Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Апоптоз и другие пути гибели клеток 10
1.1.1. Молекулярные механизмы апоптоза 13
1.2. Гестагены 18
1.2.1. Молекулярные механизмы действия гестагенов 19
1.2.2. Рецепторы прогестерона 19
1.2.3. Мишени рецепторов прогестерона 23
1.3. Антрациклиновые антибиотики 31
1.3.1. Противоопухолевая активность антрациклинов 32
1.3.2. Влияние антрациклинов на активность топоизомеразы II 32
1.3.3. Антрациклины и апоптоз. Роль повреждения ДНК и белка р53 33
1.3.4. Дополнительные механизмы действия антрациклинов 35
1.4. Основные принципы лекарственной терапии злокачественных новообразований 39
1.5. Гестагены, апоптоз и антрациклиновые антибиотики 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Химическая структура изучаемых гестагенов 51
2.2 Используемые реактивы 54
2.3. Объекты исследования 55
2.4. Метод культивирования клеток (Фрешни, 1989) 55
2.5. Методы оценки противоопухолевой активности изучаемых соединений 55
2.5.1. Интегральный МТТ-тест оценки жизнеспособности и метаболической активности опухолевых клеток (Mealey, 2002) 55
2.5.2. Оценка экспрессии онкобелка bcl-2 методом иммуногистохимического окрашивания 56
2.5.3. Колориметрическое измерение активности каспазы 3 58
2.5.4. Выделение ДНК из образца клеток методом фенол-хлороформной экстракции 59
2.5.5. Определение количества ДНК в образце 60
2.5.6. Электрофорез экстракта геномной ДНК в агарозном геле и флуориметрическая оценка апоптоза в культуре клеток 60
2.6. Статистическая обработка результатов 63
ГЛАВА 3. Результаты работы 64
3.1. Влияние новых гестагенов и доксорубицина на жизнеспособность опухолевых клеток линий MCF-7 и HeLa 64
3.1.1. Цитостатическая активность новых гестагенов на культурах клеток. Концентрационная и временная зависимости 64
3.1.2. Подавление жизнеспособности клеток культуры MCF-7 под действием гестагенов 67
3.1.3. Подавление жизнеспособности клеток культуры MCF-7 под действием доксорубицина в сочетании с гестагенами 69
3.1.4. Подавление жизнеспособности клеток культуры HeLa под действием гестагенов 72
3.1.5. Подавление жизнеспособности клеток культуры HeLa под действием доксорубицина в сочетании с гестагенами 73
3.2. Индукция апоптоза под действием гестагенов 76
3.2.1. Фрагментация ДНК в культуре клеток MCF-7 под действием гестагенов 76
3.2.2. Фрагментация ДНК в культуре клеток MCF-7 под действием доксорубицина 78
3.2.3. Апоптоз в культуре клеток MCF-7 под действием гестагенов в комбинации с доксорубицином 82
3.2.4. Экспрессия антиапоптотического белка Вс1-2 в культуре клеток MCF-7 при инкубации с гестагенами и доксорубицином 85
3.2.5. Активность каспазы 3 в культуре клеток HeLa при инкубации с гестагенами и доксорубицином 88
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 93
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы 112
- Антрациклиновые антибиотики
- Метод культивирования клеток (Фрешни, 1989)
- Колориметрическое измерение активности каспазы
- Индукция апоптоза под действием гестагенов
Введение к работе
Актуальность работы.
По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) смертность от злокачественных новообразований в развитых странах занимает третье место в структуре общей смертности, уступая лишь ишемической болезни сердца и цереброваскулярным нарушениям [1]. Среди онкологических заболеваний существенную часть представляют опухоли репродуктивной системы. Так, рак молочной железы (РМЖ) - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль и причина смерти. По данным ВОЗ, в мире наблюдается и проходит лечение более 11 млн. женщин с диагнозом РМЖ [1]. Каждый год регистрируется 1 млн. 200 тыс. новых случаев заболевания [2]. Ежегодно от РМЖ погибает более 500 тысяч женщин [1]. Основная причина смерти от РМЖ - прогрессирование заболевания с возникновением отдаленных метастазов, поэтому в настоящее время методом выбора в лечении РМЖ является системная химиотерапия [3].
Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место по распространенности среди женщин репродуктивного возраста. В год в мире регистрируется в среднем 500000 новых случаев рака шейки матки и 250000 случаев смерти, связанной с этим заболеванием. Примерно 80% случаев РШМ приходится на страны с низким и средним уровнем развития [1]. В общей структуре заболеваемости органов репродуктивной системы женщин в России РШМ занимает 3-е место после рака молочной железы и рака тела матки. В 2002 г. в России зарегистрировано 12 285 новых случаев РШМ и 6288 смертей. Стандартизованный показатель заболеваемости РШМ на 2002 г. составил 11,6, а смертности — 5,1 на 100 000 женщин [4]. В настоящее
время четко прослеживается увеличение заболеваемости в группе женщин до 40 лет, особенно заметное повышение - до 29 лет (ежегодно на 2,1 %). Кроме того, отмечается существенный рост показателей запущенности. Удельный вес больных III—IV стадией в 19.90 г. составлял 34,2%; в 1992 г. - 37,1%; в 1995 г. - 38,8%; в 2003 г. - 39,7%,
В настоящее время химиотерапия становится важнейшим, а в некоторых случаях основным, методом лечения при злокачественных новообразованиях.
Химиотерапия при раке молочной железы применяется уже более 40 лет. В результате тестирования на противоопухолевую активность в предклинических и клинических исследованиях большого числа веществ около 50 препаратов стали доступными для практического использования. При этом 5 цитостатиков (доксорубицин, доцетаксел, эпирубицин, паклитаксел, винорельбин) позволяют получить лечебный эффект более чем у 50% пациенток. Эффективность остальных препаратов колеблется от 15 до 30%. Несмотря на все эти успехи, за весь период поиска новых средств для химиотерапии РМЖ существенно не удалось улучшить показатели выживаемости пациентов. Средняя продолжительность жизни пациентов с диссеминированным РМЖ по сравнению с 60-ыми годами ХХ-го века увеличилась в среднем не более.чем на несколько месяцев. Более того, до настоящего времени нет общепринятых стандартов лечения этой патологии. Поэтому в практической деятельности по-прежнему в качестве I и II линий химиотерапии рекомендуются схемы с антрациклиновыми антибиотиками. При дальнейшем прогрессировании опухоли (III и IV линии) - таксаны, винорельбин + 5-фторурацил, длительные инфузии 5-фторурацила [5].
При раке шейки матки на сегодняшний день лучевой и хирургический методы лечения или их комбинация считаются стандартом, но вместе с тем они имеют и свои ограничения. Увеличение объема оперативного вмешательства при местно-распространенном РШМ повышает
число осложнений, но не увеличивает выживаемость больных. Проведение лучевой терапии с использованием повышенных доз облучения ведет к уменьшению частоты местного рецидивирования, но лучевые повреждения тканей и органов малого таза лимитируют возможности дальнейшего увеличения дозы. С целью улучшения результатов лечения больных РШМ последние десятилетия изучаются возможности лекарственной терапии и ее сочетание со стандартными методами. В качестве средств химотерапии при раке шейки матки используются препараты платины и антрациклиновые антибиотики [4].
Таким образом, в современной клинической практике для лечения опухолей репродуктивной системы используются цитостатические препараты, которые нарушают жизнедеятельность опухолевых клеток и блокируют их митотическое деление. Широкое распространение и применение в клинической онкологии получили антрациклиновые антибиотики, в частности, доксорубицин (антибиотик антрациклинового ряда, выделенный из культуры Streptomyces peuceticus var. Caesius), являющийся базовым препаратом для лечения многих онкологических заболеваний. Однако, применение доксорубицина, как и других химиотерапевтических средств, сопряжено с развитием побочных эффектов, в некоторых случаях требующих снижения дозы или полной отмены препарата.
Побочные эффекты системной химиотерапии существенно снижают качество жизни пациентов, зачастую становясь причиной прекращения курса терапии. Токсическое действие цитостатических агентов на организм проявляется в первую очередь воздействиями на костномозговое кроветворение, клетки иммунной системы и функции желудочно-кишечного тракта, а также, в некоторых случаях (часто при применении препаратов платины и алкилирующих агентов), вторичной канцерогенностыо. Эти факторы, в совокупности с изнуряющими пациентов тошнотой и рвотой, нарушениями функции кожи и слизистых оболочек, заставляют снижать
дозы химиотерапевтических препаратов, что может приводить к неэффективности лечения [6].
