Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Современные представления о тератогенезе 8
1.1.1. Основные закономерности тератогенеза 8
1.1.2. Механизмы тератогенеза 17
1.1.2.1. Генотоксические механизмы тератогенеза 18
1.2. Современные принципы исследования тератогенеза 21
1.2.1. Генотоксикологические подходы к исследованию тератогенеза 23
1.2.2. Тератогенный эффект циклофосфамида 24
1.3. Профилактика тератогенеза 25
1.3.1. Антимутагенная профилактика тератогенеза 27
1.3.1.1. Антимутагенные свойства афобазола 29
2. Материалы и методы 31
2.1. Препараты и режимы введения 31
2.2. Экспериментальные животные 32
2.3. Методы исследования антитератогенной активности на модельн ых животных 33
2.3.1. Метод Вильсона 34
2.3.2. Метод П. Петерса 35
2.4. Метод «ДНК-комет» 36
3. Результаты 39
3.1. Модель тератогенного действия циклофосфамида 39
3.2. Влияние афобазола на эмбриотоксические эффекты циклофосфамида 40
3.3. Оценка влияния афобазола на тератогенез индуцированный циклофосфамидом 41
3.3.1. Влияние афобазола при однократном введении на тератогенные эффекты циклофосфамида 41
3.3.1.1. Макроскопическое исследование плодов 41
3.3.1.2. Микроанатомическое исследование внутренних органов эмбрионов...43
3.3.1.3. Оценка состояния костной системы 44
3.3.2. Влияние афобазола при трехдневном введении на тератогенные " эффекты циклофосфамида 46
3.3.2. 1. Макроскопическое исследование плодов 47
3.3.2. 2. Микроанатомическое исследование внутренних органов эмбрионов...48
3.3.2. 3. Оценка состояния костной системы 49
3.4. Оценка влияния афобазола на генотоксические эффекты циклофосфамида 51
3.4.1. Влияние афобазола на ДНК-повреждения и апоптотический эффект циклофосфамида в эмбриональной и плацентарной тканях крыс при 20 часовой экспозиции 52
3.4.1.1. Плацента 52
3.4.1.2. Эмбрион 54
3.4.2. Влияние афобазола на ДНК-повреждения и апоптотический эффект циклофосфамида в эмбриональной и плацентарной ткани крыс при 24 часовой экспозиции 56
3.4.2.1. Плацента 56
3.4.2.2. Эмбрион 57
3.5. Количественная оценка ДНК-повреждений в эмбриональной и плацентарной тканях 59
3.5.1. Распределение частот клеток с ДНК различной степени фрагментации в группе животных позитивного контроля 60
3.5.1.1. 20 часовая экспозиция 60
3.5.1.2. 24 часовая экспозиция 61
3.5.2. Распределение частот клеток с ДНК различной степени фрагментации в группе животных негативного контроля 62
3.5.2.1. 20 часовая экспозиция 62
3.5.2.2. 24 часовая экспозиция 64
3.5.3. Сравнительная оценка распределения частот клеток с ДНК различной степени фрагментации в экспериментальных группах животных 65
3.5.3.1. 20 часовая экспозиция 65
3.5.3.2. 24 часовая экспозиция 68
3.6. Оценка корреляционной связи между антигенотоксическим и антитератогенным эффектами афобазола 69
3.6.1. Анализ взаимосвязи между степенью поврежденности ДНК в клетках плацент и эмбрионов и влиянием афобазола на эти негативные эффекты 69
3.6.1.1. 20 часовая экспозиция 70
3.6.1.2. 24 часовая экспозиция 72
3.6.2. Анализ зависимости выхода поврежденных ДНК в клетках эмбрионов от количества нормальных, поврежденных и апоптотических клеток в плаценте 73
3.6.2.1. 20 часовая экспозиция 74
3.6.2.2. 24 часовая экспозиция 75
3.6.3. Анализ зависимости появления пороков развития у эмбрионов от количества нормальных, поврежденных и апоптотических клеток в ткани плацент и эмбрионов 77
3.6.3.1. 20 часовая экспозиция 78
3.6.3.1.1 Плацента 78
3.6.3.1.2 Эмбрион 84
3.6.3.2. 24 часовая экспозиция 86
3.6.3.2.1 Плацента 86
3.6.3.2.2 Эмбрион 93
Обсуждение результатов 98
Выводы 115
Список литературы 116
Приложение 138
- Основные закономерности тератогенеза
- Тератогенный эффект циклофосфамида
- Методы исследования антитератогенной активности на модельн ых животных
- Оценка влияния афобазола на тератогенез индуцированный циклофосфамидом
Введение к работе
Актуальность исследования. Тератогенные воздействия имеют серьезные медицинские последствия и являются причиной невынашивания беременности (до 46,6 %), младенческой смертности и инвалидизации населения, которая среди детей и подростков в России составляет 190-210 случаев на 10 000 человек [15, 85].
