Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Механизмы канцерогенеза 8
Стадия трансформации (инициации) 8
Стадия промоции 9
Стадия прогрессии и специфика метастазирования 9
1.2. Особенности метаболизма опухолевых клеток 11
1.3. Эмбрионизация опухоли и некоторые аспекты экспериментального воздействия на этот процесс 13
1.4. Возможные способы лечения злокачественных опухолей 21
Оперативное лечение 21
Лучевая терапия 22
Лекарственная терапия (моноклональные антитела и вакцинотерапия злокачественных новообразований) 23
Глава 2. Метериалы и методы исследования 37
2.1. Объекты исследования 41
2.1.1. Метод получения биостимулятора плацентарного 41
2.1.2. Метод получения опухолевого экстракта (ОЭ) из ЛСП 41
2.1.3. Метод получения эмбрионального экстракта (ЭЭ) 43
2.2. Стандартизация экстрактов 46
2.3. Метод перевивки опухоли 48
2.4. Краткая характеристика лимфосаркомы Плисса 48
2.5. Метод резекции опухоли 51
2.6. Методы гистологического исследования тканей 54
2.7. Методы исследования влияния экстрактов на Т-клеточный иммунитет 55
2.7.1. Методика исследования реакции торможения миграции лейкоцитов 55
2.7.2. Методика изучения влияния препаратов на протекание реакции гиперчувствительности замедленного типа
Глава 3. Оценка потенциальной бластомогенной активности экстрактов 56
Глава 4. Изучение влияния экстрактов на рост лимфосаркомы Плисса 59
Глава 5. Результаты оценки влияния экстрактов на некоторые показатели Т-клеточного иммунитета 69
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 75
Выводы 91
Список литературы 93
Приложение 110
- Эмбрионизация опухоли и некоторые аспекты экспериментального воздействия на этот процесс
- Лекарственная терапия (моноклональные антитела и вакцинотерапия злокачественных новообразований)
- Методика изучения влияния препаратов на протекание реакции гиперчувствительности замедленного типа
- Изучение влияния экстрактов на рост лимфосаркомы Плисса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Онкологические заболевания — тяжелейший недуг, борьба с которым является одной из актуальных задач современной медицины (Ginsberg G. L., 2003; Hitt Е., 2003). Они занимают второе место по смертности после сердечно-сосудистой патологии. Основной задачей фармакотерапии опухолевых заболеваний является создание препаратов, селективно воздействующих на трансформированные клетки и не повреждающих при этом здоровые ткани (Dima V. F. et al., 2001; Dodd P.M. et al., 1999; Mine Т., 2004). Выполнение этой задачи осложняется сходством многих биохимических свойств здоровых и опухолевых тканей, а также чрезвычайным разнообразием опухолей.
Интенсивная полихимиотерапия, применяемая отдельно или в сочетании с лучевой терапией, считается достаточно эффективным противореци-дивным воздействием. Однако, она сопровождается такими лекарственными осложнениями, как миело-, гепато-, нефро- и кардиотоксичность. Кроме того, на фоне применения этих методов лечения могут возникнуть вторичные опухоли в виде лейкозов, фибро- и лимфосарком (Whiteheuse J.M.A., 1985). По данным Р.Н. Sugarbaker et al. (1996) латентный период возникновения вторичных опухолей, индуцированных полихимиотерапией, составляет в среднем 10-12 лет, однако большинство больных до этого срока не доживает. В связи с этим необходим поиск принципиально новых антибластомогенных воздействий, которые смогут повысить безрецидивную выживаемость организма после радикального удаления опухоли. К такому перспективному направлению относится иммунотерапия, которая включает применение различных тканей и биологически активных веществ (БАВ) эмбриона, плода, плаценты и самой опухоли для лечения злокачественных новообразований (Гри-невич Ю.А., Фильчаков Ф.В., 2003; Berzofsky J.A. et al., 2004).