Таким образом, успех химиотерапии зависит от применения препаратов, избирательно подавляющих злокачественные клетки и минимально затрагивающих нормальные клетки организма. Подобные эффекты можно достичь путем применения гормонотерапии в сочетании с химиотерапией в лечении гормонзависимых опухолей (образующихся из гормонзависимых тканей и сохранивших рецепторы гормонов). Несмотря на то, что раковые клетки отличает менее дифференцированная морфология, известно, что большая часть новообразований, проистекающих из гормонозависимых тканей, сохраняет рецепторный аппарат, а в некоторых случаях количество рецепторов в опухолевой ткани даже увеличивается [7]. Этот факт может быть использован для разработки новых схем лечения пациентов с гормонзависимыми опухолями.
Так как гормональные соединения могут оказывать самостоятельное влияние на опухолевый рост, дополняя действие цитостатика, то совместное применение гормональных и цитостатических препаратов позволит повысить эффективность терапии, уменьшить терапевтическую дозу и снизить токсическое воздействие препаратов на здоровые ткани. В частности, в терапии рака молочной железы на сегодняшний день выделяют такие наиболее значимые направления, как: 1) выявление новых комбинаций и режимов хорошо известных противоопухолевых препаратов (высокодозная химиотерапия, пролонгированные инфузии, еженедельное введение); 2) выявление новых эффективных при РМЖ химиотерапевтичеких средств; 3) индивидуализация лечения на основе молекулярных маркеров [5].
В комплексной терапии гормонозависимых опухолей, наряду с цитостатиками широко используются препараты на основе прогестерона -прогестагены. В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению механизмов действия прогестагенов. Все больше
данных свидетельствует о том, что прогестагены влияют на экспрессию факторов, задействованных в регуляции пролиферации и гибели (апоптоза) клеток. Однако четких данных о том, вызывают ли гестагены апоптоз, в настоящее время нет. Поэтому исследование влияния гестагенов и их сочетания с цитостатическими препаратами на апоптоз опухолевых клеток является весьма актуальной проблемой в ключе поиска новых средств и схем терапии онкологических заболеваний репродуктивных органов.
Цель работы: исследование свойств гестагенов как противоопухолевых препаратов и модуляторов сенсибилизации опухолевых клеток к химиотерапии, а также выявление молекулярных механизмов действия гестагенов на пролиферацию клеток-мишеней.
Задачи работы:
Исследовать дозовую и временную зависимость действия прогестинов на апоптоз клеток-мишеней в клеточной культуре непосредственно и в сочетании с цитостатическими средствами.
Оценить влияние прогестинов на уровень экспрессии факторов роста и апоптоза.
Отобрать наиболее эффективные соединения и сочетания соединений на основании полученных данных.
Антрациклиновые антибиотики
Антрациклиновые антибиотики используются в клинической практике более 40 лет. Применение этих лекарственных средств имеет два ключевых аспекта. С одной сторны, антрациклины играют ключевую роль в лечении многих злокачестенных новообразований, с другой, при их хроническом действии на организм наблюдаются такие нежелательные эффекты, как кардиомиопатия и застойная сердечная недостаточность, рефрактерные к стандартным схемам терапии. Эти эффекты более характерны для антрациклинов первого поколения, к которым относятся, в частности, доксорубицин и даунорубицин. Антрациклиновые антибиотики второго поколения, такие как эпирубицин и идарубицин несколько превосходят в этом отношении первое поколение антрациклинов, тем не менее, не предоставляя значительного снижения риска развития кардиомиопатии при длительном применении. Антрациклины относятся к одним из наиболее активных среди когда-либо разработанных противораковых средств. Первые антрациклины были выделены из микроорганизмов Streptomyces peucetius, эти вещества получили названия доксорубицин и даунорубицин. Отличия между этими веществами по химической структуре минимальны и заключаются в различии радикальных группировок в боковой цепи, у доксорубицина терминальная группировка представлена этильным, а у даунорубицина - метальным радикалом. Тем не менее, эти незначительные различия определяют разницу в спектре биологической активности даунорубицина и доксирубицина. В то время как доксорубицин является неотъемлемым компонентом в терапии рака молочной железы, солидных опухолей у детей, саркомы мягких тканей и злокачественных лимфом, . даунорубицин демонстрирует высокую клиническую эффективность в отношении лимфобластных и миелобластных лейкемий. Основные трудности, связанные с терапией этими антрациклинами, представляют собой развитие лекарственной резистентности опухолей и кардиомиопатии с последующей застойной сердечной недостаточностью.