Спектр тератогенов весьма обширен - это некоторые лекарства, косметические компоненты, экотоксиканты, производственные и бытовые вредности. В наиболее известном каталоге, известном как «список Шепарда» [215], указывается на возможную опасность со стороны около 1200 распространенных потенциальных тератогенных факторов. Прямо доказанную тератогенную опасность для человека представляет около 50 факторов различной природы [141].
Широкая распространенность тератогенов определяет неизбежность их контакта с человеком и необходимость внедрения мер по профилактике тератогенеза. Поиск фармакологических средств защиты от тератогенных воздействий отвечает поставленной государственной задаче по охране и сохранению репродуктивного здоровья населения России (Постановление общего собрания РАМН, 2008). Ее решение требует изучения механизмов тератогенеза и, на этой основе, возможных путей предупреждения и коррекции тератогенных воздействий.
Особое внимание в области изучения тератогенеза привлекают генотоксиканты - вещества, вызывающие повреждения ДНК и мутагенез [10]. Роль мутагенеза в становлении тератогенных повреждений широко обсуждается, в настоящий момент имеются сведения, указывающие на тесную сопряженность тератогенных и цито-генетических эффектов ряда соединений [167]. В свою очередь, роль повреждений ДНК в тератогенезе практически не исследована из-за методических трудностей. Только с появлением метода «ДНК-комет», в модификациях, позволяющих оценивать ДНК поврежденность клеток различных тканей in vivo [44], открылись новые перспективы исследования генотоксических механизмов тератогенеза.
Возможная роль мутагенных поражений и повреждений ДНК в тератогенезе позволили предположить, что в качестве средств профилактики тератогенеза могут
применяться вещества, обладающие антимутагенной активностью. В частности, лекарства, антимутагенная активность которых была установлена и исследована в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова НИИ фармакологии РАМН [43].
В этой связи внимание привлекает новый отечественный анксиолитик афобазол, разработанный в ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова под руководством академика РАМН СБ. Середенина и продемонстрировавший в экспериментах на млекопитающих выраженные антимутагенные свойства [48, 84].
Цель исследования. Целью настоящей работы явилось комплексное исследование влияния афобазола на тератогенез и ДНК-повреждения в эмбриональных тканях и плаценте, индуцированные известным мутагеном и тератогеном циклофос-фамидом.
Основные задачи исследования.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Адаптировать циклофосфамидную модель тератогенного действия к условию получения максимального тератогенного эффекта без увеличения спонтанной гибели эмбрионов в период активного органогенеза.
Оценить влияние афобазола в разных дозах при однократном введении на 14 день беременности и трехдневном введении на 13-15 днях беременности, на тератогенез, индуцированный циклофосфамидом.
Исследовать временные и дозовые зависимости влияния афобазола на индуцированные циклофосфамидом ДНК-повреждения и апоптоз в эмбриональных тканях и плаценте.
Провести анализ взаимосвязи между повреждениями ДНК в эмбриональных тканях и плаценте с возникновением пороков развития эмбрионов.
