Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Влияние лекарственных препаратов на эмбриогенез 9
1.2. Становления'фенотипа гладкомышечных клеток на этапах пренатального развития млекопитающих 15
2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Объекты исследования 31
2.1.1. Изучение воздействия димефосфона на развитие эмбрионов крысы 31
2.1.2. Изучение экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в пренатальном онтогенезе печени крысы 32
2.1.3. Изучение влияния димефосфона на экспрессию миогенных маркеров в пренатальном онтогенезе 33
2.2. Методы исследования 34
2.2.1. Тератологические методы исследования 34
2.2.2. Гистологические и иммуногистохимические методы исследования 37
2.2.3. Статистический анализ 39
3. Результаты собственных исследований 40
3.1. Сравнительная оценка эффективности различных методик получения крыс с датированной беременностью 40
3.2. Исследование влияния димефосфона на течение беременности и развитие плодов крыс 42
3.2.1. Влияние димефосфона на организм и течение беременности у крыс 42
3.2.2. Сравнительная оценка выживаемости плодов беременных контрольных и опытных крыс 44
3.2.3. Оценка влияния курсового введения димефосфона на фетометрические параметры плодов 46
3.2.4. Изучение влияния курсового введения димефосфона на закладку и морфологию внутренних органов плодов крыс 48
3.2.5. Исследование влияния-курсового введения димефосфона на развитие скелета и его оссификацию у плодов крыс 54
3.2.6. Влияние курсового введения димефосфона в период беременности крыс на процессы половой дифференцировки их плодов 59
3.3. Сравнительная оценка экспрессии миогенных маркеров в ходе пренатального онтогенеза крыс в норме и при введении димефосфона 61
3.3.1. Экспрессия десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в пренатальном онтогенезе у здоровых плодов крыс 61
3.3.2. Влияние курсового введения димефосфона беременным крысам на гистоструктуру некоторых органов эмбрионов крыс на 20 день гестации 77
3.3.3. Изучение влияния димефосфона на экспрессию десмина, а-ГМА и кальпонина в органах плодов крысы на 20 день гестации 78
4. Обсуждение 86
Выводы 103
- Становления'фенотипа гладкомышечных клеток на этапах пренатального развития млекопитающих
- Методы исследования
- Оценка влияния курсового введения димефосфона на фетометрические параметры плодов
- Влияние курсового введения димефосфона беременным крысам на гистоструктуру некоторых органов эмбрионов крыс на 20 день гестации
Введение к работе
Актуальность исследования. Проблема репродуктивной безопасности лекарственных препаратов является одной из важнейших проблем современной медицины. Ежегодно на фармацевтический рынок "выбрасываются" сотни новых лекарственных препаратов, часть из которых может быть назначена беременным женщинам для коррекции патологических состояний, тогда как другая часть, отпускаемая без рецепта, может воздействовать на развивающийся плод на ранних этапах эмбриогенеза, когда женщина может не знать о своей беременности [140, 142, 169].
В последние десятилетия успешно идет синтез и внедрение препаратов из группы неантихолинэстеразных фосфорорганических соединений [2, 7, 10, 11, 12, 18, 19, 38, 43, 44]. Димефосфон рекомендован Фармакологическим комитетом Минздрава СССР (протокол №19 от 20.12.90) и разрешен приказом Министерства здравоохранения РФ (№ 304 от 28.12.93) для медицинского применения и промышленного выпуска в качестве вазоактивного лекарственного средства, нормализующего функцию центральной и вегетативной нервной системы. Репродуктивная безопасность этой группы лекарственных веществ и, в частности, димефосфона остается невыясненной, что ограничивает его применение в практической медицине.
На настоящее время для исследования влияния лекарственных веществ на 1 внутриутробное развитие млекопитающих используется большое число различных моделей [57, 114]. Однако неоднозначность, получаемых в ходе исследования, данных требует дальнейшего совершенствования методологии тератологических исследований. Одним из ключевых моментов пренатального развития млекопитающих является становление дефинитивного строения сердечно-сосудистой системы и, в частности, гладкомышечных клеток сосудов. Выявление общих закономерностей становления сердечно-сосудистой системы в ходе развития позволит не только раскрыть механизмы развития ряда врожденных заболеваний, но и повысить информативность тератологических
исследований, что даст возможность более эффективно решать вопросы оценки действия лекарственного средства на внутриутробное развитие млекопитающих.
Исследование репродуктивной безопасности димефосфона расширит показания к применению его в практической медицине и пополнит арсенал применяемых лекарственных препаратов, используемых в клинике акушерства и гинекологии.
