Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 9
1.1 Целлюлоза и ее структурные производные 9
1.2 Анионные производные целлюлозы и физико-химические свойства их водных растворов 1.2.1 Карбоксиметилцеллюлоза 12
1.2.2 Сульфаты целлюлозы 14
1.2.3 Смешанные сульфатированные эфиры целлюлозы 19
1.2.4 Фосфорилированные производные полисахаридов 21
1.2.5 Физико-химические свойства растворов анионных производных целлюлозы 22
1.3 Кооперативные процессы в растворах углеводсодержащих поли- 25
меров
1.3.1 Кооперативный конформационный переход полимеров в растворе 25
1.3.2 Интерполимерные взаимодействия с участием углеводсодержащих полимеров 31
1.3.3 Взимодействие анионных полисахаридов с белком 34
1.5 Биологическая активность сульфатированных полисахаридов, связанная с кооперативными взаимодействиями 36
Заключение 44
ГЛАВА 2 Экспериментальная часть 46
2.1 Общие методы анализа целлюлозы и ее производных 46
2.2 Методы модификации целлюлозы
2.2.1 Получение порошковых целлюлоз 47
2.2.2 Получение промежуточных производных целлюлозы 48
2.2.3 Получение сульфатированных производных целлюлозы 49
2.3 Исследование кооперативных взаимодействий анионных полиса харидов 51
2.3.1 Исследование конформаций цепи в растворе сульфатированных производных целлюлозы
2.3.2 Исследование интерполимерных реакций 53
2.4.1 Исследование комплексообразования анионных полисахаридов с биологическими объектами 53
2.4.2 Определение ЛД50 и стистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3 Результаты и их обсуждение 3.1
Модификация целлюлозосодержащих материалов з
3.1.1 Исходные целлюлозные материалы 5 5
3.1.2 Функциональный состав и химическое строение ПІД
3.2.1 Сульфаты целлюлозы и их физико-химические свойства 60
3.2.2 Сульфатирование препаратов ПЦ, полученных каталитической деструкцией кислотами Льюиса 65
3.2.3 Сульфаты карбоксиметилцеллюлозы и их физико-химические свойства 71
3.2.4 Сульфаты амидоэтилцеллюлозы и их физико-химические свойства 80
3.2.5 Сульфаты фосфорилированной целлюлозы и их физико-химические свойства 86
3.3 Кооперативные взаимодействия с участием сульфатированных производных целлюлозы 93
3.3.1 Потенциометрическое исследование конформаций цепи в растворе сульфатированных производных целлюлозы содержащих до полнительные (карбоксильные, фосфатные) функциональные группы 93
3.4 Интерполимерные реакции с участием анионных полисахаридов 105
3.4.1 Интерполимерные реакции сульфатированных полисахаридов с ПЭГ 105
3.4.2 Исследование ИПР анионных полисахаридов с полипептидом 114
3.5 Комплексообразование анионных полисахаридов с биологическими объектами 120
120
3.5.1 Комплексообразование анионных полисахаридов с липидами крови
3.5.2 Комплексообразование с клеточной стенкой 123
Выводы 130
Список литературы 132
4 Приложение 140
4.1 Спектрограммы и хроматограммы сульфатированных производных целлюлозы
- Смешанные сульфатированные эфиры целлюлозы
- Получение сульфатированных производных целлюлозы
- Сульфаты амидоэтилцеллюлозы и их физико-химические свойства
- Спектрограммы и хроматограммы сульфатированных производных целлюлозы
Введение к работе
Актуальность работы
На сегодняшний день подтверждена высокая и разнообразная биологическая активность сульфатированных полисахаридов как природных (гепарин, фукоидан) так и полусинтетических - производных хитозана, полигалактоуронана, целлюлозы и некоторых других. Благодаря высокой биосовместимости, доступности, целлюлоза, и особенно ее структурные модификации – порошковые целлюлозы, являются перспективной основой для получения сульфатированных полисахаридов и их последующего внедрения.
В целях повышения эффективности применения производных целлюлозы, понимания их физиологической активности необходимо глубокое изучение физико-химических свойств этих веществ, поведения этих полимеров в водной среде, ионизационных равновесий и термодинамических параметров кооперативных конформационных переходов макромолекул сульфатированых полимеров в растворе.
Поэтому, исследование физико-химических свойств этих соединений, установление их связи со структурой, природой дополнительных заместителей и молекулярной массой, приобретает особое значение.