Научная новизна. Впервые установлено, что анксиолитик афобазол, обладающий антимутагенными свойствами, при различных режимах введения, дозозависи-мо снижает тератогенный эффект циклофосфамида. В частности, под действием афобазола показано уменьшение количества эмбрионов с грубыми аномалиями: менингоэнцефалоцеле, краниошизис, микрогнатия, гипогнатия, протрузия языка,
омфалоцеле, тератома, повреждения передних и задних конечностей, расщелина позвоночника (Spina bifida), сколиоз, гидроцефалия, ураношизис. Антигенотокси-ческая активность афобазола впервые выявлена в эмбриональных тканях и плаценте, что дополняет ранее установленные данные об антимутагенных свойствах этого препарата в клетках соматических тканей. Сформулирована рабочая гипотеза о роли предмутационных поражений ДНК в эмбриональных тканях и плаценте в формировании тератогенных эффектов. Установлено, что увеличение и разнообразие аномалий развития эмбрионов коррелирует с уровнями ДНК-повреждения и апоп-тоза не только в эмбриональных тканях, но также в клетках плаценты.
Научно-практическая значимость. Совокупность полученных данных создает научно-обоснованную базу для поиска средств фармакологической профилактики тератогенеза и определяет актуальность изысканий антитератогенов среди соединений с антимутагенными свойствами, расширяет представления о методических возможностях метода «ДНК-комет», впервые апробированного при определении целостности ДНК в эмбриональных и плацентарной тканях.
Практически важным является выявленное совпадение доз, в которых афобазол -проявляет основной анксиолитический эффект, антимутагенное и антитератогенное действие, что открывает перспективы расширения показаний его клинического применения.
Основные закономерности тератогенеза
Впервые экспериментальные исследования в области тератологии были проведены Э. Жоффруа Сент-Илером [51]. Дальнейшее изучение негативного воздействия средовых факторов было продолжено его последователями и сосредоточено на исследовании фундаментальных аспектов проблемы, без преломления в практическое здравоохранение.
Положение кардинально изменилось с момента выявления тератогенного эффекта талидомида в 1961 году [141]. Бесконтрольное применение этого лекарственного средства беременными вызвало в Европе, Канаде и Японии резкое увеличение частоты врожденных аномалий у детей, прежде всего амелии и меромелии (полное или частичное отсутствие конечностей), различных пороков сердца, отсутствие ушных раковин, деформации кишечника [141]. По некоторым оценкам пострадало около 300 тысяч новорожденных. Талидамидовая трагедия обострила внимание к проблеме профилактики тератогенеза, в частности, с середины 60-х 20 столетия проверке лекарств на эмбриотоксическое и тератогенное действие стали уделять особое внимание (см. раздел 1.4.).
Современная тератология базируется на шести "главных принципах», сформулированных Wilson (1973 год). В настоящее время они рассматриваются как закономерности тератогенеза, среди которых основными являются следующие: 1) ток-сикокинетические; 2) генетической предрасположенности; 3) критических периодов чувствительности; 4) общности механизмов формирования пороков развития; 5) дозовой зависимости эффектов [63, 114, 116, 137]. 1) Токсикокинетические особенности и метаболические превращения в системе мать-плацента-плод определяют особенности проявление негативного действия те ратогенов различной природы [73, 87, 106, НО, 123]. Тератогены могут оказывать прямое токсическое действие на плод после проникновение через плацентарный барьер, либо опосредованно через негативное воздействие на плаценту или небла гоприятное влияние на гомеостаз организма матери [34, 78, 62, 117, 137]. Во всех случаях действующим началом может быть неизмененное вещество или его актив ные метаболиты. Например, циклофосфамид в результате метаболических превра щений в печени матери распадается на активные метаболиты с алкилирующими, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами [92, 116, 192] (подробно в раз деле 1.2.1.). 2) Межвидовые различия в действии тератогенов (генетическая предрасполо женность по Вильсону) определяется особенностями видовой генетической кон ституции различных видов животных и человека [114, 116]. Кроме того, на инди видуальном уровне она, по современным представлениям, может определяться ге нетическими полиморфизмами. Известно, что крысы малочувствительны к тератогенному действию талидоми-да и кортизона, а такие вещества как метотрексат, фторурацил винкристин, вызывают у них серьезные нарушения. В свою очередь к действию кортизона чувстви тельны кролики и мыши, а эмбрионы приматов чувствительны к тератогенному действию талидомида и андрогенов. 3) Характер пороков развития, вызванных тератогенными воздействиями, определяется критическими периодами формирования различных органов и систем в процессе эмбриогенеза. В эти периоды происходят сложные процессы пролиферации, дифференциации зародышевых клеток, их миграция и органогенез, которые следуют в определенном порядке. Рассогласование этих процессов приводит к формированию врожденных аномалий развития плода [114, 116].