Цель исследования. Изучение влияния димефосфона на процессы пренатального развития крысы и дифференцировку гладкомышечных клеток внутренних органов.
Задачи исследования:
Оценить влияние курсового введения димефосфона в период беременности на развитие плодов крыс.
Изучить влияние димефосфона на формирование и оссификацию костной системы плодов крыс.
Исследовать закладку и гистологическую структуру внутренних органов плода крыс при курсовом введении димефосфона.
Провести исследование динамики становления и дифференцировки гладкомышечных клеток внутренних органов крысы в* ходе пренатального развития.
Изучить влияние курсового введения димефосфона в период беременности на становление и дифференцировку популяции гладкомышечных клеток внутренних органов плодов крысы.
Научная новизна. Впервые показано, что димефосфон при курсовом введении не нарушал гисто и органогенез крысы. Препарат не влиял на остеогенез и оссификацию костной системы.
Впервые определены временные и топографические закономерности экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов эмбрионов и плодов крысы. Установлено, что становление артериальной системы печени крысы начинается
7 с фєтальной стадии пренатального развития одновременно с развитием желчных протоков.
Выявлено, что димефосфон не изменяет закономерности экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов плодов крыс и не влияет на процессы дифференцировки ГМК.
Научно-практическая ценность работы. Результаты исследования расширяют представления о становлении и дифференцировке гладкомышечных клеток в ходе пренатального развития и воздействии лекарственных препаратов. Экспериментальные данные могут быть использованы для дальнейших исследований, направленных на раскрытие механизмов изменения фенотипа гладкомышечных клеток сосудистой системы при различных патологических состояниях в период пренатального развития млекопитающих. Результаты исследования гистоструктуры внутренних органов могут быть использованы в прикладной тератологии для оценки репродуктивной безопасности лекарств. Итоги работы являются обоснованием возможности использования димефосфона в акушерстве и гинекологии. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Ежедневное введение димефосфона (в дозе 200 мг/кг) беременным
крысам не сопровождается эмбриолетальным, эмбриотоксическим,
тератогенным действием, нарушением гистоструктуры внутренних органов.
Препарат не нарушает экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и
кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов плодов крысы.
2. Дифференцировка миогенных элементов различных отделов
сердечно-сосудистой системы и пищеварительного тракта происходит
неодновременно и характеризуется последовательным появлением в
цитоплазме гладкомышечных клеток десмина, а-гладкомышечного актина и
кальпонина.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены:
на заседаниях проблемно-предметной комиссии КГМУ (Казань, 2001);
IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001);
научно-практической конференции, посвященной 40-летию ЦНИЛ КГМУ "Современные методы исследования в медицине и фармации" (Казань, 2002);
VII научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2002);
5-й международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2003);
межвузовской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патофизиологии" (Санкт-Петербург, 2003);
2-м съезде Российского Научного Общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003);
VIII научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2003);
IX Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва, 2004);
XI национальном конгрессе "Человек и лекарство" (первое место на конкурсе молодых ученых по специальности "клиническая фармакология" Москва, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.
Структура диссертации. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 175 отечественных и иностранных источников. Диссертация содержит 49 рисунка и 11 таблиц.
9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Влияние лекарственных препаратов на эмбриогенез
Врожденные пороки развития среди причин перинатальной смертности новорожденных занимают второе место. В ряде исследований было показано, что примерно 20-30% детей, умерших в перинатальном периоде, имеют те или иные аномалии органов [13, 6]. По мнению ряда авторов, распространенность пороков развития составляет 4 - 5% от числа родившихся [31, 34, 47]. Однако если считать пороками развития аномалии, проявляющиеся не только в перинатальном, но и постнатальном периоде то эта цифра резко возрастает достигая 15 - 25% [13]. Одним из главных причин данного явления считают нарастающее загрязнение окружающей среды [47]. В последнее время появились сведения о наличии взаимосвязи между наличием ксенобиотиков в окружающей среде ряда регионов и снижением интеллекта у детей, родившихся в них [85]. Установлено, что ряд пестицидов, длительно персистирующих в окружающей среде и передающихся по пищевым цепочкам, способны вызывать развитие хронических заболеваний легких и сердечно сосудистой системы. Более того, эти заболевания проявляются и в отдаленном периоде, когда установить их этиологическую роль достаточно трудно [13, 24, 79].
Отдельной проблемой является воздействие лекарств. Учитывая рост перинатальной патологии, когда требуется фармакотерапевтическое вмешательство, вопрос репродуктивной безопасности встает на первый план. Тератогенный эффект многих лекарств проявляется только при наличии сопутствующих факторов [6, 31].