Различными исследованиями установлено, что биологическая активность сульфатированных полисахаридов во многом связана с кооперативными реакциями комплексообразования между отрицательно заряженной цепью сульфатированного полисахарида (макроанионом) и положительно заряженными поверхностями белков. По этой причине актуальным для целенаправленного создания препаратов медицинского назначения на основе сульфатированных полисахаридов остается исследование их комплексообразующей способности с биологическими объектами, белками, синтетическими и полусинтетическими поликатионами, исследование факторов влияющих на образование и устойчивость подобных комплексов методами физической химии. Эти исследования имеют значение для создания на основе полимер – полимерных комплексов с участием сульфатированных полисахаридов и средств транспорта лекарств, и самостоятельных лекарственных средств.
Работа выполнена в соответствии с тематическими планами НИР Института химии КНЦ УрО РАН по теме «Структурная организация и физико-химические свойства природных полисахаридов и лигнинов - перспективных биополимеров для создания новых материалов» и при частичной финансовой поддержке программы «Фундаментальные науки - медицине».
Цель работы
Изучение влияния структуры продуктов деструкции целлюлозы на их реакционную способность в полимераналогичных превращениях, физико-химические свойства их полифункциональных сульфатированных производных и кооперативных взаимодействий с их участием.
Основные задачи: 1) Изучить строение, физико-химические свойства продуктов деструкции и полимераналогичных превращений целлюлозы. 2) Исследовать изменения термодинамических параметров при кооперативных конформационных переходах сульфатированных сульфатированных производных целлюлозы содержащих дополнительные (карбоксильные, фосфатные) функциональные группы. 3) Исследовать интерполимерные кооперативные реакции полифункциональных сульфатированных производных целлюлозы с полиэтиленгликолем и белковым полимером. 4) Исследовать связь между структурой полученных полимеров, их способностью к кооперативным взаимодействиям с белоксодержащими объектами природного происхождения и их биологической активностью.
Научная новизна
Изучены физико-химические свойства впервые синтезированных препараты сульфата цианоэтил-, амидоэтилцеллюлозы, сульфата фосфорилированной целлюлозы, а также сульфатов целлюлозы на основе порошковых целлюлоз, полученных методом каталитической деструкции в среде органических растворителей. Показано влияние способа получения и надмолекулярноной структуры порошковых целлюлоз на их активность в реакциях сульфатирования, физико-химические свойства получаемых производных.
Методами потенциометрического титрования и капиллярной вискозиметрии показано образование компактных вторичных структур в растворах сульфатированных производных целлюлозы; дана количественная оценка изменения энергии Гиббса, энтальпии и энтропии кооперативного конформационного перехода сульфатированных производных целлюлозы;
Установлено, что сульфаты целлюлозы, содержащие дополнительные (карбоксилметильные, амидоэтильные, фосфатные) группы участвуют в интерполимерных реакциях с препаратами полиэтиленгликоля и белковых полимеров. Показано влияние молекулярной массы поликатионов и температуры на степень превращения этих реакций.
Определено, что сульфаты целлюлозы с дополнительными функциональными группами на основе порошковых целлюлоз способны к комплексообразованию со сложными белковыми структурами и обладают свойствами гиполипидеметиков, а также обладают способностью избирательному ингибированию клеточной адгезии в зависимости от природы дополнительного заместителя.
Практическая значимость работы
Получены высокозамещенные сульфатированные производные на основе порошковых целлюлоз включающие в свою структуру различные дополнительные (карбоксиметильные, эмидоэтильные, фосфатные) группы. Показана перспективность использования ПЦ, полученных различными методами, для синтеза сульфатированных производных целлюлозы. Показано, что полианионы на основе целлюлозы являются перспективными компонентами гидрофильных полиэлектролитных комплексов. Комбинированные сульфатированные производные целлюлозы, содержащие дополнительные (карбоксильные, амидоэтильные, фосфатные) группы, полученные на основе ПЦ, могут служить основой для производства препаратов медицинского назначения.
Защищаемые положения
-
Результаты изучения влияния структуры ПЦ на их активность в процессах полимераналогичных реакций целлюлозы и физико-химические свойства получаемых продуктов.
-
Результаты определения изменения энергии Гиббса, энтальпии и энтропии кооперативных конформационных переходов сульфатированных производных.
-
Результаты исследования интерполимерных взаимодействий сульфатированных производных целлюлозы с полиэтиленгликолем, белковым полимером.
-
Результаты исследования комплексообразования сульфатированных производных целлюлозы с белоксодержащими объектами природного происхождения.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были доложены на 15 Коми республиканской молодежной научной конференции (г. Сыктывкар, 2004 г.); на 11 международной научно-технической конференции «эфиры целлюлозы и крахмала: синтез, свойства, применение» (г. Владимир, 2007 г.); III Всероссийской конференции «новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г.Барнаул, 2007 г.); 4th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (with international participation) «Modern problems of polymer polymerscinse». Saint-Petersburg, 2008; на симпозиуме с международным участием «проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям севера». По результатам проведенных исследований опубликовано 6 статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК) и тезисы пяти докладов.
