Содержание к диссертации
Введение
I. Виды селективных экспериментов и средства их реализации 8
1.1. Селективное возбуждение 8
1.2. Селективное подавление 12
1.2.1. Объемная дисперсия намагниченности. Стационарный метод 13
1.2.2. Предварительное насыщение 14
1.2.3. Облучение сигналов во время сбора данных 15
1.2.4. WEFT-методика 15
1.2.5. Методы с использованием импульсов большой длительности 18
1.2.6. Импульсная последовательность Редфилд 2-1-4 18
1.2.7. Импульсная последовательность Редфилд 2-1-4 с разделением по времени 19
1.2.8. Биноминальные импульсные последовательности 20
II. Селективные эксперименты ЯМР в химических исследованиях 22
II. 1. Селективные одномерные эксперименты 22
II.2. Селективные двумерные эксперименты 47
II.3. Двумерные эксперименты как новый этап развития одномерных методик ЯМР 70
III. Методы ЯМР, использующие селективные РЧ импульсы совместно с импульсными полевыми градиентами 83
III. 1. Импульсные полевые градиенты 84
III.2. Селек гивные импульсы 88
III.3. Гомоядерные методики 93
III.3.1. Селективный COSY-эксперимент 93
III.3.2. Селективный TOCSY-эксперимеш 97
III.3.3. Эхо-спектроскопия двойного импульсного полевого градиента 99
III.3.4. С-С эксперименты 107
III. 4. Гетероядерные методи ки 11'
IV. Основные принципы селективного двумерного эксперимента ЯМР 127
IV. I. Классическое описание мультиплетно-селективного возбуждения спиновой системы 128
IV. 1.1. Селективный двухимпульсный эксперимент 128
IV. 1.2. Селективный трехимпульсный эксперимент 133
IV.2. Квантово-механическая трактовка метода 134
1V.2.1. MUSEX COSY-эксперимент 134
IV.2.2. MUSEX EXSY-эксперимент 143
IV.3. Практические аспект і MUSEX метода 169
IV.4. Решение структурных задач 170
IV.5. Решение обменных задач 171
V. Векторный Операторный Формализм (ВОФ) для описания импульсных экспериментов ЯМР 172
VI. Селективная двумерная обменная спектроскопия ЯМР и ее применение к изучению молекулярных динамических процессов 176
VI. 1. MUSEX EXSY-эксперимент 176
VII. Приложение метода 2М МСВ к исследованию обменных процессов 186
VII. 1. Гомоядерная система 186
VII.2. Изучение механизма реакций вырожденного лигандного обмена комплексных соединений кадмия 188
Выводы 193
Литература 195
- Объемная дисперсия намагниченности. Стационарный метод
- Импульсная последовательность Редфилд 2-1-4 с разделением по времени
- Двумерные эксперименты как новый этап развития одномерных методик ЯМР
- Эхо-спектроскопия двойного импульсного полевого градиента
Введение к работе
Проблему решения задач структуры молекул и молекулярного движения методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) условно можно разделить на три основных этапа:
1. Отнесение химических сдвигов всех резонансных сигналов исследуемых образцов в спектрах ЯМР. Следует особо отметить, что частичное отнесение химсдвигов не обеспечивает полного решения конкретной динамической задачи. Здесь требуется полнота, подобно тому, как в математике решить уравнение - значит, найти множество его корней, то есть найти все решения данного уравнения. Отнесение химических сдвигов резонансных сигналов до сих пор остается сложной задачей. 2. Установление структуры, требующее для своего решения определения многих спектральных параметров, например: констант скоростей ядерной магнитной релаксации (всех резонансных пиков), межъядерных расстояний и других параметров в зависимости от сложности структуры конкретной молекулы. 3. Обменные задачи, однозначное решение которых является результатом успешного выполнения двух предыдущих этапов.
В наши дни большинство спектрометров ЯМР высокого разрешения работают в режиме Фурье-преобразования, при котором возбуждение создается мощными неселективными радиочастотными (РЧ) импульсами. Наиболее часто встречающейся проблемой при работе на таких спектрометрах является подавление резонансных сигналов растворителя. Поэтому возникает необходимость возбуждения одного ядра или одной спектральной линии спинового мультиплета без возмущения остальной части молекулы. После перехода импульсной Фурье-спектроскопии к своему новому этапу развития (двумерный эксперимент) роль и популярность селективных MS "одов стала быстро возрастать.