Это привело к ограничению максимально допустимой к применению дозировки антрациклинов. Несмотря на интенсивное использование в клинике, механизмы действия антрациклинов на раковые клетки до сих пор остаются предметом обсуждения. Предполагаются следующие механизмы действия антрациклинов: 1) интеркаляция молекулы ДНК, приводящая к ингибированию транскрипции, 2) участие в продукции свободных радикалов, приводящей к перекисному окислению липидов и повреждению ДНК, 3) связывание и алкилирование нуклеиновых кислот, 4) формирование поперечных сшивок в молекуле ДНК, 5) интерференция с процессами спирализации и релаксации спирали ДНК и активностью осущствляющих этот процесс геликаз, 6) прямое действие на мембраны клеток, 7) инициация повреждения ДНК через ингибирование топоизомеразы II, 8) индукция апоптоза в ответ на ингибирование топоизомеразы II [57]. Топоизомеразы являются ферментами, модифицирующими топологию молекулы ДНК без влияния на последовательность и структуру дезоксирибонуклеотидов. Они могут индуцировать одноцепочечные (топоизомераза I) или двухцепочечные (топоизомераза II) разрывы в цепи ДНК, которые репарируются после изменения спирализации молекулы. Активность топоизомераз находится в прямой зависимости от фазы клеточного цикла и транскрипционной активности клетки [58]. Антрациклины действуют на этапе катализируемой топоизомеразой реакции, при котором происходит образование разрыва в цепочке ДНК и формирование прикрепления нуклеотидов к остаткам тирозина в полипептидной цепи топоизомеразы. Формирование и стабильность комплекса антрациклин-топоизомераза-ДНК зависит от структурно-конормационных взаимоотношений. Кольцевая часть молекулы антрациклина отвечает за интеркаляцию в структуру нитей ДНК, в то время как неинтеркалирующие группировки отвечают за формирование и стабилизацию третичного комплекса. Помимо действия на топоизомеразу И, показано влияние антрациклинов
Метод культивирования клеток (Фрешни, 1989)
Метод основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2) дифенилтетразолий бромистый (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окислительно восстановительных процессов в опухолевых клетках и может быть использовано в качестве критерия цитотоксического действия изучаемых соединений. После завершения инкубации клеток с соединениями среду из лунок планшета отбирали. После этого в лунки вносили по 200 мкл среды DMEM/F12 1:1 и по 10 мкл исходного раствора МТТ (10мг/мл). Клетки инкубировали при 37С в течение 3 часов. После завершения инкубации среду из лунок отбирали и вносили по 150 мкл ДМСО в каждую лунку для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны =530 нм на анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100% выживаемость клеток. Метод иммуногистохимического окрашивания образцов основана на связывании первичных моноклональных антител с онкобелком bcl-2 и последующим присоединением вторичных антител, меченых флуоресцеином. Количество онкопротеина в образце оценивается на флуоресцентном микроскопе. Оценку экспрессии bcl-2 проводили с использованием первичных моноклональных мышиных антител и вторичных антител, меченых флуоресцеином. Окрашивание проводили по протоколу иммуноокрашивания с фиксацией образцов в формалине (Catoretti G. Et al., 1993 ). [113]. Образцы клеток для проведения иммуноокрашивания инкубировали в чашках Петри (d=35 мм). Фиксация образцов необходима, поскольку этот процесс обеспечивает возможность связывания антител с эпитопами белков, находящихся в различных внутриклеточных структурах. При этом важным моментом является сохранение морфологии клеток и клеточной микроструктуры. При проведении экспериментов использовали фиксацию образцов в формалине для сохранения микроструктуры клеток последующей обработкой холодным метанолом для завершения дентарации клеточных белков. Среду отбирали аспиратором, после чего добавляли 1 мл раствора формалина 3,7% в PBS-буфере (137 тМШСи 2.7 mMKCl, 10 wMNa2HP04, 2 /wMKH2P04, рН 7.2), после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты с добавлением 0,1% масс. Tween-20. После этого аспиратором отбирали формалин и добавляли 1 мл холодного раствора метанола (-20С), и инкубировали 1 минуту при комнатной температуре.