В отдельных экспериментальных и клинических исследованиях было продемонстрировано, что эмбриональные экстракты (ЭЭ) способны ингиби- ровать пролиферацию неопластически трансформированных клеток как Іп vitro, так in vivo за счет активации антионкогена р53 и стимуляции апоптоза (Biava P.M. et al., 1997). Резкое снижение имплантационной способности опухолевых клеток (после экстравазии) можно наблюдать и на фоне активной иммунотерапии организма опухолевыми антигенами. Индуцированный иммунизацией противоопухолевый иммунитет оказывал селективное цито-токсическое действие не только на неопластически трансформированные клетки перевиваемых штаммов опухолей, но и на неоплазии, вызванные химическими и биологическими канцерогенами (Бергольц В.М., 1970; Bystryn J.C. et al., 1999; Soiffer R. et al., 2003). Однако, известно, что активированный иммунотерапией противораковый иммунитет недостаточно силен, чтобы элиминировать из организма активно растущую опухоль, но может быть достаточно эффективным для ингибирования пролиферации и диссеминации относительно небольшого числа опухолевых клеток (Семерников В. А., Колесник Е. А., 2000; Berzofsky J.A. et al, 2004; Nemunaitis J. et al., 2004). Следовательно, несмотря на подтверждение перспективности данного подхода к профилактике рецидивов, он недостаточно подкреплен экспериментальными доказательствами. Поэтому актуально определение тех условий, при которых применение активной иммунотерапии после циторедуктивных операций сможет обеспечить оптимальный противорецидивный эффект.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение противоопухолевых свойств опухолевого и эмбрионального экстрактов для определения возможности их использования в профилактике рецидивов лимфосаркомы после резекции опухоли.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработать метод резекции лимфосаркомы Плисса для создания экспериментальной модели постоперационного периода в опытах in vivo.
Получить различные экстракты из опухоли и из гомогената эмбриональной ткани, пригодные для парентерального введения.
Изучить влияние полученных экстрактов на рост лимфосаркомы Плисса у крыс после удаления опухоли.
Оценить антибластомогенное действие опухолевого и эмбрионального экстрактов и определить оптимальные условия их введения животным с лимфосаркомой Плисса.
Исследовать некоторые механизмы противорецидивного (антиметастиче-ского) действия перечисленных экстрактов.
Работа выполнена в рамках программы НИР СПХФА по направлению «Разработка лекарственных средств, лекарственных форм и методов их анализа».
Научная новизна. Впервые использованы опухолевый и эмбриональный экстракты для активной иммунотерапии после резекции лимфосаркомы Плисса у крыс, находящихся в терминальной стадии. Доказана неэффективность применения экстрактов из опухолевой и эмбриональной ткани в качестве средств монотерапии агрессивных форм опухолей. Определены условия, при которых введение экстрактов обеспечивает полное излечение крыс (без полихимио- и лучевой терапии) после радикального удаления опухоли, в том числе и в терминальной стадии. Доказана в эксперименте иммуномодули-рующая активность опухолевого и эмбрионального экстрактов. Выявлена связь между противоопухолевым эффектом экстрактов и активацией цито-токсического Т-клеточного иммунитета у животных после резекции лимфосаркомы Плисса.
Научно-практическая значимость. Предложена экспериментальная модель, позволяющая изучать влияние активной иммунотерапии на безрецидивную выживаемость крыс, перенесших радикальное удаление злокачественной опухоли и всех метастазов. Разработана мерадикального тодика удаления лимфосаркомы Плиса у крыс. Предложенный в результате исследования методический подход к получению опухолевого экстракта из аутохтон-ной опухоли может послужить основой для разработки технологии таких экстрактов и создания препаратов на их основе.
Положения, выносимые на защиту
Активная иммунотерапия экстрактом из лимфосаркомы Плисса приводит к полному излечению организма животных после радикального удаления саркомы при условии отсутствия местного рецидива
Радикальное удаление лимфосаркомы Плисса локализованной в боковой области живота не предотвращает рецидив опухоли
Экстракт из лимфосаркомы Плисса создает стойкий противоопухолевый иммунитет за счет стимуляции Т-клеточного иммунитета
Наиболее эффективно комбинированное применение опухолевого и эм брионального экстрактов для повышения безрецидивной выживаемости крыс после резекции лимфосаркомы Плисса.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на заседании общества фармакологов в институте экспериментальной медицины РАН (Санкт-Петербург, 1998), VI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999), Международной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" (С-Петербург, 1999) и на обществе онкологов в Кутаисском национальном онкологическом центре (2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на^.^страницах, содержит-/.^таблиц,-/^рисунков. Библиографический указатель включает в себя>* источников литературы, в том числе-^на иностранных языках.