Структура и объем работы
Диссертационная работа общим объемом 140 страниц состоит из введения, 3 глав: литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и приложения; содержит 13 таблиц, 56 рисунков. Список литературы включает 126 наименований.
В первой главе проведен анализ литературных источников, посвященных общему состоянию проблем получения сульфатированных полисахаридов растительного происхождения. Рассмотрены сведения по физико-химическим свойствам растворов водорастворимых производных целлюлозы. Обзор содержит анализ работ по изучению кооперативных конформационных переходов полимеров в растворе, а так же по интерполимерным реакциям с участием углеводсодержащих полимеров. Рассмотрены современные представления о роли кооперативных взаимодействий в проявлениях разнообразной физиологической активности, связанной с комплексообразованием сульфатированных полисахаридов и белковых тел. Во второй главе приведены экспериментальные методы, использованные в данной работе. Третья глава посвящена обсуждению и анализу результатов экспериментов.
Смешанные сульфатированные эфиры целлюлозы
Интерес к производным целлюлозы, содержащим в структуре несколько типов функциональных групп основан на стремлении придать материалу новые, уникальные свойства. Кроме того, некоторые распространенные в природе сульфатированные полисахариды, играющие исключительную роль в биологических процессах, содержат в своем составе несколько типов ионо-генных групп. Так, гепарин и его производные, имеющие исключительное значение в медицинской практике, представляют собой полисахариды, вклю-чающе сульфатные, карбоксильные и аминные группы.
Известны смешанные эфиры целлюлозы, содержащие неионогенные группы. Например, сульфаты - ацетаты целлюлозы (САЦ) были получены при этерификации целлюлозы смесью серной кислоты и уксусного ангидрида [14]. В продолжение этих работ показано, что сульфатные группы базируются в основном при первичном углеродном атоме элементарного звена, а интересные реологические свойства САЦ определяются балансом гидрофильных сульфатных и гидрофобных ацетатных групп [15].
Большое внимание исследователями уделено получению и изучению свойств производных целлюлозы полиамфолитной природы. Для синтеза таких производных были использованы различные методы. Синтез сульфатов целлюлозы содержащих аминогруппы описан в работах [30, 31]. Такие производные были получены взаимодействием сульфатов целлюлозы с З-хлор-2-гидроксипропил-триметиламмоний хлоридом в водной среде в присутствии гидроксида натрия. А так же сульфатированием и карбоксиметилированием аминосодержащих производных целлюлозы, полученных нуклеофильным замещением тозилатов целлюлозы [32].
Сульфаты карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ) Сочетание в структуре целлюлозного полимера двух различающихся по константам диссоциации типов анионных заместителей - сульфатной группы (остаток сильной кислоты) и карбоксиметильной группы (остаток более слабой кислоты), представляет значительный интерес. Введение таких заместителей в целлюлозу может быть осуществлено несколькими способами, поочередно или совместно.
Наиболее эффективная методика сульфатирования карбоксиметилцел-люлозы описана авторами [33]. Ими предложен метод активации КМЦ-Na путем ее предобработки и-толуолсульфоновой кислотой в N,N-диметилацетамиде. Подобная предобработка приводит к сильному набуханию полимера, что делает возможным сульфатирование целлюлозы в мягких условиях. По этому методу получены сульфаты целлюлозы со степенью замещения вплоть до предельной.
Для синтеза СКМЦ с заданным положением заместителей, в работе [34] описан метод карбоксиметилирования СЦ с сульфатной группой при Сб. Процедура карбоксиметилированя осуществляется известным методом с применением монохлоруксусной кислоты и гидроксида натрия в среде воды и шо-пропилового спирта. Соединение, структура которого подтверждена методом ЯМР С спектроскопии, содержит карбоксиметильную группу при С2- Степень замещения по сульфатным группам составила 1.0, по карбокси-метильным группам 0.9.
Авторами работы [35] предложен способ одновременного введения сульфатной и карбоксиметильной группы в структуру целлюлозы. Для этого предлагается использовать обработку целлюлозы смесью монохлоруксусной и фторсульфоновой кислотами в присутствие щелочи. Реакция осуществляется в водной среде. Полученные по этому способу препараты СКМЦ имели степень замещения по сульфатным группам до 0.7, по карбоксиметильным группам до 0.9. 1.2.4 Фосфорилированные производные полисахаридов
Фосфорилированные полисахариды привлекают внимание исследователей по нескольким причинам. Во-первых, как вещества с потенциально высокой биологической активностью. Широко известно, что объекты биологического происхождения содержат множество соединений, имеющих в своем составе фосфатные группы. Сюда относят фосфолипиды, нуклеотиды, фосфаты Сахаров [36]. Во-вторых, и это в значительной степени касается целлюлозы, фосфорилированные производные которой обладают ценными свойствами - такие материалы являются антипиренами, а благодаря катионообмен-ным свойствам находят применение в промышленности и медицине [37]. Большое значение, как вспомогательный материал в фармакопее и пищевой промышленности, имеет фосфорилированный крахмал [38].