Альтсопатіївой селективному возбуждению может служить селективное подавление, которое наиболее часто используется как метод удаления нежелательных сигналов, например, интенсивных пиков растворителя. Селективное подавление может применяться и для наблюдения одного протонированного сигнала 13С в сложных молекулах посредством разностной спектроскопии.
Используя методы частотного селективного облучения, проблему подавления интенсивных пиков растворителя можно решить, либо подавляя резонанс растворителя, либо не возбуждая его. Ограничением для решения этой задачи являются случаи перекрывания спиновых мультиштетов в спектрах больших молекул. С появлением сверхпроводящих магнитов, обеспечивающих высокие магнит ые поля и позволяющих создавать промышленные спектрометры ЯМР повы ценного разрешения, эта проблема была решена. Иллюстрацией могут служить протонно-связанные спектры ядер 13С, так как даже в спектрах относительно простых молекул возможно существование довольно сильного перекрывания мультиплетных сигналов, что ограничивает исследование больших и сложных молекул. Когда гстероядерные спиновые связи ответственны за перекрывание мультиплетных структур, то методы селективного возбуждения позволяют успешно решать эту проблему. Широкополосное облучение приводит к устранению мультиплетной структуры сигнала наблюдаемого ядра, то есть к одиночному сигналу, положение которого в спектре тем самым однозначно определяется. При этом растет чувствительность за счет потери информации о связности ядер спиновой системы.
Знание химических сдвигов дает возможность расшифровывать сложные спектры больших молекул, что достигается путем простой комбинации селективного возбуждения и стробирующей развязки. При таком подходе каждый резонансный сигнал возбуждается селективно, затем устройство развязки выключается, что создает условия свободной прецессии резонансных линий мультиплетных сигналов, и Фурье-преобразование генешрует мультиплетные подспектры, соответствующие выбранному положению резонансного сигнала. Серия таких подспектров воссоздает обычный полный спектр со всей картиной связи. Дополнительную информацию относительно связности мультиплетных сигналов можно получить, используя методику селективного двойного резонанса, такую как селективный перенос населенности. Эти методы позволяют определить знаки констант спиновых связей, применяя "мягкие" селективные импульсы для облучения ядер, связанных с наблюдаемым ядром.
Другой областью применения селективного возбуждения является изучение механизмов магнитной релаксации. Кросс-релаксационные эффекты спин-решеточной релаксации протонов могут быть исследованы путем сравнения времени восстановления намагниченности после приложения селективного импульса, инвертирующего населенность, и неселективного импульса. Такие эксперименты дают информацию о структуре и динамике молекул. Определение времени поперечной релаксации при наличии гомоядерной спин-спиновой связи методом спинового эха значительно затрудняется из-за J-модуляции эхо-сигналов. Этой модуляции молено избежать, если группы сигналов с различными химическими сдвигами исследовать индивидуально, то есть возбуждение и перефокусирование осуществлять с помощью селективных импульсов. Еще одним альтернативным методом, позволяющим избежать модуляционных эффектов при изучении спин-спиновой релаксации в жидкостях, является метод принудительной нестационарной прецессии. Однако при этом происходит перегрев исследуемого образца, поскольку время его облучения радиочастотным полем сравнимо со временем спин-спиновой релаксации Т2, а напряженность этого поля определяется диапазоном химических сдвигов резонансных сигналов. Этот нежелательный эффект можно исключить, если возбуждать каждый мультиплет селективно.
Наконец, существует несколько важных экспериментов, требующих селективного возбуждения или насыщения радиочастотным полем ограниченных областей образца. Одной из таких методик является определение распределения плотности ядер внутри объекта путем изучения поведения сигналов ЯМР при наличии градиента постоянного поля. Изменяя частоту облучения или создавая градиент магнитного поля, получают карту спиновой плотности внутри образца. Применяя селективное возбуждение как градиентов естественных полей, так и приложенных сильных градиентов, можно ограничить эффективный объем образца. Ответ ядерных спинов может управляться перемещаемыми прикладываемыми градиентами. Если прикладываемые градиенты выбираются так, чтобы согласовать доминирующие естественные градиенты, то возбуждаемый район образца соответствовал бы высокооднородиому полю, а сигнал от этой области преобразовывался бы в спектр, в котором ширина линии значительно уже, чем естественная приборная ширина. Эквивалентное физическое уменьшение действительного размера образца невозможно, так как форма л положение района высокой однородности неизвестны. Эти эксперименты связаны с локальным насыщением, которое использовалось для прецизионного измерения радиочастотного разделения в двойном резонансе высокого разрешения, а также для точных измерений естественной ширини линий.