Эмбрионизация опухоли и некоторые аспекты экспериментального воздействия на этот процесс
В нормальных тканях с развитием дифференцировки, т. е. с повышением их специализации и снижением плюрипотентности, прогрессивно понижается способность клеток к митозу, что обычно выражается пределом Хейфлика (наиболее плюрипотентная эмбриональная клетка живет не более 50 делений). Клетки же с активированными генами иммортализации приобретают три основных свойства: 1. Они постоянно пролиферируют, т. е. для них не существует ограничений, обусловленных пределом Хейфлика; 2. У них блокирован процесс конечной дифференцировки; 3. Они могут вступить в процесс промоции, индуцированный химическим канцерогеном. Именно активацией онкогенов, как во время эмбриогенеза, так и канцерогенеза, можно объяснить экспрессию эмбриональных белков. Иногда, синтез эмбриональных белков связывают с дедифференцировкой или наоборот ингибированием дифференцировки опухолевых клеток. Сам факт морфофункционального сходства опухолевых и эмбриональных тканей указывает на то, что эмбрионизация опухоли, очевидно, является не только следствием опухолевой прогрессии, но и, вероятно, имеет прямое отношение к опухо-леобразованию. Дело в том, что в эмбриональных тканях присутствие этих антигенов обеспечивает развивающимся клеткам высокую и эффективную метаболическую активность, что связано с необходимостью быстрых темпов роста тканей. После рождения участки генов, кодирующие эти пептиды утрачивают свою активность и синтез фетальных антигенов прекращается. В опухолевых клетках повторно активируются гены, присущие фетальным тканям, обеспечивая тем самым неопластически трансформированным клеткам активацию метаболизма и значительно большую скорость пролиферации. Учитывая все эти общие черты эмбриональных и опухолевых клеток, интересно еще раз рассмотреть с точки зрения иммунологии физиологические аспекты течения беременности. Известно, что после имплантации бластоцисты и установления плацентарной связи плода и матери беременность продолжается, несмотря на то, что зародыш (также как и опухоль) в антигенном отношении чужероден материнскому организму. Почему гомотрансплантат-зародыш не отторгается?
Существует мнение, что мать и плод постоянно находятся в состоянии взаимной иммунологической несовместимости. Зародыш, согласно этому взгляду, можно рассматривать как гомотрансплантат. Антигенная характеристика тканей зародыша и материнских тканей может оказаться существенно различной. Рассматривается роль HLA системы в процессе сохранения плода в организме матери. Особая роль отводится HLA-G молекулам, которые специфически экспрессируются на экстраворсинчатом трофобласте, клетках фетального происхождения, которые инвазируют материнскую ткань плаценты. Считается, что молекулы HLA-G троф об ласта могут защищать эмбрион, ткани которого экспрессируют HLA-A, В и С молекулы отца, от действия материнских естественных клеток киллеров в децидуальной оболочке (Parham P., 1998), Иммунологические реакции, возникающие в организме женщины (выработка антител, воспалительные процессы), могут оказаться факторами, приводящими к гибели яйцеклетки и зародыша на стадии бластоцисты, приводя к самопроизвольному аборту, мертворождению или к возникновению гемолитической болезни плода и других врожденных заболеваний.
Отмечено, что иммунная реакция на антигены, содержащиеся в тканях зародыша и плаценты, может обусловить развитие у беременной женщины токсикоза беременности. Эти явления можно объяснить, если принять во внимание установленные факты о проницаемости плаценты как для клеточных элементов крови плода, так и для антител, содержащихся в материнской крови. Однако, указанные патологические проявления иммунологической несовместимости организма матери и плода — редкие исключения, и они неизмеримо более редки, чем явления несовместимости тканей и органов при пересадках.
Во время беременности в связи с изменением деятельности желез внутренней секреции снижается иммунологическая реактивность женского организма. Предполагают, что у материнского организма вырабатывается толерантное состояние в отношении антигенов тканей зародыша, и он становится арсактивным. Аналогичное состояние возникает и в процессе роста опухоли. Многие исследователи решающее значение придают барьерной функции плаценты и плодных оболочек. Считают, что плацента, прочная перегородка между матерью и плодом, может избирательно пропускать совместимые и задерживать несовместимые изоантитела материнской крови. Высказываются предположения и о том, что защита матери от антигенов плода и защита плода от антигенов матери обеспечивается благодаря антигенной нейтральности тканей плаценты. Исследования на зрелых тканях показали, что регуляторами выживания и гибели клеток на ауто- и паракринном уровне являются цитокины. Эти сигналы клеткоспецифичны. Центральная роль в регуляции программированной клеточной гибели (ПКГ) в процессе эмбриогенеза принадлежит воспалительному цитокину — фактору некроза опухоли (ФНО), который способен индуцировать апоптоз как в трансформированных, так и в нормальных клетках. Было обнаружено, что предимплантационные эмбрионы вплоть до стадии бластоцисты секретируют ФНО, но сами состоят из клеток, не имеющих к нему рецепторов. Следовательно, на этом этапе ФНО участвует не в эмбриогенезе, а обеспечивает выживание эмбриона, подавляя материнскую иммунную реакцию натуральных киллеров на феталь-ные антигены.