В начале 60-х годов данная проблема обратила на себя внимание в так называемой "талидомидной катастрофе". В Европе за короткий срок появилось на свет большое число детей с характерными аномалиями развития: отсутствием глаз, верхних и нижних конечностей. Поиск причин потребовал значительных усилий, но увенчался успехом. Безвредное и малотоксичное
10 седативное средство, которое женщины принимали на ранних этапах беременности для снятия симптомов "утренней тошноты" и "слюнотечения", индуцировало значительное число врожденных пороков конечностей и внутренних органов. Несмотря на публикации в печати и обращение коллегии врачей к правительству ряда стран Европы, последующие судебные иски к фармацевтической фирме "Грюненталь" не дали желаемого результата. Отсутствие юридических нормативных документов не дали возможности привлечь к ответственности виновных. Однако, данный факт имел свои последствия, превратив проблему тератогенности лекарств в объект, как научных исследований, так и юридического регулирования [169].
Ни один тератоген не вызывает аномалий развития у всех детей, рожденных от матерей, подвергнутых его влиянию [31]. Чтобы ксенобиотик проявил тератогенное действие, необходимо наличие ряда факторов, которые будут способствовать проявлению его тератогенного эффекта: генотип и видовая принадлежность, стадия развития эмбриона, природа тератогенного агента и его доза [13].
Экспериментальные исследования показывают, что наиболее важным критерием, который превращает фактор окружающей среды (химический физический и инфекционный) в тератоген, является его доза. Экспериментальные исследования показывают, что нарушения эмбрионального развития плода начинают выявляться только тогда, когда доза ксенобиотика превысит некоторый пороговый уровень [13, 142, 146, 160]. Проявления аномального развития с повышением его дозы могут варьировать от повышения частоты вариаций развития до гибели эмбриона [53, 63]. У ряда ксенобиотиков зарегистрирована достаточно выраженная взаимосвязь дозы и тератогенного эффекта лекарственного препарата, что позволяет математически рассчитать пороговый уровень его безопасности [13]. С другой стороны, диапазон исследуемых на животных доз лекарственных средств значительно превышает их дозы, используемые в медицинской практике, что резко
затрудняет значимость оценки дозазависимости тератогенного эффекта у человека [57, 140,141].
Лекарства, назначаемые в высоких дозах, достаточных для проявления токсического эффекта у матерей, будут токсичными и для эмбриона. С другой стороны, низкие дозы, назначаемые в течение длительного времени, способны в значительной мере увеличить риск появления аномалий развития.
Хотя прямая экстраполяция данных, полученных в экспериментах на животных, на человека не совсем корректна, достаточно часто приходится руководствоваться ими для решения вопроса об уровнях безопасности ксенобиотиков в промышленности и сельском хозяйстве [15, 114]. Поэтому, доза является наиболее важным фактором в решении вопроса репродуктивной безопасности исследуемого агента.
Тератогенная активность агента окружающей среды зависит от стадии развития, на которой находится эмбрион. В течение предимплантационного периода или первых 2-х недель эмбрион человека относительно устойчив к повреждающему действию вследствие слабой его дифференцировки [15]. Действие агента зависит от количества поврежденных клеток. Если погибших клеток незначительное количество, оставшиеся клетки эмбриона делятся, замещают поврежденный сегмент и продолжают нормальное развитие. В противном случае, когда оставшееся количество клеток недостаточно для продолжения нормального эмбриогенеза, эмбрион погибает. Данный период эмбриогенеза называют стадией "все или ничего". Эта концепция разработана в ходе исследований влияния действия радиации на эмбрион [172]. Однако, эта закономерность не носит универсального характера и не означает, что действие агента в этот период никогда не вызовет появления аномалий развития. В ряде исследований была выявлена способность ряда мутагенных агентов вызывать аномалии развития при воздействии в предимплантационный период развития зародыша [54].
Период органогенеза (18-60 день после имплантации) у человека считается стадией, на которой развивающийся эмбрион наиболее чувствителен
12 к повреждающему действию тератогенов [6, 13, 54, 142]. На данном этапе происходит закладка, дифференцировка и нарастание клеточной массы почти всех органов и тканей плода. Поэтому любое, даже незначительное повреждение способно вызвать нарушение развития целого органа. Необходимо отметить, что способность проявления тератогеном повреждающего действия уменьшается по мере приближения к фетальному периоду [15].