Методы частотно-селекти зного возбуждения спиновой системы становятся неоценимым инструментов в решении задач молекулярной динамики. Большинство селективных методик имеет соответствующие 1М и 2М аналоги, которые обеспечивают доступ к конкретным районам полной 2М матрицы. Как отношение сигнал/шум, так и разрешение можно улучшить в результате ограничения частотных диапазонов в одном или • двух измерениях. Аналогичный способ сбора лишь ограниченного числа данных, вероятно, станет правилом в ЗМ-спектроскопии ЯМР, где регистрация полного спектра требует нескольких часов.
Объемная дисперсия намагниченности. Стационарный метод
Методики, относящиеся к данному типу, равномерно рассеивают намагниченность подавляемого сигнала по всей поверхности сферы ее действия [6,7].
Стационарный метод является одним из наиболее простых методов подавления сигналов растворителя. Самый простой метод избавиться от сигнала растворителя в спектре ЯМР — это организовать выборку данных таким образом, чтобы исключить сигнал растворителя. Если растворенное вещество представляет собой макромолекулу с различающимся временем релаксации Т\ и Тг между ним и растворителем, то можно увеличивать скорость повторения выборки данных, что является основой стационарной методики, которая использует 90-е повторяющиеся импульсы со скоростью, согласующейся с необходимым спектральным разрешением, а именно, шириной резонансной линии растворенного исследуемого вещества. Четыре или более "холостых" РЧ импульсов рекомендуется использовать перед началом выборки данных.
Для подавления сигналов растворителя удобнее всего их предварительно насыщать перед приемом данных длительным (следовательно, селективным) РЧ импульсом, настраиваемым на частоту резонанса выбранного сигнала [7,8]. Этим методом можно достигнуть подавления более чем 1000:1. Обычно для предварительного насыщения применяют импульсы длительностью от 0,1 до 1с с низким уровнем мощности, используя для этого устройство развязки, время включения которого подбирается адиабатическим способом.
Наиболее важным преимуществом методики предварительного насыщения является то, что она не вводит какого-либо заметного фазового сдвига по всему спектру, пропорционального расстоянию от РЧ импульса. Это особенно важно, когда в спектре появляются широкие линии ( 50 Гц), так как их комбинация с частотно-зависимыми фазовыми сдвигами приводит к искажению базовой линии. Другое преимущество - это подавление более чем одной позиции путем разделения времени их подавления по различным частотам. Однако в случае, когда гомоядерные эксперименты связаны с предварительным насыщением, возникает ряд проблем. Устройство развязки может возбудить мощный сигнал растворителя во время приема данных, если частота развязки будет близкой к частоте химического сдвига растворителя. Основным недостатком предварительного насыщения, как метода подавления интенсивных сигналов растворителя, является перенос насыщения от растворителя к обмениваюпщмся протонам. Этот зффеїсг может быть вызван либо химическим обменом, либо кросс-релаксацией. Интенсивность резонансных сигналов, способных к обмену, уменьшается, если скорость химического обмена или кросс-релаксации между ними и сигналами растворителя сравнима со скоростью их спин-решеточной релаксации в отсутствии обмена или кросс-релаксации. Для преодоления этих проблем был предложен метод, позволяющий выполнять экстраполяцию интенсивности пиков в отсутствии насыщенного сигнала растворителя [9].
Эта методика основана на повторении эксперимента подавления сигнала растворителя с импульсами предварительного насыщения различной длительности. Взаимное насыщение уменьшается, если уменьшается мощность импульсов предварительного насыщения. Трудность реализации этого метода состоит в том, что кратковременный импульс, прикладываемый на короткое время, теряет свои селективные свойства.