Плод — трансплантат, содержащий унаследованные от отца антигены, чужеродные для материнского организма. Материнскому организму необходимы механизмы, которые бы избирательно обеспечили ослабление иммунной атаки против антигенов эмбриона. Партеногенетическое развитие яйцеклеток у человека прекращается в момент, когда должна начать формироваться плацента. При браках партнеров, очень близких или совпадающих по набору ГКГС плацентогенез нарушается. Это свидетельствует о том, что умеренная степень антигенной чужеродности матери и плода необходима для контролируемого конфликта между ними, запускающего процесс образования плаценты. В связи с этим, анафилактические реакции матери и плода и механизмы ГЗТ, контролирующие продуктивное воспаление, считаются важными для самого формирования плаценты. Один из таких простейших механизмов - экранирование эмбриональных антигенов. На границе тканей матери и эмбриона протекают анафилактические реакции, приводящие к образованию микротромбов, экранирующих эмбриональные антигены от иммунной системы матери. Сходной, вероятно, является ситуация с опухолями. На границе опухолевой и здоровой ткани развиваются анафилактические реакции, в результате которых формируются микротромбы, экранирующие опухолевые антигены (которые организм принимает за эмбриональные).
Лекарственная терапия (моноклональные антитела и вакцинотерапия злокачественных новообразований)
Основными задачами лекарственной терапии злокачественных опухолей являются: достижение полной ремиссии, увеличение частоты и длительности полных ремиссии, продолжительности жизни больных и улучшение качества жизни. Однако в качестве монотерапии лекарственная терапия менее эффективна по сравнению с хирургическим и лучевым методами, особенно на ранних этапах опухолевого роста и при высокодифференцированных опухолях, В настоящее время лекарственная терапия опухолей включает назначение: гормональных препаратов, иммуномодуляторов и цитостатиков (цик-лоспецифических и циклонеспецифических). Механизм действия большинства последних заключается в нарушении синтеза нуклеиновых кислот, блокаде ферментов, нарушении биохимических процессов в клетке. Все это способствует задержке митозов (цитостатическое действие) или разрушению клеток (цитотоксическое действие). При этом наряду с торможением и гибелью опухолевых клеток повреждаются и другие интенсивно делящиеся ткани (костный мозг, слизистая желудочно-кишечного тракта, лимфатические узлы и т.д.). В этом проявляется высокая токсичность цитостатиков, существенно ограничивающая их широкое применение в качестве противоопухолевых средств.
Чтобы повысить концентрацию цитостатиков в опухолевой ткани, была предложена изолированная перфузия опухолей. Для этого с помощью хирургического доступа на артерию и вену проксимальнее опухоли накладывают зажимы. Оба сосуда катетеризируют и соединяют с системой для экстракорпорального кровообращения, которую промывают раствором Рингера. Перфузия опухолевой ткани цитостатиками может продолжаться от 45 минут до 2 часов. (Bramwell VHC, Wallace S., Krementz ET., 1988). Считается, что изолированная перфузия позволяет достичь высокой местной концентрации хи-миотерапевтического препарата в крови и тканях при минимальной утечке в системный кровоток (McBride СМ., Muchmore I.H., 1974). Однако именно низкая концентрация цитостатиков в системном кровотоке при изолированной перфузии оказывается недостаточной для лечения отдаленных микрометастазов, которые через определенный промежуток времени дадут о себе знать и прогноз остается неблагоприятным.