После оплодотворения клетки быстро делятся, формируя бластоциты - период интенсивной клеточной пролиферации. Негативные воздействия в этот период приводят к бластопатиям, следствием которых являются эктопическая имплантация зародыша, нарушение формирования плаценты, появление грубых пороков развития или гибель зародыша. Тератогенное воздействие в периоды закладки зародышевых листков и органогенеза, приводит к различного рода эмбриопатиям. За периодом органогенеза следуют периоды гистогенеза и функционального созревания органов и тканей плода. В этом периоде, негативное влияние на процессы роста и дифференцировки тканей приводит к возникновению фетопатий, при которых отмечаются низкие показатели массы и длины тела плода, задержка дифференциа ции тканей центральной нервной системы, легких, почек, органов кроветворения, незрелость органов, функциональные нарушения.
Тератогены - экзогенные факторы различной природы, вызывающие образование врожденных пороков развития у плода. Эффект тератогенов обусловлен их негативным влиянием на процессы гисто - и органогенеза, рост и развитие плода [45, 113,172].
Основные группы тератогенных факторов включают инфекции, ионизирующее излучение, метаболические нарушения и вредные привычки у беременной, химические вещества, в том числе лекарственные средства [91, 108, 114, 125, 151, 221]. Генитальная патология беременной, в частности недостаточность яичников и повреждение эндометрия, является решающим фактором в развитии внутриутробной патологии [25, 26, 34, 105, 106, ПО, 119, 122, 136]. Повреждение эндометрия приводит к разрыву рефлекторных связей между маткой и яичниками и сниженшо синтеза эстрогенов, нарушению подготовки трофической среды для зародыша и сам процесс имплантации и плацентации.
Важно подчеркнуть, что нарушение плацентации приводит к формированию первичной плацентарной недостаточности [13, 26, 37, 34, 41]. Уменьшение плацентарного кровообращения и развитие вторичной плацентарной недостаточности (гипертония, анемия, поздний токсикоз) представляют наибольшую тератогенную опасность в плодном периоде [37, 104, 106, ПО, 119, 120, 122].
Следствием нарушенного кровообращения в системе мать-плацента-плод является развитие хронической гипоксии, которая приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов, истощению антиоксидантной системы, изменению физико-химических свойств плазматических мембран, усилению перекисных процессов с появлением большого количества высокоактивных свободных радикалов, инициирующих окислительное повреждение в организме плода, включая его центральную нервную систему [111, 89, 83, 88]. Эти факты указывают на необходимость учета плацентарной дисфункции при изучении механизмов тератогенеза и действия тератогенов.
Тератогенный эффект циклофосфамида
Сведения о тератогенных и мутагенных эффектах циклофосфамида хорошо известны [60, 92, 128, 130].
Нативный циклофосфамид не оказывает повреждающего действия, однако его метаболиты обладают цитотоксическими, мутагенными и тератогенными эффектами [130]. Биотрансформация циклофосфамида происходит в печени при участии различных изоформ цитохрома Р-450 и Ь5, с образованием нескольких метаболитов с различной фармакологической активностью [184, 66], как это показано на схеме (рис. 1), представленной в [184].