В качестве очень простого метода подавления сигнала растворителя можно использовать обычное гомоядерное развязывающее устройство для непрерывного облучения сигналов растворителя. Этот метод обладает тем преимуществом, что в применяемой последовательности нет никаких дополнительных задержек. В случае применения режима работы с разделением по времени требуются большие мощности устройства развязки. Непрерывное облучение сигнала растворителя в течение всего периода приема данных приводит к перегрузке приемника. Основной недостаток такого способа облучения заключается в том, что сигналы, близкие по частоте к сигналу растворителя, испытывают сдвиги Блоха-Сайгерта и эффекты внерезонансной развязки, помимо этого появляются эффекты переноса насыщения.
Одним из самых первых методов подавления сигнала растворителя была так называемая WEFT (Water Eliminated FT) методика [6,8]. В своей простейшей форме она использует различие времени продольной релаксации Т\ между растворенным веществом и растворителем. В основе ее лежит другая хорошо известная методика, инвертирующая сигналы с последующим восстановлением для измерения Т\. Если ядра растворенного вещества релаксируют быстрее, чем растворитель, то можно выбрать значение т таким образом, чтобы 90-й импульс чтения прикладывался в тот момент, г о да намагниченность растворителя проходит через нулевое значение. Для усреднения по времени принимаемых сигналов важно, чтобы время подготовительного периода Т 5Ti(s), где T\{s) обозначает Т\ растворителя. Несоблюдение этого условия значительно сни кает отношение сигнал/шум. Улучшения эффективности можно достичь, выполняя эксперимент в условиях стационарного состояния. В этом случае дополнительно используется Homospoil импульс для устранения поперечных компонент намагниченности после 180-го импульса в импульсной последовательности типа (T-180-HSP-90)„. Условие стационарного состояния определяется уравнением
Импульсная последовательность Редфилд 2-1-4 с разделением по времени
Методики, использующие длительные импульсы, аналогичны выше изложенному возбуждению намагниченности растворителя с возвращением затем ее к оси "+z". В этом случае намагниченность растворителя прецессирует относительно эффективного мощного РЧ поля. Достигается это путем размещения резонанса растворителя вблизи границы спектральной ширины и уменьшения мощности передатчика. Таким образом, если сигнал растворителя располагается в центре интересующей нас области (например, протонный спектр ЯМР в водном растворе), то для получения полного спектра требуется два раздельных эксперимента. Уменьшение мощности передатчика приводит к значительному изменению фазы вдоль спектра, которое в соединении с широкими линиями ( 50 Гц) вызывает сильное искажение базовой линии спектра. Идея составного импульса заключается в том, что вместе с определенными амплитудами и фазами можно получить широкий нуль за счет установки наклона их кривой Фурье-преобразования, равных по значению, но противоположных по фазе в нуле.
Импульсная последовательность Редфилд 2-1-4 Развивая методику, использующую импульсы большой длительности, Редфилд предложил так называемую Редфилд 2-1-4-последовательность [4], представляющую собой составной импульс, в котором 3/10 и 8/10 импульса сдвинуты по фазе на 180 относительно его оставшейся части (рисЛ).
Одной из этих функций является обычная функция возбуждения sine, другая — функция косинуса. Косинус выбран в силу простоты осуществления этой функции, так как Фурье-преобразование двух узких импульсов, разделенных между собой величиной (2т) , дает функцию косинуса, первый нуль которой совпадает с положением нуля импульса длительности х. Таким образом, импульс "2-1-4" можно принять как длительный импульс радиочастоты мощностью В\ (функция возбуждения sine) за вычетом двух коротких импульсов двойной мощности радиочастоты (косинусное возбуждение).
Требуемый нуль в характеристике возбуждения достигается путем независимого варьирования части "4", что приводит к так называемой последовательности Редфилд 2-1-х, или "Магическая кнопка", которая позволяет достигать отношения подавления порядка 300:1.
Эта последовательность представляет собой комбинацию модулированной по фазе последовательности DANTE с импульсом Редфилд
Она состоит из серии 10 "жестких" импульсов, разделенных соответствующими задержками (рис.2).
Фазы третьего и восьмого импульсов инвертированы на 180 относительно остальных импульсов. Посредством задержек, разделяющих импульсы друг от друга, добиваются, чтобы продолжительность импульсной цепочки примерно была такой же, как в простом импульсе. По аналогии с модификацией "Магическая кнопка" задержку после импульсов, начиная с четвертого до восьмого, можно подбирать путем независимого варьирования их длительности. Последовательность Редфилд 2-1-4 с разделением по времени обеспечивает отношение подавления сигнала растворителя псрядка 500-1000:1 и обладает тем преимуществом, что обитдй угол отклонения намагниченности можно контролировать независимо от полного интервала без изменения уровня РЧ поля, что особенно полезно при проведении экспериментов, в которых используются как 90-е, так и 180-е импульсы.