Фосфорилирование полисахаридов может быть произведено различными методами. В работе [39] подробно рассматривается фосфорилирование крахмала, такими реагентами, как соли ортофосфорной кислоты и полифосфорных кислот. Фосфаты циклодекстрина получали авторы работы [40]. Для этого использовали раствор метафосфата натрия. Реакцию проводили при 90 С.
Повышенное внимание было уделено фосфорилированию целлюлозы. Предложено фосфорилировать целлюлозу фосфористой кислотой [41]. Авторами работы исследовано три метода: синтез в расплаве фосфористой кислоты, в среде органического растворителя, в качестве которого использовали ДМФА и о-ксилол, а также в среде инертного газа. Были получены препараты фосфитов целлюлозы с содержанием фосфора до 14 %. Недостатком предложенных методов является более или менее значительная деструкция целлюлозы. Фосфорилирование целлюлозы производили по реакции этери-фикации. В работе [42] для этой цели использованы в частности хлор- и фто-рэтилфосфиты. Полученные препараты содержали не более 8.5 % фосфора.
Наиболее распространено фосфорилирование целлюлозы фосфорной кислотой в присутствии мочевины (изоциановой кислоты) и действием РОСЬ, обычно в среде пиридина. Первый из указанных методов позволяет получать фосфаты целлюлозы различных степеней замещения. Реакция может быть осуществлена как при нагревании, с получением заметно деструктированных продуктов, так и в более мягких условиях. Одна из методик получения фосфатов целлюлозы этим методом подробно изложена в работе [43]. Полученные препараты содержали до 4 % фосфора. В этой же работе предложен метод фосфориллирования целлюлозы фосфорной кислотой в присутствии ок-сихлорида фосфора, а так же другие методы. В частности, метод фосфорили-рования РОСІз в растворе пиридина или диоксана. Исследовали так же фос-фориллирование в этой смеси растворимых в пиридине производных целлюлозы - этилцеллюлозы и ацетатов целлюлозы. В случае целлюлозы, полученные препараты содержали до 8.8 % фосфора, а при использовании растворимых производных целлюлозы до 3.4 %. Данная методика, с некоторыми модификациями, была использована в работе [44].
Для получения фосфатов целлюлозы был использован раствор фосфорного ангидрида в ДМФА и МКЦ в качестве исходного материала [45]. Авторами отмечено значительное влияние на степень фосфорилирования температуры реакции и количества этерифицирующего агента. Были получены фосфаты целлюлозы со степенью замещения до 0.34. Показано, что фосфо-рилирование целлюлозы в этой системе происходит через стадию образования ненасыщенных связей в целлюлозе. Методом потенциометрического титрования найдено, что фосфатные группы представлены в виде моноза-мещенных фосфатов 22.1 %, двухзамещенных 25.7 % и трифосфатов 52.2 %.
Получение сульфатированных производных целлюлозы
Деструкцию целлюлозы, выделенной из древесины лиственных пород, осуществляли в водном растворе состава 1.0 % пероксида водорода, 10 % серной кислоты, целлюлозы выделенной из льна - перуксусной кислотой (10 %-ный водный раствор). Деструкцию проводили при температуре кипения смеси в течение двух часов. Затем полученные препараты отделяли на фильтре, промывали до нейтральной реакции дистиллированной водой, инк-людировали ацетоном и сушили на воздухе при комнатной температуре. Для получения ПЦ каталитической деструкцией с использованием кислот Льюиса использовали метод, подробно изложенный в [105].
ПЦ-МКЦ представляет собой коммерческий препарат, полученный кислотным гидролизом волокон хлопковой целлюлозы. Данный препарат выпускается для пищевых и медицинских целей ЗАО «Полиэкс» г. Бийск, под торговой маркой «Анкир-Б», согласно ТУ 64-11-124-90.
Лиственная сульфатная целлюлоза (ВЦ) производства ОАО «МБП Сыктывкарский ЛПК». Предварительная подготовка целлюлозных препаратов к работе состояла в удалении минеральных соединения обработкой 1 н соляной кислотой, а затем водой до нейтральной реакции. Препарат обезвоживали ацетоном и сушили до постоянной массы при 103С.