Синтез 4-гидроксициклофосфамида осуществляется в основном цитохромами Р-450 подсемейств 2В и 2С (наиболее активными из них являются изоформы цитохрома Р-450 2С8, 2С9, 2С18, 2С19). Образование токсических метаболитов акролеина и фосфорамидиприта происходит при участии ферментов подсемейства ЗА. Эти метаболиты обладают цитотоксической, мутагенной и тератогенной активностью за счет алкилирования ДНК [130].
Анализ литературных данных описывающих исследования тератогенных эффектов циклофосфамида показал, что результаты представленные исследователями имеют различия [184]. Это в частности, касается дозового уровня тератогенности циклофосфамида и спектра аномалий, выявленных в различные периоды эмбриогенеза. Такая неоднозначная оценка тератогенности определила необходимость проведения предварительных экспериментов с целью подбора дозы, при отработке экспериментальной модели удовлетворяющей условиям задач, поставленных в настоящей работе.
Обобщая вышеизложенное можно заключить, что последствия тератогенных поражений крайне неблагоприятны, что позволяет рассматривать исследования по их профилактике как актуальное направление современных медико-биологических исследований.
Общепринятая профилактика врожденной патологии включает ранние выявление тератогеыов и ограничение контакта с ними человека, а также медико генетическое консультирование супружеских пар, пренатальную диагностику в процессе наблюдения беременных женщин в женской консультации, рациональное питание, лечение сопутствующих заболеваний и осложнений беременности [17,31,85,95].
В большинстве стран разработаны специальные тест-системы выявления терато-генов. В России это методические рекомендации - «Методические указания по изучению репродуктивной токсичности фармакологических веществ» [115]. Однако практика показывает, что полностью исключить контакт человека с тератогенами и предупредить появление ВПР невозможно. Это обусловливает необходимость экспериментальной и теоретической проработки вопроса о возможности фармакологической профилактики тератогенеза [21, 58, 69, 85, 97, 118, 171, 187, 202].
Большинство случаев осложненной беременности обусловлены нарушением между системами свободно-радикального окисления и антиоксидантной защиты [65, 93, 99]. В связи с этим, с целью профилактики риска возникновения пороков развития, широко применяются витаминные комплексы в составе которых имеются мощные антиоксиданты, в частности витамины А, Е, С, бета - каротиды, селен [64, 93, 107, 124]. Жирорастворимые антиоксиданты являются «ловушками» свободных радикалов, тем самым защищают клетки зародыша и плода от окислительного повреждения [65]. Использование антиоксидантов в качестве средств профилактики тератогенеза особенно важно для беременных находящихся в зоне экологического риска, имеющих сопутствующие болезни, злоупотребляющих курением и алкоголем.
Особое значение в профилактике врожденных пороков развития имеет применение фолиевой кислоты, дефицит которой может привести к формированию дефектов нервной трубки у развивающегося плода [7, 174].
Фолиевая кислота и ее производные относятся к водорастворимым соединениям группы витаминов В, участвующих в метаболизме гомоцистеина [164]. Производные фолиевой кислоты участвуют во многих обменных процессах и являются кофакторами ферментативных реакций синтеза аминокислот, необходимых для нормальных процессов роста, развития и пролиферации тканей во время эмбриогенеза. Известно, что большинство дефектов нервной трубки формируется в результате взаимодействия наследственных факторов и факторов внешней среды. Наследственной причиной развития этой аномалии является генетически обусловленное нарушение обмена ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина, обладающего токсическим действием на нервную систему развивающегося плода. К факторам внешней среды, способных вызывать формирование дефектов нервной трубки, могут быть отнесены любые средовые тератогены, вызывающие нарушение в обмене фолатов и метиониновом цикле [7, 164, 174].
В ряде работ было показано, что сочетание повышенного накопления гомоцистеина и дефицита фолатов, в особенности витамина В12 может являться фактором риска, гестоза, преждевременного отслоения плаценты, фетоплацентарной недостаточности, синдрома задержки развития и антенатальной гибели плода, ранних и поздних выкидышей.