В последнее время для повышения безрецидивной выживаемости онкобольных признана целесообразной иммунотерапия (Фигурин К.М., Ка-дагидзе 3.П., 1996), которая в перспективе может обеспечить полное выздоровление, поскольку ориентирована не только на саму опухоль, но и на ее метастазы. Речь идет в первую очередь об использовании противоопухолевых вакцин и цитотоксических моноклональных антител. Как показали исследования, введение в организм больных раком различных продуктов природного происхождения резко уменьшает частоту возникновения рецидивов и повышает выживаемость больных (Воробьев А.А., 1999; Карелин М.И., Свадов-ский А.И. и др., 1996; Колесник Е. А. и др., 1999; Потебня Г. П. и др., 2000; Belldegran Т., 1997; Bodey В., 1998; Douillard J.Y., 1998; Ebina Т., 1998; Foelber R., 1998; Harminen J., 1996; Holcombe R.F., 1998; Horvath J.C., 1999; Ishihara Y, 1998; Miyazaki K., 1998; Oberg K., 1998; Oppenheim J J., 1997; Srivastava R.K., 1999; Stark J.J., 1998; Zubelewicz В., 1998).
Моноклональные антитела наряду с культивируемыми ex vivo опухоль-инфильтрирующими лимфоцитами (TIL) и лимфокинактивированными киллерами (LAK) являются методами пассивной иммунотерапии злокачественных опухолей (Multani P., Grossbard М., 1998; Rosenberg S., 1997). В настоящее время известно три класса цитотоксических моноклональ-ных антител (Моисеенко В.М., 1997). Первый класс включает неконъюгиро-ванньге антитела, которые сами способны вызывать гибель опухолевых клеток. Два других класса представлены антителами конъюгированными с токсинами и изотопами. Типичное антитело является иммуноглобулином, состоит из четырех цепей (двух легких и двух тяжелых) и имеет постоянный и гипервариабельный домены. Постоянным доменом антитело фиксируется к Fc-рецептору цитотоксического лимфоцита, а гипервариабельным доменом к соответствующему антигену.
1. Наиболее значимыми являются первые три механизма. При реализации комплемент-зависимой цитотоксичности после связывания антителом антигена на поверхности опухолевой клетки активизируется многоэтапная система комплемента. На последнем ее этапе образуется белок С9, способный формировать отверстия в базальной мембране клетки, что в конечном счете приводит её к гибели. Вторым важным механизмом является антитело-зависимая цитотоксичность. При этом моноклональное антитело своим гипервариабельным доменом связывается с соответствующим антигеном на поверхности опухолевой клетки, а постоянным доменом с Fc-рецептором цитотоксического лимфоцита, так называемых "киллеров". Последние способны синтезировать и выделять белки - перфорины (подобен протеину С9 системы комплемента) и сериновые протеазы, повреждающие клеточную мембрану.
Третьим важным механизмом противоопухолевого действия монокло-нальных антител является , так называемый, механизм Ав2 вакцины. Он реализуется при использовании моноклональных антител, содержащих чужеродный (чаще всего мышиный) белок. В ответ на его введение образуются антиидиотипические антитела, способные связываться с поверхностным опухолевым антигеном и запускать один из указанных механизмов цитотоксич-ности.
В настоящее время предпринимаются усилия с целью повышения эффективности терапии моноклональными антителами. Прежде всего это повышение их биологической активности, Наиболее перспективным в этом плане считается получение биспецифических антител. Биспецифическое антитело одним плечом гипервариабельного домена связывается с поверхностным антигеном опухолевой клетки, а другим с антигенным рецептором Т-клетки, что обеспечивает их тесный контакт.
Методика изучения влияния препаратов на протекание реакции гиперчувствительности замедленного типа
Объектами фармакологического исследования служили: опухолевый экстракт (ОЭ), эмбриональный экстракт (ЭЭ), экстракт из мышечной ткани (ЭМТ) и плацентарный биостимулятор (ПБС). Сырье для ПБС получали из крысиной плаценты на 20-22 сутки беременности. Полученный по методике Мучника СР. (1963) ПБС имел следующие показатели: рН от 6.4 до 7.4, плотный осадок от 4 до 7 %. Содержание белка в препарате колебалось от 3.5 до 4.5 %. Опухолевый экстракт получали по модифицированной методике Holmes Е.С. (1970) из лимфосаркомы Плисса, а ЭМТ по той же методике из мышечной ткани. Эмбриональный экстракт готовили из тканей 7-10 дневных крысиных эмбрионов по методике Biava P.M. (1997). Стандартизацию экстрактов осуществляли по содержанию общего белка и ДНК (Шамардин В.А., Тугамбаев Т.И., 1983).