После этого добавляли 1 мл PBS и первичные антитела до титра 1:2000. Для снижения фонового сигнала использовали бычий сывороточный альбумин в концентрации 2%. Инкубацию с первичными антителами проводили при температуре 37С в течение 1 часа при постоянном встряхивании. После инкубации с первичными антителами проводили трехкратную отмывку образцов в PBS в течении 5 минут при постоянном встряхивании, после чего добавляли 1 мл PBS и вторичные антитела до титра 1:2000. Инкубацию со вторичными антителами проводили при температуре 37С в течение 1 часа при постоянном встряхивании. После инкубации со вторичными антителами проводили оценку результатов окрашивания с помощью метода флуоресцентной микроскопии. Дальнейшая обработка полученных результатов проводилась с использованием программного обеспечения Image Pro Plus ("Media Cybernetics", США), позволяющего оценить: 1. Количество клеток в образце 2. Общую площадь свечения. В качестве оценочных показателей использовались приведенные выше параметры, а именно: количество клеток в поле зрения, посчитанное в 5 различных участках образца, а также площадь свечения в поле зрения, рассчитанная программно на все поле зрения и с поправкой на область, занимаемую клетками в поле зрения (по программному алгоритму вычитания фонового сигнала). 2.5.3. Колориметрическое измерение активности каспазы 3. Рис. 6. Визуализация связывания антител с фактором bcl-2 методом флуоресцентной микроскопии. Характерно выраженное митохондриальное (М) и перинуклеарное (Я) окрашивание. Измерение активности каспазы 3 основано на расщеплении субстрата, меченого хромофором, под действием активной каспазы 3 и высвобождении хромофора, который окрашивает среду в желтый цвет.
Окрашивание регистрируется с помощью спектрофотометра при длине волны Л,=405 нм. Количество свободного красителя, а соответственно, и интенсивность окрашивания пропорциональны активности каспазы в исследуемом образце. Количественная оценка протеолитической активности каспазы 3 проводится путем добавления в часть проб ингибитора каспазы 3, который путем необратимого связывания с активным центром фермента, ингибирует последний. Различия в интенсивности окрашивания образцов в присутствии ингибитора и без него является количественной мерой активности каспазы 3. Каспазы являются ключевыми ферменьтами, участвующими в реализации программы апоптоза в клетках млекопитающих. Активация каспазы-3 является одним из наиболее ранних признаков активации системы апоптоза в клетке. В роли биологических субстратов каспаз выступают различные мишени, такие как поли-АДФ-рибозополимераза, ДНК-зависимая протеинкиназа, ламины, топоизомеразы, протеинкиназа С. Измерение активности каспазы 3 производили с использованием набора реактивов CaspACE Assay System ("Promega", США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Субстратом в данном наборе является соединение As-DEVD-pNA, меченое хромофором pNA (p-nitroaniline). Интенсивность окрашивания образцов измеряли на спектрофотометре UV mini 1240 ("SHIMADZU") при длине волны А,=405 нм. Выделение ДІЖ из образца проводили по методике экстракции смесью фенол-хлороформ (по Maniatis Т, 1989). Образцы культуры клеток
Колориметрическое измерение активности каспазы
Метод основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2) дифенилтетразолий бромистый (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окислительно восстановительных процессов в опухолевых клетках и может быть использовано в качестве критерия цитотоксического действия изучаемых соединений. После завершения инкубации клеток с соединениями среду из лунок планшета отбирали. После этого в лунки вносили по 200 мкл среды DMEM/F12 1:1 и по 10 мкл исходного раствора МТТ (10мг/мл). Клетки инкубировали при 37С в течение 3 часов. После завершения инкубации среду из лунок отбирали и вносили по 150 мкл ДМСО в каждую лунку для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны =530 нм на анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100% выживаемость клеток. Метод иммуногистохимического окрашивания образцов основана на связывании первичных моноклональных антител с онкобелком bcl-2 и последующим присоединением вторичных антител, меченых флуоресцеином. Количество онкопротеина в образце оценивается на флуоресцентном микроскопе. Оценку экспрессии bcl-2 проводили с использованием первичных моноклональных мышиных антител и вторичных антител, меченых флуоресцеином. Окрашивание проводили по протоколу иммуноокрашивания с фиксацией образцов в формалине (Catoretti G. Et al., 1993 ). [113]. Образцы клеток для проведения иммуноокрашивания инкубировали в чашках Петри (d=35 мм). Фиксация образцов необходима, поскольку этот процесс обеспечивает возможность связывания антител с эпитопами белков, находящихся в различных внутриклеточных структурах. При этом важным моментом является сохранение морфологии клеток и клеточной микроструктуры. При проведении экспериментов использовали фиксацию образцов в формалине для сохранения микроструктуры клеток последующей обработкой холодным метанолом для завершения дентарации клеточных белков. Среду отбирали аспиратором, после чего добавляли 1 мл раствора формалина 3,7% в PBS-буфере (137 тМШСи 2.7 mMKCl, 10 wMNa2HP04, 2 /wMKH2P04, рН 7.2), после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты с добавлением 0,1% масс. Tween-20. После этого аспиратором отбирали формалин и добавляли 1 мл холодного раствора метанола (-20С), и инкубировали 1 минуту при комнатной температуре. После этого добавляли 1 мл PBS и первичные антитела до титра 1:2000. Для снижения фонового сигнала использовали бычий сывороточный альбумин в концентрации 2%. Инкубацию с первичными антителами проводили при температуре 37С в течение 1 часа при постоянном встряхивании.