МКЦ (10 г, 61.73 ммоль) активировали в 20 см 40 %-го раствора NaOH. Суспензию перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температу-ре. Затем прибавляли 20 см изо-пропанола и термостатировали смесь 30 мин при 55С. После этого вносили раствор монохлоруксусной кислоты в 20 см изо-пропанола. Продолжительность реакции: 3 ч при 55 С или 2 ч при 80 С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали водным этанолом. Полученную КМЦ-Na очищали в аппарате Сокслета (экстракция 60 %-ным водным этанолом до нейтральной реакции промывных вод и отрицательной реакции на ионы СГ). В форму свободной кислоты (КМЦ-Н) натриевую соль КМЦ переводили обработкой 10 %-ным раствором соляной кислоты с последующей отмывкой продукта дистилированной водой, иклюдирова-ли ацетоном и сушили в вакууме при 60 С. Цианэтилцеллюлоза (ЦЭЦ) Целлюлозу (10 г., 61.73 ммоль) диспергировали в 4 % -ном водном растворе NaOH и термостатировали 30 мин. при 40 С. Суспензию охлаждали до 5 С, при перемешивании вносили акрилонитрил. Реакцию проводили в течение 3 ч при постепенном повышении температуры до 40 С, после чего продукт отделяли на фильтре, промывали большим количеством воды, затем этанолом и сушили в вакууме при 60 С.
Сульфат целлюлозы получали сульфатированием в системе пиридин -хлорсульфоновая кислота. Образец порошковой целлюлозы (1.00 г; 6.17 ммоль), предварительно высушенный до постоянной массы при 103 С суспендировали в пиридине при 0 С. Охлаждая и интенсивно перемешивая ре-акционнонную смесь, в нее по каплям вносили хлорсульфоновую кислоту (3 экв. на ангидроглюкозную единицу). После термостатирования в течении 1 ч при 90 С реакцию продолжали в течении 2 ч при 80 С. Продукт отфильтро-вывали на стеклянном фильтре, промывали 20 см ацетона и растворяли в 50 см 4 %-го NaOH. Образовавшуюся натриевую соль сульфата целлюлозы (СЦ-Na) осаждали 100 см этанола, промывали водно-этанольной смесью от неорганических солей и сушили в вакууме.
Сульфат карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ) получали модификацией метода [33]. Высушенный до постоянной массы образец КМЦ-Na (1.0 г) суспендировали в 10 см3 ДМФА. При интенсивном перемешивании и охлаждении до 5 С добавляли безводную и-толуолсульфоновую кислоту (1 экв. на карбоксильную группу полимера) и термостатировали 0.5 ч при 60 С. Затем колбу с сильно набухшим полимером охлаждали до 0 С, добавляли по каплям хлорсульфоновую кислоту (2 экв. на мономерное звено) и оставляли на 3 ч при комнатной тепературе. Для выделения полимера к охлаждённой реакционной смеси прибавляли 20 см3 безводного ацетона. Осадок отфильтровывали, обрабатывали водным раствором гидроксида натрия. Из полученного раствора этанолом осаждали СКМЦ-Na, полимер отделяли, промывали водно - этанольной смесью для очистки от неорганических солей и сушили в вакууме при 60 С.
Сульфат цианоэтилцэллюлозы (СЦЭЦ) и амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ). Для сульфатирования цианэтилцеллюлозы (C3CN= 0.36) 1.0 г сухого об-разца растворяли в 10 см ДМФА и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Колбу с сильно набухшим и частично растворившимся полимером охлаждали до О С, по каплям прибавляли хлорсульфую кислоту (2 экв. на мономерное звено) и термостатировали при 20 С. По окончании реакции, охлаждая и перемешивая, реакционную смесь нейтрализовали насыщенным раствором ацетата натрия в этаноле. Осажденный полупродукт отделяли на фильтре, растворяли в 20 см раствора 3 %-го Н2О2 при рН = 10. Гидролиз нитрильных групп проводили в течение суток при комнатной температуре, после чего полимер осаждали этанолом (100 см ), отделяли на стеклянном фильтре и очищали диализом на целлофановых мембранах. Полученную САЭЦ-Na осаждали этанолом (150 см ) отделяли, промывали водно - этанольной смесью, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60 С.
Сульфат фосфата целлюлозы (СФЦ-Na). 1.0 г (6.17 ммоль) целлюлозы суспендировали в 10 см сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см3 сухого ДМФА растворяли 0.90 г (6.34 ммоль) Р2О5 и при охлаждении добавляли 0.22 г воды (12.22 ммоль). После перемешивания полученной смеси к ней по каплям прибавляли 1.43 г (12.27 ммоль) CISO3H обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0 - 5 С. Полученный раствор оставляли на 5 - 6 ч, после чего этерифицирующую смесь вносили к набухшей целлюлозе, перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50 С. По истечении этого строка, гомогенную реакционную смесь охлаждали до -10 С, диспергировали в 250 см3 холодного ацетона. Осадок отфильтровывали, диспергировали в 100 см холодной воды и нейтрализовали 4 %-ным NaOH по фенолфталеину. Полученный раствор диализовали на целлофановых мембранах против дистиллированной воды (до отрицательной реакции на сульфат - ионы); полимер осаждали этанолом и сушили в вакууме при 60 С.