Биноминальные импульсные последовательности [1,3] состоят из неселективных импульсов, разделенных временной задержкой т, которая выбирается так, чтобы т = (2Д) , где А - величина отклонения частоты сигнала, который нужно подавить, от несущей частоты передатчика. Эти последовательности создают косинусную функцию возбуждения, и их легко использовать для получения 180-х импульсов. Изменяя фазу импульсов, можно получать синусное возбуждение, перемещающее положение нуля последовательности, совпадающей с частотой передатчика. В любом случае задержка равна 1 мс. Число импульсов и их ширина выбираются в качестве строк треугольника Паскаля. В настоящее время эти последовательности являются наиболее перспективными методами подавления сигналов растворителя, так как они обеспечивают достаточно значительное отношение подавления — более 1000:1 - без переноса насыщения от растворителя к растворенному веществу. Их основным недостатком является то, что они нарушают непрерывность 180-й фг.зы в положении подавления и, таким образом, они не приемлемы, если широкие пики раствора захватывают любую из сторон сигнала растворителя. Кроме того, существует проблема неодинакового возбуждения по ширине спектра. Самой простой последовательностью была бы пара импульсов тсм 1,1, где запятая обозначает задержку т. Принцип очень схож с принципом DANTE.
Число импульсов в последовательности можно увеличить до 1, 2, 1: 1, 3, 3, 1 и 1, 4, 6, 4, 1 импульсов и т.д. Такие последовательности обеспечивают возбуждение с достаточно широкими нулями спектральной хараісгеристики. Инверсия фазы дает 1,-1 (называемой также "Прыжок и возврат"); 1,-2, 1 и 1,-3, 1,-1.
Последовательность 1, 2, 1 дает косинусно-квадратурную функцию, которая имеет нуль на том же самом месте, но теперь первая производная равняется нулю в нулях функции. Таким образом, она обладает более широким нулем, что должно приводить к наиболее лучшему подавлению. Вообще, последовательность, в основу которой положен п-ый биноминальный ряд коэффициентов, будет генерировать характеристику возбуждения вида cos или sin и иметь п-1 нулевых производных высших порядков в нулях функций.
Двумерные эксперименты как новый этап развития одномерных методик ЯМР
Не существует принципиального различия между одномерной и двумерной спектроскопией ЯМР. Кесслером и др. был предложен общий подход [12], позволяющий преобразовывать большинство двумерных методик ЯМР в одномерные последовательности, используя полуселективные гауссиановские импульсы [17]. Эти методики становятся предпочтительными, когда при решении химических проблем требуется ограниченное количество информации, например, определение констант связи J, NOE значений или констант скорости химического обмена. Это имеет место при исследовании молекул среднего размера. Потребность в объеме памяти, количестве получаемых данных и времени их обработки для 1М-экспериментов решительно снижается по сравнению с соответствующими 2М-методиками. Кроме этого, некоторые из предлагаемых методик [12] обладают уникальными характеристиками, для которых не существует в 2М ЯМР никаких эквивалентов.
Гомоядерная 2М-спектроскопия ЯМР, в частности, такие ее типы как COSY [39], NOESY и соответствующие методики дистанционного переноса намагниченности [40,41], весьма полезна для выяснения молекулярной структуры. Эти двумерные методы обладают значительными преимуществами по сравнению со многими стандартными одномерными методиками.
Было показано, что 2М корреляционная спектроскопия (COSY без квантовых фильтров [42], дистанционная COSY [40] и TOCSY [43]) лучше приемлема, чем методы двойного резонанса для анализа сложных цепей связей. Первоначально эти 2М корреляционные методики использовались лишь для отнесения протонных резонансов. Некоторое время назад было сообщение об извлечении констант связи из фазочувствительных COSY-спектров [44] и COSY с двухквантовым фильтром [45]. Особый метод управления данными, называемый DISCO [46], как было показано, является весьма успешным в этом отношении. Разработана модификация COSY-эксперимента (E.COSY [47]), которая позволяет измерять константы - Н связи, что невозможно выполнить другими методами.