В связи с этим, практически в ряде стран с целью профилактики пороков развития нервной трубки плода, беременным назначается фолиевая кислота (В9) в комплексе с витаминами Вь В6, В]2.
Изучение антимутагенных свойств ряда лекарств и лекарств-кандидатов in vivo в той же лаборатории, позволили выявить фармакологические препараты с искомыми свойствами, в частности, это касается производных 1,4-бензодиазепина, 2-меркаптобензимидазола, 3-оксипиридина и ряда других соединений [42]. Особенно перспективным для разработки в качестве антитератогена представляется афобазол - новый отечественный анксиолитик с антимутагенными свойствами [48, 49, 50].
Методы исследования антитератогенной активности на модельн ых животных
Общий дизайн эксперимента, принципы и методы анализа тератогенных и эм-бриотоксических исследований соответствовали требованиям методических рекомендаций, посвященных оценке тератогенной активности фармакологических веществ [115].
На этапе отработки экспериментальной модели, циклофосфамид вводили внут-рибрюшинно (в/б) в дозах 10, 15 и 20 мг/кг на 14 день беременности. Основные эксперименты проводили в двух вариантах. В первом случае, беременные самки обрабатывались афобазолом и циклофосфамидом на 14 день беременности. Во втором - афобазол вводили животным на 13, 14 и 15 день беременности и циклофосфамид - на 14 день беременности. Введение препаратов осуществлялось по схеме «афобазол + циклофосфамид» с интервалом 15 минут. На протяжении всего эксперимента следили за состоянием беременных самок. Крыс взвешивали на 1, 7, 14,19 дни беременности. Животных забивали на 20-й день беременности. После вскрытия брюшной полости, извлекали матку и яичники, которые помещали в чашку Петри с физиологическим раствором. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество живых и мертвых плодов, а также мест имплантаций и резорбций зародышей. Показатель предимплантационной гибели эмбрионов вычисляли как разность между количеством желтых тел и мест имплантаций, отнесенную к числу желтых тел, принятых за 100 %. Показатель постимплантационной гибели определяли как разность между числом мест имплантаций и живых плодов, отнесенную к числу мест имплантаций, принятых за 100 %. Плоды взвешивали, определяли кранио-каудальный размер, проводили внешний осмотр плодов, который позволяет обнаружить дефекты глаз, мозга, лицевого че репа, конечностей, брюшной стенки, наружные кровоизлияния. Часть эмбрионов исследовали с помощью микроанатомического метода Вильсона, который позволяет обнаруживать дефекты развития внутренних органов. Другую часть эмбрионов, после фиксации в 96 этиловом спирте, окрашивали ализарином и альциановым синим, с целью изучения состояния костной и хрящевой системы методом Петерса. Регистрировали аномалии костного и хрящевого скелета, среднее количество точек окостенения на один зародыш в области пястья, плюсны, позвоночника и грудины, а также аномалии черепа.
Состояние внутренних органов плодов изучали по методу Вильсона [47, 115], который заключается в следующем: плоды, полученные на 20 день беременности, помещают в жидкость Буэна, для фиксации, на срок не менее 1-2 недель. Состав жидкости Буэна: 1) насыщенный раствор пикриновой кислоты - 15 частей; 2) формалин 40% - 5 частей; 3) ледяная уксусная кислота - 1 часть.