На следующем этапе эксперименты были выполнены на белых беспородных крысах самцах (п=201), полученных из питомника «Рапполово» РАН (сертификат имеется), с исходной массой тела 170-190 г. Их содержали в условиях вивария на стандартном рационе питания в соответствии с действующими нормами. Животных разделили на 10 групп (табл. 1).
Потенциальную бластомогенную активность экстрактов изучали в группе №1 (подкожное введение ОЭ осуществляли 4-кратно с интервалом 10 дней в дозе 400 мг/кг) и в группе №2 (подкожную инъекцию ЭЭ в дозе 200 мг/кг производили ежедневно, в течение 10 дней). За всеми животными устанавливалось тщательное наблюдение. В соответствии с рекомендация ми через 5 и 14 месяцев после введения экстрактов оценивали общее состояние организма животных и изучали состояние гомеостаза по ряду показателей белкового, углеводного и жирового обмена (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000).
Крысам всех остальных подопытных групп прививали подкожно в область живота (regio abdominalis lateralis) 50 % клеточную суспензию лимфосаркомы Плисса (ЛСП) в объеме 0,2 мл. Клеточную суспензию готовили на физиологическом растворе в строго асептических условиях. Группа №3 служила контролем (табл. 1). Животные 4-й группы ежедневно (начиная с момента прививки опухоли) в течение 10 дней получали плацентарный биостимулятор подкожно в дозе 1 мл/кг. Крысам 5-й группы на 5-е сутки после прививки опухоли производили, соблюдая правила асептики и абластики, резекцию Л СП. Животным 6-й группы за 21 день до прививки ЛСП вводили однократно опухолевый экстракт (ОЭ) в дозе 40 мг/кг. На 5-е сутки после прививки ЛСП опухоль удаляли и затем два раза с интервалом в 7 дней вводили ОЭ в той же дозе. В группе №7 у крыс ЛСП резецировали на 5-е сутки после прививки опухоли, а затем подкожно вводили ОЭ (в дозе 40 мг/кг) 4-х кратно с интервалом 10 дней. В отличие от группы №7 животные из 8-й группы после удаления опухоли получали ежедневно подкожно эмбриональный экстракт (ЭЭ) в дозе 20 мг/кг в течение 10 дней. Крысам 9-й группы производили резекцию опухоли на 5-22 сутки после прививки ЛСП (из них 33% крыс было прооперировано на 5-8 сутки (ранние сроки), а 67% — на 12-22 сутки (поздние сроки). После операции животные получали эмбриональный экстракт (ЭЭ) ежедневно подкожно в дозе 20 мг/кг в течение 10 дней и ОЭ трехкратно в дозе 40 мг/кг с интервалом 10 дней. В группе №10 резецировали ЛСП в терминальной стадии на 14-22 сутки после прививки опухоли и далее осуществляли подкожное введение только ОЭ (в дозе 40 мг/кг) 4-х кратно с интервалом 10 дней. Во всех группах оценивали: продолжительность латентного периода опухолевого роста; массу саркомы; массовую долю опухоли (или рецидива) после гибели животного; наличие или отсутствие метастазов (генерализация процесса); динамику выживаемости крыс в течение 150 дней с момента прививки опухоли; динамику летальности крыс в течение 150 дней с момента прививки ЛСП; наличие или отсутствие признаков опухолевого роста при гистологическом исследовании у выживших животных (через 5 и 14 месяцев); некоторые биохимические показатели (через 14 месяцев у выживших животных): концентрацию глюкозы, активность каталазы, уровень мочевины, билирубина общей крови, креатинина, холестерина и общего белка сыворотки крови. Биохимические исследования выполнены по стандартным методикам в соответствии с имеющимися рекомендациями (Козловская Л.В., Николаев А.П., 1984); Т-клеточный иммунитет на фоне применения экстрактов по тестам: in vitro - реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) и in vivo -исследование влияния препаратов на протекание реакции гиперчувствительности замедленного типа (Потемкина Е.Е. и др., 2003). При статистической обработке результатов вероятность различий считали достоверной при Р 0,05. Средние данные оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000).