Переходные эффекты NOE, знание которых существенно для получения информации относительно пространственной перегруппировки внутри молекулы, легко получить путем временной развертки интегралов NOE кросс-пиков в 2М NOESY-спектрах. Такую информацию трудно получить из 1М NOE-экспериментов [48-52]. Возможность передачи намагниченности на дальние расстояния через промежуточный спин является другой уникальной особенностью 2М-спектроскопии. Часто эта методика представляет собой единственный способ анализа перекрываемых участков спектра 1МР. Таким образом, 2М-методики обладают рядом преимуществ по сравнению с уже известными существующими 1М-методиками и, следовательно, существует необходимость создания одномерных версий 2М-методик.
Применение гауссиановских импульсов позволяет использовать полуселективные 90-е импульсы, где полуселективность означает возбуждение всего мультиплета данного ядра без возмущения близлежащих резонансов других сигналов. Вообще, р настоящее время возможно преобразовывать гомоядерные 2М-методики в их одномерные аналоги, используя только одно время эволюции, путем замены части последовательности "90— -" на "90с1 -т-" (полуселективный 90-й импульс, за которым следует фиксированная задержка). Результирующий спектр похож на поперечное сечение, взятое из соответствующего 2М-спектра, более точно: он имеет сходство с поперечным сечением, проведенным через временную константу, равную постоянной задержке приложения 180-го импульса в этом 2М-эксперименте [53].
Селективные и полуселективные импульсы, как известно, ранее применялись в 1М-методиках. Большинство из этих последовательностей создает неравновесное состояние первого рода, в результате которого оказываются возмущенными только населенности. Например, в ТОЕ эксперименте выборка данных происходит посредством неселективного импульса. Рассматриваемые методы используют поперечную намагниченность, созданную полуселективным импульсом, что приводит к процессам, аналогичным протекающим в одномерном ЯМР. Выбор требуемой поперечной намагниченности достигается фазовым циклированием [54,55].
До настоящего времени полуселективное возбуждение достигалось, в основном, прямоугольными маломощными импульсами или импульсами большой длительности типа DANTE. Канет и др.[56] предложили 1М COSY-эксперимент, предназначенный для извлечения 13С-13С констант связи, которые использовали особые эффекты off-резонанса. Однако этот метод весьма громоздкий для ХН спектров. Бауэр и др.[17] указали на ряд преимуществ при использовании гауссиановской формы по сравнению с прямоугольными импульсами в ЯМР высокого разрешения. Импульсы гауссиановской формы уже широко используются в спектроскопии ЯМР. Применение 1М COSY-спектров открывает широкие возможности по обнаружению !—!Н связей [57]. Кесслер и др. [12] расширили методологию [17], что позволило использовать 1М COSY-спектры не только для отнесения сигналов, но и для оценки констант связи. Более того, спектры, полученные согласно расширенной методике [12], регистрируются в фазочувствительном режиме, при этом вводится ряд дополнительных 1М-последовательностей.
Мультиплеты сигналов, наблюдаемые в расширенных 1М COSY-экспериментах, являются "антифазными" [12], и, следовательно, прямое извлечение констант связи может осложняться из-за исчезновения индивидуальных линий внутри мультиплета. Вследствие этого был предложен [12] рефокусируемый 1М COSY-эксперимент с Z-фильтром [58], который обеспечивает интенсивность мультиплетных линий связанных ядер, наблюдаемую в стандартном "мягком" спектре. Метод DISCO [46], совмещенный с обычным фазочувствительным 1М COSY, можно применять в COSY-эксперименте с Z-фильтром, который с успехом используется для изучения мультиплетных сигналов, перекрывающихся с другими сигналами.
Эхо-спектроскопия двойного импульсного полевого градиента
По существу, на рис.35 представлен тот же самый стандартный блок (рис.33). Однако здесь он используется для того, чтобы подавить ненужный сигнал, например, очень часто - сигнал воды. С этой целью наряду с двумя полевыми градиентами применяется "жесткий" (рЗ) и селективный 180-й импульс. Из соображений симметрии последний часто состоит из двух 90-х импульсов р2 и р4 с "жестким" 180-м импульсом рЗ. Таким образом, резонансный сигнал воды облучается 360-м эффективным импульсом, все же другие сигналы возбуждаются только 180-м импульсом, и тем самым подвергаются воздействию двух градиентов одного и того же знака. В некоторых приложениях этой методики селективные импульсы заменены биномиальной последовательностью, однако это выходит за рамки нашего рассмотрения. Принцип WATERGATE применялся в ряде импульсных последовательностей, именуемых PHOGSY, которые способны обнаружить молекулы связанной воды в белках [76].