После фиксации плоды промывали 70 % этиловым спиртом и изучали состояние внутренних органов плодов с помощью серии срезов, сделанных от руки бритвой. Первоначальный разрез производили параллельно нижней челюсти и отделяли голову (приложение 2). Далее проводили разрез через голову, перпендикулярно нижней челюсти, непосредственно под вибрисами. На этом срезе изучали состояние нижней челюсти, переднего отдела твердого неба и носовой полости. Второй разрез - через середину глазных яблок и обонятельные луковицы переднего мозга. Третий срез позволил исследовать состояние головного мозга (коры больших полушарий, боковых и 3-4 желудочков). Четвертый разрез проходил параллельно третьему. Исследовали мозжечок и продолговатый мозг. Пятый разрез проводили через гортань, пищевод, спинной мозг, сосуды и слюнные железы. На шестом разрезе, который производили параллельно предыдущему, изучали состояние пищевода, трахеи, спинного мозга, крупных сосудов. Седьмой разрез проводили через органы грудной полости, непосредственно за передними конечностями. На этом срезе исследовали сердце, легкие, бронхи, пищевод, спинной мозг. Восьмой разрез проводили посредине между седьмым разрезом и пупочным кольцом. На этом срезе изучали печень, желудок, кишечник, поджелудочную железу. Печень после осмотра удаляли пинцетом и исследовали состояние диафрагмы. Девятый разрез производили ниже пупочного кольца. После удаления петель кишечника осматривали органы таза: почки, надпочечники, мочеточники, мочевой пузырь, прямую кишку, внутренние половые органы. При этом обращали внимание на состояние лоханок почек, матки с яичниками или тестикулы с придатками.
Плоды, предназначенные для исследования скелета, фиксируют в 96 этаноле не менее 7 дней. После 2-3 дней фиксации у плодов пинцетом удаляют внутренние органы. Количество спирта должно превышать объем плодов в 5-7 раз. Далее плоды переносят в спиртовой раствор альцианового синего. Окрашивание плодов достигается через 2-3 дня. Раствор состоит из следующих компонентов: 1) этиловый спирт 96- 80 мл; 2) ледяная уксусная кислота 20 мл; 3) альциановый синий -15 мг. Раствор необходимо менять ежедневно. После окрашивания производят обезвоживание плодов в абсолютном спирте в течение 5 дней. Из спирта плоды переносят в 1% раствор КОН на 3-4 дня для просветления мягких тканей плодов. Когда кости становятся ясно видимыми через ткань, плоды вынимают из щелочи, промывают водопроводной водой и окрашивают 0,001% ализарином, растворенном в 1% КОН в течение 2-5 суток. Затем для обезвоживания, проводят по водным растворам глицерина возрастающей концентрации - 25, 50, 80 %. Пребывание плодов в каждом растворе глицерина - 1 день. Плоды хранят в чистом глицерине. Результаты окрашивания: кость - красно-фиолетовая, хрящ - голубой (приложение 3, 5). Окрашивание скелета эмбрионов по методу Петерса (дифференцированное окрашивание ализарином и альциановым синим) позволяет визуально оценивать состояния и хрящевой, и костной ткани и обнаруживать аномалии формирования опорно-двигательной системы во время хондро - и остеогенеза [18, 80, 81, 133, 159, 170,182,200,218,219].
Подобный подход был использован в настоящем исследовании при оценке костной и хрящевой системы и позволил провести более полный анализ состояния опорно-двигательной системы эмбрионов по сравнению с методом Доусона (приложение 3-5). Исследование влияния афобазола на индуцированные циклофосфамидом ДНК -повреждения проводили методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток или «ДНК- комет» в клетках эмбрионов и плацент полученных от модельных животных. Метод, основанный на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, позволяет учитывать степень повреждения ДНК, используя в качестве показателя поврежденности «% ДНК в хвосте» и рекомендован для оценки патогенетической роли первичных ДНК - повреждений в формировании ряда патологий [44].
Оценка влияния афобазола на тератогенез индуцированный циклофосфамидом
При внешнем осмотре плодов подвергнутых действию циклофосфамида было выявлено большое число грубых аномалий развития . Афобазол в диапазоне доз 1-100 мг/кг при однократном совместном введении с тератогеном дозозависимо уменьшал количество эмбрионов с грубыми повреждениями, такими как менингоэнцефалоцеле, краниошизис, микрогнатия, гипогнатия, протрузия языка, омфалоцеле, тератома в 2 - 8 раза (таб. 5). Число эмбрионов с микроцефалией, микромелией (при введении афобазола в дозе 1 и 100 мг/кг), омфалоцеле, ахейрией, аподией, олигодактелией передних конечностей (при введении афобазола в дозе 100 мг/кг) снизилось до нулевого уровня. Более выраженное протекторное действие наблюдалось при введении афобазола в дозе 100 мг/кг. По отношению к отдельным показателям, афобазол в дозе 10 мг/кг оказывал менее выраженное защитное действие по сравнению с дозами 1 и 100 мг/кг. Таким образом, при макроскопическом исследовании плодов было установлено, что афобазол при однократном введении в дозах 1-100 мг/кг статистически зна чимо, дозозависимо снижает количество внешних аномалий, вызванных цикло-фосфамидом.