Поучение солей производных целлюлозы с катионами Са +, СіГ+, Со +.
Для получения катионных форм различных производных целлюлозы использовали обработку Na - солей целлюлозных поликислот насыщенными растворами солей Са +, Сіґ+, Со2+. Типовая процедура: 1.00 г СЦ-Na оставля-ли в 5 см дистиллированной воды для набухания. Затем порциями прибавляли насыщенный раствор хлорида двухвалентного металла (так что бы общий объем смеси составил 30 см ). Катионообменную реакцию продолжали в течение 15 мин. при перемешивании, после чего полученную соль осаждали этанолом (50 см ), отделяли от избытка смеси, промывали водно-этанольным раствором от неорганических солей, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60 С. При необходимости, процедуру катионного обмена повторяли несколько раз.
Сульфаты амидоэтилцеллюлозы и их физико-химические свойства
Замена солеобразующего катиона Na на катион двухвалентного металла в кислотных группах СКМЦ, сильно отражается на ее реологических свойствах. Катионообменная реакция была осуществлена прибавлением концентри-рованной соли Со " или Си к натриевой соли СКМЦ. Полученную смешан-ную соль (Na , Me" ) осаждали и промывали водным этанолом от неорганических примесей. При однократной обработке указанным способом замещению подвергалась сравнительно небольшая часть катионов Na в кислотных группах. Например, таким способом были получены препараты СКМЦ-2 (СЗсоон= 0.12, СЗз 0.39), содержащие кроме Na - солей, так же соли Со" или Си" с долей замещения ионов Na соответственно 3 и 4 %. Продукты замещения представляли собой порошки, окрашенные в цвет неорганических солей катиона соответствующего металла - розовый для Со"+ и сине-зеленый для Си" . Эти Соли растворимы в воде при любой степени замещения катионов Na и плохо растворимы в присутствии низкомолекулярного электролита. При нагреве свыше 100 С разлагаются с деструкцией целлюлозной матрицы.
На рис. 3.14 (а) представлена зависимость Чпр- С для незамещенной Na-соли СКМЦ. Приведенная вязкость 1.0 %-го раствора составляет 266 см /г. Зависимость имеет вид, типичный для водных растворов СКМЦ-Na, с эффектом полиэлектролитного набухания в области низких концентраций, который сохраняется для препаратов СКМЦ при частичном замещении катионов натрия на катионы кобальта или меди (рис. 3.14 б и 3.14 в). Значения Чіір для 1.0 %-ных растворов снижаются до 163 и 93 см /г соответственно. С, г/смЗ-КГ
Таким образом, введение в структуру СКМЦ двухзарядных катионов снижает вязкость растворов этого производного целлюлозы. Наблюдаемые эффекты снижения гпр, наблюдаемые при постепенной замене катионов Na на катионы двухвалентных металлов, и показанные на примере препаратов СЦ, наблюдаются и в случае препаратов СКМЦ (рис. 3.14). В этом случае, кроме обмена катионов Na сульфатной группы, при описанной выше обработке солями двухвалентных металлов препарата
СКМЦ-Na, происходит обменная реакция с Na карбоксиметильной группы: 2R-CH2COONa + Ме2+ = R-CH2COO-Me-OOCH2C-R + 2Na+ Подытоживая, нами получены высокозамещенные производные целлюлозы, содержащие сульфатные и карбоксильные группы. Примененные для этого методы позволяют использовать различные исходные формы КМЦ. Наиболее эффективен из представленных, метод сульфатирования КМЦ-Na, с предварительной активировацией в смеси я-толуолсульфоновая кислота — ДМФА. Как и в случае СЦ, из сульфата КМЦ могут быть получены водорастворимые соли меди и других двухзарядных металлов.
Непосредственно после сульфатирования ЦЭЦ получали промежуточный продукт - сульфат цианэтилцеллюлозы (СЦЭЦ). Реакцию сульфатирования ЦЭЦ осуществляли в гомогенной среде благодаря растворимости препаратов ЦЭЦ в органических растворителях, в частности в ДМФА. Выход продукта составлял 0.5 - 0.7 г при массе навески ЦЭЦ 1.0 г.