После инкубации с первичными антителами проводили трехкратную отмывку образцов в PBS в течении 5 минут при постоянном встряхивании, после чего добавляли 1 мл PBS и вторичные антитела до титра 1:2000. Инкубацию со вторичными антителами проводили при температуре 37С в течение 1 часа при постоянном встряхивании. После инкубации со вторичными антителами проводили оценку результатов окрашивания с помощью метода флуоресцентной микроскопии. Дальнейшая обработка полученных результатов проводилась с использованием программного обеспечения Image Pro Plus ("Media Cybernetics", США), позволяющего оценить: 1. Количество клеток в образце 2. Общую площадь свечения. В качестве оценочных показателей использовались приведенные выше параметры, а именно: количество клеток в поле зрения, посчитанное в 5 различных участках образца, а также площадь свечения в поле зрения, рассчитанная программно на все поле зрения и с поправкой на область, занимаемую клетками в поле зрения (по программному алгоритму вычитания фонового сигнала). Рис. 6. Визуализация связывания антител с фактором bcl-2 методом флуоресцентной микроскопии. Характерно выраженное митохондриальное (М) и перинуклеарное (Я) окрашивание. Измерение активности каспазы 3 основано на расщеплении субстрата, меченого хромофором, под действием активной каспазы 3 и высвобождении хромофора, который окрашивает среду в желтый цвет. Окрашивание регистрируется с помощью спектрофотометра при длине волны Л,=405 нм. Количество свободного красителя, а соответственно, и интенсивность окрашивания пропорциональны активности каспазы в исследуемом образце.
Количественная оценка протеолитической активности каспазы 3 проводится путем добавления в часть проб ингибитора каспазы 3, который путем необратимого связывания с активным центром фермента, ингибирует последний. Различия в интенсивности окрашивания образцов в присутствии ингибитора и без него является количественной мерой активности каспазы 3. Каспазы являются ключевыми ферменьтами, участвующими в реализации программы апоптоза в клетках млекопитающих. Активация каспазы-3 является одним из наиболее ранних признаков активации системы апоптоза в клетке. В роли биологических субстратов каспаз выступают различные мишени, такие как поли-АДФ-рибозополимераза, ДНК-зависимая протеинкиназа, ламины, топоизомеразы, протеинкиназа С. Измерение активности каспазы 3 производили с использованием набора реактивов CaspACE Assay System ("Promega", США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Субстратом в данном наборе является соединение As-DEVD-pNA, меченое хромофором pNA (p-nitroaniline). Интенсивность окрашивания образцов измеряли на спектрофотометре UV mini 1240 ("SHIMADZU") при длине волны А,=405 нм. Выделение ДІЖ из образца проводили по методике экстракции смесью фенол-хлороформ (по Maniatis Т, 1989). Образцы культуры клеток ромывали раствором PBS (1.7 mM КН2Р04, 5.2 тМ Na2HP04, 150тМ NaCl), затем инкубировали 1 час при 56С в буфере 0.1М NaCl, lOmM Tris СІ рН8.2 25mM EDTA, 0.5% SDS, 20ug/ml Proteinase К. После инкубации образцы последовательно промывали сначала фенолом, затем смесью фенол-хлороформ. ДНК осаждали спиртом, растворяли в воде до конечного объема 50 ul.
