миграция клеток иммунной системы, в значительной степени моноцитов и NK-клеток, в эндометрий матки. В дальнейшем клетки иммунной системы матери контролируют многие этапы имплантации бластоцисты, развития плаценты и жизнеобеспечения плода. Однако молекулярно-клеточные механизмы формирования уникального адаптационного клеточного окружения вокруг плода остаются предметом изучения.
Функциональное состояние эндотелиальных клеток (ЭК) и их взаимодействие с моноцитами периферической крови, целостность эндотелиальной выстилки сосудов во многом определяют физиологическое развитие плаценты благодаря контролю диапедеза клеток иммунной системы и формированию иммунологической толерантности в системе мать-плод. С течением беременности количество клеток иммунной системы, мигрирующих в плаценту, изменяется, однако молекулярные механизмы регуляции привлечения их в зону маточно-плацентарного контакта остаются недостаточно изученными. После миграции в плаценту и децидуальную оболочку лимфоциты и моноциты\макрофаги за счет секреции цитокинов осуществляют аутокринную и паракринную регуляцию функций клеток микроокружения, оказывая влияние в том числе и на ЭК. Физиологическое развитие плаценты во многом зависит от обеспечения адекватного кровоснабжения плода, а ЭК являются активным участником ангиогенеза. Контроль процессов ангиогенеза обеспечивается благодаря сбалансированной секреции цитокинов и ростовых факторов клетками плаценты [Kaufmann P., 2004], среди которых основными продуцентами являются плацентарные макрофаги, NK-клетки, макрофаги децидуальной оболочки матки, эндотелиальные клетки и клетки трофобласта [Forbes K., 2010]. Однако влияние цитокинов, секретируемых клетками плаценты, при физиологической беременности на функции ЭК, характеристики адгезионной способности моноцитов, миграцию мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту во многом не ясны. Нарушение баланса ростовых факторов и цитокинов в плаценте приводит к дисфункции ЭК, снижению их жизнеспособности и нарушению развития сосудистой сети плаценты [Noori M., 2010]. Одним из последствий таких местных и системных патологических изменений является развитие гестоза у беременных женщин. Гестоз – одно из наиболее тяжелых осложнений беременности, характерными звеньями патогенеза которого являются гипертензия, протеинурия и задержка жидкости в организме женщины [Айламазян Э.К., 2008]. Эндотелиальная дисфункция играет главную роль в патогенезе гестоза [Айламазян Э.К., 2008]. Гестоз сопровождается развитием местного воспаления с наличием мононуклеарных инфильтратов в плаценте [Irminger-Finger I., 2008] и недостаточным развитием сосудистой сети плаценты. Однако в настоящее время молекулярные механизмы реализации патологического изменения межклеточных взаимодействий в плаценте при развитии гестоза неизвестны. Недостаточно данных о влиянии факторов, секретируемых клетками плаценты при гестозе, на функциональное состояние моноцитов, ЭК и их способность контролировать миграцию мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту.
Целью работы явилась оценка изменения функциональных характеристик эндотелиальных клеток линии EA.hy926 и особенностей их взаимодействия с моноцитоподобными клетками линии ТНР-1 в присутствии факторов, секретируемых плацентой при физиологической беременности и беременности, осложненной гестозом.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ секреции молекул, контролирующих ангиогенез (PlGF, MMP-2, MMP-9, Ang-1, Ang-2), клетками плаценты на ранних и поздних этапах ее развития при физиологически протекающей беременности, а также при беременности, осложненной гестозом.
-
Сопоставить продукцию секреторных вариантов поверхностных молекул sFas, sFasL, sTRAIL, sVEGFR-1, адгезионных молекул лейкоцитарного и эндотелиального происхождения (sVE-cadherin, sE-Selectin, sICAM-3, sPECAM-1, sP-Selectin, sVCAM-1) клетками плаценты и их содержание в сыворотке периферической крови у женщин с физиологическим течением беременности и при беременности, осложненной гестозом.
-
Оценить влияние факторов, секретируемых клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при беременности, осложненной гестозом, на изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 и их миграционную активность.
-
Изучить влияние факторов, секретируемых клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при беременности, осложненной гестозом, на секрецию эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 хемокинов (IL-8, MCP-1, RANTES) и ростовых факторов (VEGF, bFGF, ангиогенина), а также экспрессию ими адгезионных молекул и рецепторов цитокинов.
-
Провести сравнительную оценку влияния факторов, секретируемых клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при гестозе, на адгезию и трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии THP-1.
-
Изучить влияние препарата на основе магния аспарагината (ООО «НФФТ «Полисан») на изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.Hy926.
Научная новизна. Проведен анализ секреции растворимых факторов клетками плаценты и их влияния на свойства эндотелиальных клеток линии EA.hy926. Впервые показано изменение фенотипических и функциональных характеристик эндотелиальных клеток линии EA.hy926 под влиянием факторов, секретируемых клетками плаценты на разных этапах физиологически протекающей беременности и при гестозе. Обнаруженная модификация функциональных и фенотипических характеристик эндотелиальных клеток линии EA.hy926, выраженная в изменении экспрессии адгезионных молекул и рецепторов для цитокинов, секреции цитокинов, изменении количества и миграционной активности эндотелиальных клеток, может отражать механизмы участия эндотелиальных клеток в регуляции ангиогенеза и привлечении лейкоцитов из периферической крови в плаценту и децидуальную оболочку матки в условиях in vivo. Впервые выявлены возможные механизмы патологической активации эндотелиальных клеток при гестозе, а также показано, что факторы, секретируемые плацентой при наличии у женщины гестоза, способны усиливать трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 через монослой клеток линии EA.hy926, что в условиях in vivo может способствовать развитию воспаления в плаценте.