Изучение состояния внутренних органов плодов крыс, получавших циклофос-фамид, выявило различные аномалии головного мозга, небных отростков, почек, сердца (приложение 2). Количество эмбрионов с патологией развития внутренних органов снижалось во всех группах животных, получавших афобазол Наиболее эффективное действие афобазол оказывал в дозах 1 и 100 мг/кг. При его использовании в дозе 1 мг/кг количество эмбрионов с гидроцефалией, гидронефрозом и ураношизисом уменьшилось почти в 2 раза, а с дисплазией сердца в 3,4 раза. В дозе 10 мг/кг афобазол достоверно снижал гидроцефалию в 1,5 и дисплазию сердца в 2,3 раза. Более выраженный защитный эффект афобазол оказывал в дозе 100 мг/кг: число эмбрионов с гидроцефалией, гидронефрозом и ураношизисом снизилось в среднем в 2 раза, а с дисплазией сердца до нулевого уровня. Таким образом, афобазол при однократном введении значимо уменьшает число аномалий внутренних органов плодов, индуцированных циклофосфамидом. Наиболее выраженное, статистически значимое снижение количества аномалий под влиянием афобазола наблюдается в дозах 1 и 100 мг/кг. Во всех группах животных получавших афобазол, количество эмбрионов с аномалиями скелета снижалось. В дозах 1 и 100 мг/кг афобазол увеличивал количест во точек окостенения в пястне (1 мг/кг), плюсне, а также число позвонков до уровня контрольных значений. Под влиянием афобазола в дозе 10 мг/кг выявлено достоверное, но менее выраженное улучшение всех исследуемых показателей. Было установлено, что афобазол во всех использованных дозах улучшает показатели осификации точек окостенения. Более выраженное действие афобазол оказывал в дозах 1 и 100 мг/кг. При исследовании животных в группе негативного контроля (ЦФА) было выявлено большое количество грубых аномалий костной системы. Афобазол во всех использованных дозах дозозависимо уменьшал число эмбрионов с повреждениями .
Из данных, приведенных в таблице, следует, что под влиянием афобазола в дозе 1 и 10 мг/кг, количество плодов с такими грубыми дефектами, как акрания, дис-морфия челюсти, сколиоз, spina bifida, достоверно снижались в 4-8 раз по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида. При введении афобазола в дозе 100 мг/кг, количество эмбрионов с акранией и дисморфией челюсти уменьшилось до 1,4 %. Такие показатели как сколиоз и spina bifida в этой группе вообще не были выявлены. Наблюдалось также дозозависимое снижение количества эмбрионов с аномальным разрастанием хрящевой ткани (приложение 3). В группе животных обработанных ЦФА, количество эмбрионов с диспластиче-скими изменениями в области пястны было более 60 %, а в области плюсны в среднем - 80 %. Достоверное снижение количества эмбрионов с этой патологией отмечено при введении афобазола в дозе 10 и 100 мг/кг. Таким образом, афобазол при однократном введении, статистически значимо уменьшает количество грубых аномалий костной системы в диапазоне доз 1-100 мг/кг. В дозах 10 и 100 мг/кг афобазол достоверно уменьшает число эмбрионов с аномальным формированием хрящевой ткани конечностей. Приведенные результаты позволяют заключить, что афобазол дозозависимо снижает тератогенное действие циклофосфамида при однократном введении препаратов.