Цианэтиловый эфир целлюлозы со C3CN — 0.14 хорошо набухает и затем частично растворяется в ДМФА. Растворы образцов ЦЭЦ с такой степенью замещения представляли собой вязкий гель, а более высоко замещенный препарат ЦЭЦ со C3CN растворялся в ДМФА при слабом нагревании. После прибавления хлорсульфоновой кислоты реакционная смесь и в том и в другом случае приобретала гомогенный состав. Сульфатирование осуществляли при комнатной температуре. Через час этерификации препарата со C3CN 0.36 был получен высокозамещенный сульфат СЦЭЦ (исходный для САЭЦ-1 и 4 табл. ЗЛО). Увеличение продолжительности реакции до 2 - 3 ч приводи ло к препаратам со степенью замещения близкой к 1.3. Причем по истечении 3 ч взаимодействия скорость реакции сильно замедлялась. Отмечали также, что препараты целлюлозы с более низкой степенью этерификации по цианэ-тильным группам были менее активны в реакции сульфатирования. Для ЦЭЦ со СЗсы — 0.14 после двух часов обработки получен препарат с C3s 0.83, а после 3 ч с C3s - 0.87, что так же свидетельствует о прохождении основной стадии сульфатирования за первые 1 - 2 ч. тельности реакции, приведено на рис. 3.16. Для препарата ЦЭЦ со C3CN = 0.36, высокая скорость сульфатирования наблюдается на протяжении 90 мин. и выражается линейной зависимостью скорости сульфатирования, до значения C3s = 1.2, по СО J еле чего, C3S возрастает незначительно и кривая выходит на плато после достижения максимальной C3s в пределах 1.4. Общая СЗ препарата СЦЭЦ при этом, по сульфатным и цианэтильным группам, составляет 1.76.
Для препаратов ЦЭЦ со СЗсы = 0.14, скорость накопления сульфатных групп заметно ниже (рис. 3.16 б) и при достижении C3s = 0.75 через 60 мин. после начала реакции, падает. Спустя 180 мин. после начала сульфатирования, получали препараты со C3S= 0.87.
Гомогенное сосстояние реакционной смеси способствует получению препаратов с высокой степенью сульфатирования и высокой первоначальной скорости сульфатирования, как это наблюдалось для препаратов СКМЦ (см. соответствующие разделы). Меньшая скорость сульфатирования для препаратов ЦЭЦ со C3CN= 0.14, по-видимому, связана с недостаточной доступностью реакционных центров препаратов для сульфатирующего агента, по 83 скольку препараты ЦЭЦ этой степени замещения лишь ограничено набухают в ДМФА. Известно, что хлорсульфоновая кислота образует с ДМФА активный комплекс состава 1 : 1 являющийся сульфатирующим агентом [23]. Скорость реакции определяется быстрым присоединением этого комплекса к активным реакционным центрам целлюлозы и последующей медленной перегруппировкой в сернокислый полуэфир целлюлозы и комплекс хлористый водород — ДМФА. Следовательно, более высокая доступность реакционных центров препаратов ЦЭЦ со C3CN= 0.36 определяет более высокие скорости присоединения комплекса к гидроксильным группам и получение более сульфати-рованных препаратов СЦЭЦ.
ИК спектр САЭЦ-Na 1626 см"1 (UCONH «амид 1»), 1240 см_1(и8о2), 814 см (t so) Типичный ИК - спектр САЭЦ-Na представлен на рис. 4.3 а. ЯМР 13С спектр (САЭЦ-Na, D20): сигнал для С6 отсутствует; 8 74.3 (С3), 6 73.5 (С2), 5 103.8 - 102.2 (С,); 5 178.5 (—С2Нг—CONH2); 5 36.9 и 37.5 (аСН2 и ЗСН2при CONH2), 5 83.8 и 68.6 (C-2S и C-6S). В области 70 - 73 м.д. может так же находится сигнал C-3S. Типичный ЯМР 13С - спектр САЭЦ-Na представлен на рис. 4.3 б.
Приведенная вязкость 1 %-ных водных растворов препаратов САЭЦ колеблется в пределах 35- 55 см3/г (табл. 3.10). Эти значения ниже чем для других сульфатированных препаратов целлюлозы (ср. с табл. 3.9).
Хотя препараты СЦЭЦ представляют значительный интерес для получения препаратов с потенциальной биологической активностью, целесообразна модификация нитрильных групп в менее токсичные — амидные или карбоксильные группы. Омыление нитрильных групп СЦЭЦ в разбавленных растворах щелочей проходит количественно при комнатной температуре.
Спектрограммы и хроматограммы сульфатированных производных целлюлозы
Данное обстоятельство, однако, не может являться однозначным доводом в пользу отсутствия ИПР с белковым поликатионом. Опираясь на предшествующие результаты, можно с уверенностью утверждать, что комплексо-образование препаратов СФЦ с белком вполне возможно. Предположительно, объемные фосфатные группы, с меньшим зарядом, препятствуют образованию компактной структуры и соответственно этим объясняется отсутствие минимума г)пр в случае смесей СФЦ - белок. Кроме того, при образовании комплекс СФЦ - белок должен сохранять высокую гидрофильность именно по причине высокого содержания фосфатных групп в виде Na-солей.