Теоретическая и практическая значимость работы. Основными источниками цитокинов на протяжении всей беременности в децидуальной оболочке матки и плаценте являются клетки иммунной системы. Факторы, секретируемые плацентой в первом и третьем триместре физиологической беременности, различным образом изменяют фенотип и функциональные характеристики эндотелиальных клеток, контролируют активность трансэндотелиальной миграции моноцитов и изменение экспрессии поверхностных адгезионных молекул моноцитов в ходе трансэндотелиальной миграции.
Полученные данные отражают роль некоторых поверхностных молекул эндотелиальных клеток в определении интенсивности специфической миграции моноцитов в децидуальную оболочку и плаценту при физиологической беременности и при гестозе. Выявленные изменения позволяют предположить роль цитокинов, ростовых факторов и других молекул, секретируемых клетками плаценты, в регуляции функционального состояния эндотелиальных клеток децидуальной оболочки и плаценты в условиях in vivo.
Впервые выявлен повышенный уровень трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии факторов, секретируемых плацентой при гестозе, сопровождающийся повышенной экспрессией CD11b моноцитами и молекулы CD119 (рецептора IFN) эндотелиальными клетками, что указывает на участие этих молекул в развитии воспаления в плаценте при гестозе. Факторы, секретируемые плацентой при гестозе, снижают количество и миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926, что может являться механизмом нарушения ангиогенеза в плаценте in vivo и индукции системной эндотелиальной дисфункции вследствие изменения секреторной активности клеток иммунной системы.
Предложен метод оценки биологической активности фармацевтических препаратов, предназначенных для коррекции эндотелиальной дисфункции, по определению их влияния на изменение количества эндотелиальных клеток.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Факторы, секретируемые клетками плацент женщин в первом триместре физиологической беременности, изменяют фенотип эндотелиальных клеток линии EA.hy926, стимулируют экспрессию СD11а и трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1, усиливают миграционную активность эндотелиальных клеток и способствуют увеличению их количества. В условиях in vivo подобное влияние факторов, секретируемых клетками плаценты, на эндотелиальные клетки способно обеспечить физиологическое развитие сосудистого русла плаценты, в том числе за счет привлечения в децидуальную оболочку и плаценту моноцитов\макрофагов, контролирующих процессы ангиогенеза и инвазии трофобласта.
-
Факторы, секретируемые плацентой женщин в третьем триместре физиологической беременности, снижают интенсивность трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии THP-1, а также экспрессию адгезионных молекул CD62P и CD54 эндотелиальными клетками линии EA.hy926 и экспрессию CD11a моноцитоподобными клетками линии ТНР-1. Подобное изменение фенотипа и функциональной активности эндотелиальных клеток плаценты и децидуальной оболочки под влиянием секреторных продуктов плаценты может способствовать физиологической стабилизации сосудистого русла плаценты и снижению миграции мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту к концу беременности. В третьем триместре беременности сниженная продукция плацентой как проангиогенных, так и антиангиогенных факторов, определяет сниженную интенсивность миграции эндотелиальных клеток линии EA.hy926 и сниженное их количество.
-
Факторы, секретируемые плацентой при беременности, осложненной гестозом, индуцируют повышенную трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1, сопровождающуюся усиленной экспрессией молекулы CD119 эндотелиальными клетками и усиленной экспрессией адгезионной молекулы CD11b моноцитоподобными клетками, что свидетельствует об участии этих молекул в индукции воспаления в плаценте при гестозе в условиях in vivo. Отмеченные изменения фенотипа эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в присутствии секреторных продуктов плацент при гестозе, сопровождается снижением миграционной активности и количества эндотелиальных клеток, и могут лежать в основе индукции системной эндотелиальной дисфункции при гестозе.
-
Изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.hy926 может служить тест-системой для скрининга препаратов, предназначенных для терапии гестоза.
Реализация работы. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 9 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке, обобщении и анализе полученных результатов, подготовке статей. Методическая помощь была оказана в.н.с. отдела иммунологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН Стариковой Э.А. при освоении методов оценки миграционной активности ЭК и трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на XII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» (Санкт-Петербург, 2009), на Втором Международный конгрессе по иммунологии (Берлин, Германия, 2009), X юбилейном всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009), XVI Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010), I ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2010» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), XVII межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011), Международном студенческом медицинском конгрессе (ISCOM 2011) (Гронинген, Голландия, 2011), XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), V Российской конференции по иммунологии репродукции (Иваново, 2012), III ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2012» (Санкт-Петербург, 2012), III Европейском конгрессе по иммунологии (Великобритания, Глазго, 2012).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов, полученные результаты, обсуждение, общее заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Текст диссертации изложен на 181 странице, содержит 24 таблицы, 21 рисунок и 4 приложения. Список литературы состоит из 296 работы, из них 43 работ принадлежит отечественным авторам и 253 - зарубежным.
![Характеристика цитокинового статуса и регуляторных Т-клеток при физиологической беременности и гестозе [Электронный ресурс]](/i/i/4382/205395.png "Характеристика цитокинового статуса и регуляторных Т-клеток при физиологической беременности и гестозе [Электронный ресурс] Дударева Алла Витальевна")