Изучение влияния экстрактов на рост лимфосаркомы Плисса
На 4-5-е сутки после оплодотворения бластодермический пузырек свободно лежит в просвете рога матки. Стенка рога матки выстлана однослойным эпителием. Зародыш в это время представляет пузырек с небольшой полостью внутри. На 5-е сутки зародыш еще не соприкасается с эпителием стенки матки, но уже можно отметить изменения эпителия и 3-4 слоев соединительно-тканных клеток, прилежащих к эпителию. На 6-е сутки бластоциста приходит в контакт с эпителием матки за счет БАВ. Количество клеток трофобласта к этому времени сильно возрастает в результате мито-тических делений немногих исходных клеток. В месте контакта бластоци-сты со слизистой оболочкой формируется отек, в отечную строму погружается зародыш. В процессе имплантации клетки трофобласта полностью ли-зируют прилегающий к ним эпителиальный слой. Клетки трофобласта становятся гигантскими, образуют синцитий, соединяясь друг с другом своими отростками. К этому времени активизируются фагоцитарные реакции. Клетки трофобласта фагоцитируют ядра и продукты распада лизирующихся эпителиальных клеток и лейкоцитов. Предполагают, что при имплантации питание зародыша осуществляется в значительной мере за счет разрушаемых им клеток эпителия и подлежащих децидуальных клеток (Дондуа А. И. и др., 1983). Немного позднее, когда зародыш оказывается окруженным со всех сторон материнской кровью, клетки трофобласта активно фагоцитируют в большом количестве также эритроциты и лейкоциты.
Ткань 6-7 дневного крысиного эмбриона получали следующим образом. На 7-е сутки беременности у самки под эфирным наркозом производили экстирпацию матки и помещали ее в чашку Петри с физиологическим раствором. При помощи пинцета тупым методом вскрывали матку по анти-мезометриальному краю каждого места имплантации, обнажая децидуаль-ную капсулу. Скользящим движением пинцета вдоль мезометриальной стенки матки отделяли децидуальную капсулу с зародышем и, разорвав капсулу, извлекали эмбрионы. Затем фиксировали положение эмбриона, введя сложенные концы пинцета в желточную полость сразу под эктоплацентарным конусом. Поставив в то же положение сложенные концы второго пинцета и прижав, вводили их в направлении эмбрионального конуса. Удалив оболочку Рейхарта, из эмбриона выделяли фрагменты и промывали холодным физиологическим раствором.
Эмбриональная ткань содержит значительное количество воды, балластных белков, липидов, минеральных веществ, продуктов клеточного обмена. Сырье чрезвычайно лабильно и быстро портится в связи с невысокой устойчивостью к действию микроорганизмов, ферментов, стимулирующих гидролитические окислительные процессы, и других факторов. Поэтому все процедуры проводили на холоду при Т=0-2 С без использования криокон-сервантов. Инструменты и реактивы, использовавшиеся в эксперименте, предварительно охлаждали. Эмбриональные фрагменты, получаемые по выше описанной методике, высушивали стерильной фильтровальной бумагой и взвешивали. После взвешивания эмбриональные фрагменты вновь промывали физиологическим раствором и помещали в охлажденный стеклянный гомогенизатор или в ступку.
В охлажденном гомогенизаторе или в ступке эмбриональную ткань тщательно измельчали ножницами, а потом пестиком превращали сырье в гомогенат.
Экстракцию осуществляли водно-солевыми растворами методом мацерации. В качестве экстрагента использовали стерильный 0,9% раствор хлорида натрия. Гомогенат заливали охлажденным экстрагентом в соотношении 1:8 и экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 15-20 ч. при Т 0 С. После этого смесь переносили в делительную воронку и проводили очистку. Липофильные соединения удаляли из водно-солевого экстракта способом экстракции в системах жидкость-жидкость. Этот процесс складывается из следующих стадий: смешивание исходного раствора с экстрагентом для создания между ними тесного контакта, разделение двух несмешивающихся жидких фаз и удаление неполярного растворителя из водно-солевого экстракта. Для этого к эмбриональному гомогенату, приготовленному на физиологическом растворе, прибавляли охлажденную эфирно-хлороформную смесь в соотношении 1:10 и перемешивали в течение 3-5 мин. Затем нижний органический слой отделяли и весь цикл повторяли 2-3 раза. Верхний слой переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали 5 мин. при 1000 g. Надосадочную жидкость после центрифугирования переносили в стерильный флакон и хранили при низкой температуре. Конечный продукт представлял собой прозрачную жидкость телесного цвета. рН водно-солевого ЭЭ от 6,2 до 7,1, а содержание белка 15-20 мг/мл.