Таким образом, показано, что полученые полисульфаты принимают активное участие в интерполимерных реакциях с различными поликатионами. Такие анионные производные целлюлозы, как СЦ, СКМЦ, САЭЦ, образуют гидрофильные комплексы с препаратами денатурированного коллагена, что сопровождается снижением т11р растворов при добавлении белкового поликатиона. С увеличением отрицательного заряда макроцепи (содержания сульфатных групп) способность производного к связыванию с белком резко увеличивается: от 1.0 мг белка на мг сульфатированного полимера при C3s =1.0 до 6 - 7.0 мг на 1.0 мг сульфатированного полимера при более высоких степенях замещения или увеличения содержания других отрицательно заряженных групп, например карбоксильных. Образование многоточечных интерполимерных связей, в данном случае, происходит благодаря электростатическим силам.
Для исследования способности к образованию комплексов с биологическими объектами были использованы образцы сульфатированных производных целлюлозы, полусинтетических и природных анионных полисахаридов. Исследования выполнены на базе института физиологии КНЦ УрО РАН (г. Сыктывкар).
Образцы анионных полисахаридов перед постановкой опыта переосаждали из водных растворов прибавлением этанола, отделяли от маточного жидкости, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60 С.
Для исследования использована нормализованная сыворотка человеческой крови. Спектроскопический контроль взаимодействия анионных полисахаридов с липидами человеческой крови осуществлялось фотометрирова-нием проб в микробиологическом планшете. Концентрация полисахаридов 0.5 %. Функциональный состав и основные данные по исследуемым анионным полисахаридам сведены в табл. 3.20. Курсивом выделены образцы, представленные для сравнения.
Использованы следующие препараты анионных полисахаридов: СЦ-Na, СКМЦ-Na, СЦЭЦ-Na, САЭЦ-Na, КМЦ-Na, ВС-Н, Сульфат галактоуронана (далее BCso3-Na, предоставлен Ф. Витязевым, институт физиологии КНЦ УрО РАН), коммерческий препарат сульфата декстрана 3650 и 500-Na (далее СД 3650, СД 500). В качестве образца сравнения использован препарат неф-ракционированного гепарина (далее НФГ). Взаимодействие анионных полисахаридов с липидами крови, приводящее к образованию нерастворимого комплекса, сопровождается изменением оптической плотности раствора. Активность полисахарида в реакции характеризовали относительно активности гепарина, принятой за 100 % (рис. 3.46).
Среди сульфатированных производных целлюлозы наибольшую активность при образовании комплекса с липидами крови проявляет СЦ-4. Его активность относительно НФГ составляет 209 %. Сульфаты КМЦ, амидо-и цианоэтилцеллюлозы так же проявляют более высокую, чем НФГ активность, которая относительно НФГ составляет 120 - 130 %. Коммерческие высоко сульфатированные препараты СД различной молекулярной массы, проявляют хорошие комплексообразующие свойства. Препарат СД с Mw 500 проявляет активность наибольшую среди исследованных образцов (257 %). Сульфатированный препарат BCso3 проявляет комплексообразующую активность гораздо более высокую, чем исходный комплекс ВС (209 и 79 % соответственно).
Препараты анионных полисахаридов проявляют различную активность при взаимодействии с липидами крови. Наиболее активны сульфатированные препараты с высокой степенью замещения. Препараты низким содержанием сульфатных групп или не содержащие их, демонстрируют наименьшую активность.
Один из механизмов предотвращения сульфатированными полисахаридами эффекта «слипания» клеток, по-видимому, состоит в адгезии анионных полимеров на клеточную стенку, т.е. интерполимерное взаимодействие с белковыми участками клеточной мембраны (подробнее см. раздел 3.2.1-2). В этой связи, способность того или иного анионного полимера ингибировать клеточную адгезию, определяется его способностью к интерполимерному взаимодействию с полипептидом.
В качестве биологических объектов, для исследования взаимодействия анионных полисахаридов различного строения с поверхностью клеточной мембраны использованы клетки, выделенные из смыва брюшной полости белых мышей. Производные целлюлозы, содержащие карбоксильные группы, были использованы в виде полных Na - солей. Влияние анионных полисахаридов на адгезивность клеток контролировали методом фотометрии по изменению оптической плотности. Изучалось влияние, как на спонтанную клеточную адгезию, так и на адгезию активированную форболовым эфиром (форбол-12-миристат-13-ацетат).