Фазовая характеристика рис.35 не удовлетворяет нашим требованиям. Хванг и Шака [77] показали простым матричным вычислением, что дублирование импульсной последовательности (рис.35) не только обеспечивает подавление, но и улучшает фазовый режим, однако это улучшение достигается ценой общей релаксации в течение двух сэндвичей (рис.36).
Градиенты в DPFGSE (двойной импульсный полевой градиент спин-эха) последовательности не должны быть связаны друг с другом; отношения 40:40:7:7 были определены опытным путем.
К сожалению, не существует стандартных методов подавления воды. Для сравнения многих предлагаемых методов рекомендуется использовать 2 мл сахарозы в 90% Н2ОЛ320, поскольку этот образец имеется во всех лабораториях и дает фактически точную информацию, близкую к реальным условиям. На рис.37 показан результат использования DPFGSE-метода для этого раствора. Сигнал аномерного протона (anomeric proton) четко наблюдается, а остаточный сигнал воды уменьшается до уровня сигналов углевода.
Обсуждаемое выше возбуждение успешно применялось для того, чтобы улучшить другие импульсные методики, которые оказались очень плодотворными для органической химии, а именно, NOE разностная спектроскопия. Келер и сотрудники впервые предложили GOESY-методику [78], которая оказалась гораздо более успешной, чем DPFGSE [79]. На рис.38 показана импульсная последовательность, результат действия которой для стрихнина продемонстрирован на рис.39. После приложения первого РЧ импульса фазы всех спинов изменяются под действием импульсного полевого градиента gl. Порядок когерентности изменяется только для сигнала, селективно возбуждаемого РЧ импульсом р2, поэтому только этот сигнал перефазируется импульсным градиентом g2, тогда как все остальные сигналы продолжают г ао Ьазиповаться. Эта процедура вновь повторяется посредством сэндвича g3, рЗ, g4. С применением двойного градиента методика спинового эха обеспечивает селективное возбуждение полезного сигнала без искажений посредством рефокусирования скалярной связи. Эта намагниченность поворачивается в отрицательном z-направлении с помощью РЧ импульса р4. В течение времени смешивания т , которое соответствует трем интервалам задержки d2 плюс длина градиентного импульса (см. рис.38), происходит кросс-релаксация, a NOE результат преобразуется в наблюдаемую намагниченность считывающим импульсом р8.
В момент смешивания используют несколько 180-х импульсов для того, чтобы перефокусировать z-намагниченность, вызванную релаксацией в течение Тем , импульсные градиенты g5 и g6 удаляют любые х, -компоненты, вызванные несовершенными 180-ми импульсами. Заметим, что в отличие от известной разностной NOE-спектроскопии, этот эксперимент не является установившейся методикой, а принадлежит к переходным методам подобно NOESY, поэтому его результаты численно отличаются от данных обычной NOE разностной спектроскопии.
Если скорость инверсии молекулы такова, что NOE-эффекты станут маленькими или нулевыми, то схема NOE обычно заменяется экспериментом во вращающейся системе координат, где спины блокируются слабым РЧ полем. Существует ряд селективных методов, в которых в отличие от NOE эксперимента, описанного выше, используется блокировка спина. Один из этих экспериментов был назван GROESY [80,82] и довольно похож на ID TOCSY-последовательность, показанную на рис.33, однако используемая блокировка спина гораздо слабее.
![Строение супрамолекулярных систем на основе амфифильных азотсодержащих соединений, а также тетра(метилвиологен)-каликс[4]резорцинарена по данным диффузионной ЯМР спектроскопии](/i/i/4371/285199.png "Строение супрамолекулярных систем на основе амфифильных азотсодержащих соединений, а также тетра(метилвиологен)-каликс[4]резорцинарена по данным диффузионной ЯМР спектроскопии Харламов Сергей Вячеславович")