Индукция апоптоза под действием гестагенов
Для оценки апоптоза в культуре клеток MCF-7 использовали метод оценки апоптоза путем флуориметрического анализа электрофореграмм экстракта геномной ДНК исследуемой культуры. Регистрацию флуоресценции проводили на установке "Vilber Lourmat",USA с использованием оптической системы производства "Nikon". В опыте клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. Данное время инкубации было выбрано на основании того, что именно при 72 часах инкубации клеток с гестагенами в МТТ тесте было показано угнетение жизнеспособности опухолевых клеток линии MCF-7. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствии соединений. Данные исследования приведены в таблице 5. Значения в клетках таблицы - соотношение фрагментированной и высокомолекулярной ДНК, определенное по методике оценки апоптоза путем флуориметрического анализа электрофореграмм экстракта геномной /ТНК исследуемой культуры. На основании приведенных данных построена следующая диаграмма (рис. 13) : Рис. 13. Влияние АБМП и прогестерона на фрагментацию ДНК в На основании приведенных данных можно заключить, что выраженность апоптоза при воздействии соединений на культуру клеток аденокарциномы молочной железы человека не демонстрирует достоверных отличий от контроля при уровне значимости р 0,05. С целью выявления концентрационной зависимости при воздействии доксорубицина на исследуемые клетки было проведено исследование дозовой и временной зависимости действия доксорубицина на фрагментацию ДНК клеток культуры MCF-7. Для проведения исследования были установленные следующие контрольные точки: время инкубации составило 24, 48 или 72 часа, концентрации доксорубицина составили 5 10 , 5 10", 5 10" М. Контрольную группу образцов инкубировали в тех же условиях в отсутствие доксорубицина. Данные исследования представлены в таблице 6.
Примечание: значения в клетках таблицы - соотношение фрагментированной и высокомолекулярной ДНК, определенное по методике оценки апоптоза путем флуориметрического анализа электрофореграмм экстракта геномной ДНК исследуемой культуры. - достоверные отличия от контроля при р 0.05. L - визуализация специфической фрагментации ДНК («лестница ДНК») на электрофореграммах образцов (рис. 14.) Рис. 14. Фрагментация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с доксорубицином. Визуализация электрофореграмм. К А В С Примечание: К - контроль, А - время инкубации 24 часа, концентрация доксорубицина 5 10"5 М, В - время инкубации 36 часов, концентрация доксорубицина 5 10"5 М, С - время инкубации 48 часов, концентрация доксорубицина 5 10" М. Представлено комбинированное изображение из данных различных экспериментов. На основании приведенных данных построена следующая диаграмма (рис. 15): Рис. 15. Влияние доксорубицина на фрагментацию ДНК в культуре клеток MCF-7. Дозовая и временная зависимость эффекта. Примечание: по оси ординат отложены соотношения фрагментированной ДНК к высокомолекулярной в процентах, как косвенный признак апоптоза. - достоверные отличия от контроля при р 0.05. На основании приведенных данных можно сделать заключение, что выраженность апоптоза при воздействии доксорубицина зависит от дозы последнего и времени инкубации. При этом для дозировки 5 10"7М видна тенденция к увеличению фрагментации ДНК при увеличении сроков инкубации, которая, тем не менее, не демонстрирует достоверных отличий от контроля при уровне значимости р 0,05.
Достоверные отличия были выявлены при времени инкубации 48 часов и дозировке 5 10"6М, что позволяет считать эту дозировку достаточной для возникновения и удовлетворительной визуализации биологического эффекта доксорубицина, и в то же время, при времени инкубации 24 часа достоверно не вызывающей изменений в электрофоретической картине фрагментации ДНК клеток (р 0.05). С целью более детального изучения биологического эффекта при инкубации клеток с исследуемыми соединениями доксорубицин использовали в концентрации 10"6 моль/л, поскольку данная концентрация достоверно не вызывала апоптоз опухолевых клеток при инкубации в течение 24 часов. Для постановки эксперимента инкубацию клеток с исследуемыми веществами проводили в течение 72 часов, контрольную группу образцов инкубировали в тех же условиях в отсутствие веществ. В последние 24 часа инкубации в культуру клеток вносили доксорубицин в концентрации 5 10"6 М. Одну из контрольных групп также инкубировали с доксорубицином в течение 24 часов. Данные исследования представлены в таблице 7. Табл. 7. Фрагментация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с АБМП и прогестероном в течение 3 суток с добавлением доксорубицина в концентрации в последние 24 часа инкубации.