Конец 8-й недели развития у человека считается началом плодного периода, когда начинается созревание нейрогуморальных регуляторных систем организма [6, 141]. Эта стадия характеризуется массивной пролиферацией, дифференцировкой и миграцией клеток, особенно, центральной нервной системы [42]. В этот период тератоген способен воздействовать на процессы дифференцировки структур головного мозга, вызывая формирование поведенческих нарушений, проявляющихся после рождения в течении жизни
[141]. ,
Другим, не менее важным, фактором влияющим на тератогенность агента является его природа. Физические факторы: радиация, гамма-лучи, магнитное и электрическое поле имеют прямое повреждающее действие на клеточные структуры. Степень и характер проявления тератогенного действия будет напрямую зависеть от таких параметров, как проникающая и кумулятивная способность, мощность излучения [31].
Тератогенность химических агентов зависит от химической структуры. Например, среди хлоруглеродных соединений, встречающихся в воде, только одно проявляло тератогенный эффект в эксперименте [104]. Значительное влияние на тератогенность химических веществ оказывают их фармакокинетические свойства: путь поступления и выведения из организма, плацентарный транспорт, способность метаболизироваться печенью [6]. Эти фармакодинамические и фармакокинетические факторы имеют прямое отношение к количеству тератогена, непосредственно взаимодействующего с эмбрионом. Это объясняет, почему тератогены, проявляющие свое действие на
13 моделях in vitro, не активны в экспериментах in vivo, и, наоборот, безвредные вещества после метаболизма в печени становятся активными тератогенами [114].
В настоящий момент в результате интенсивной деятельности человека в окружающей среде появилось огромное число различных загрязнителей. Например, хлоруглеродные соединения, такие как, трихлорэтилен и его метаболиты, являются наиболее распространенным загрязнителем воды в Европе, США и других странах [104]. Показано, что хлорирование городской воды с целью обеззараживания вызывает образование в ней многочисленных различных хлоруглеродных соединений в достаточно большом количестве [162]. Население потребляет эту воду, которая является главным источником поступления этих веществ в пищеварительный тракт и внутреннюю среду организма.
В эпидемиологических исследованиях была установлена связь между присутствием трихлорэтилена в среде и повышением риска врожденных аномалий сердца у детей, рожденных от матерей, проживающих в загрязненных районах [67, 99]. Однако данное исследование не позволило, установить механизм развития и силу тератогенного действия. Последующие исследования на животных и птицах подтвердили наличие у данной группы веществ тератогенного эффекта. На эмбрионах цыпленка и крысы было показано, что как трихлорэтилен, так и дихлортилен вызывают тяжелые пороки развития их сердечно-сосудистой системы [104].
Полихлорированные бифенилы были внедрены, для практического использования с 70-х годов нашего столетия. Эти вещества широко использовались в качестве детергентов, в системах охлаждения в качестве теплообменников. Однако уже спустя десять лет стали появляться популяционные исследования, свидетельствующие об их тератогенной активности [13]. Другим важным недостатком, заставившим прекратить производство и использование полихлорированных бифенилов, является их очень высокая устойчивость в окружающей среде. Это привело к
14 скачкообразному накоплению этих веществ в окружающей среде с момента начала их использования. Отрицательное воздействие этой группы соединений на течение беременности и развитие эмбриона явилось основанием для прекращения их производства во многих странах.
Синтез и производство высокоактивных хлор- и фосфорорганических соединений, проявляющих инсектицидную, гербицидную и репеллентную активность начались после второй мировой войны. Этому способствовали результаты многочисленных исследований токсикологов, химиков-синтетиков в области создания боевых отравляющих веществ. Применение веществ из этой группы в сельском хозяйстве в качестве пестицидов и гербицидов первоначально привело к огромным экономическим прибылям в этой отрасли. Однако с 60-х годов в научной литературе стали появляться наблюдения об увеличении перинатальной смертности в районах с широким использованием пестицидов. Исследователям не удалось установить причинно-следственную связь из-за отсутствия методологической базы для проведения оценки тератогенной активности этих соединений. В 70-х годах учеными была доказана тератогенная активность фосфорорганических пестицидов [124]. Подсчет экономических потерь показал, что первоначальный выигрыш производительности полностью покрыли потери, связанные с нарушением здоровья и репродуктивной функции людей, подвергавшихся воздействию пестицидов [31].
Деятельность металлургической, химической промышленности привела к появлению в окружающей среде большого числа химических элементов в необычайно высоких концентрациях. Работы, проведенные в 80-х годах, позволили констатировать, что многие редкоземельные химические элементы в высокой концентрации проявляют тератогенную активность. Популяционные исследования также выявили нарушение репродуктивной функции женщин, проживающих в промышленных районах [13, 34, 47].
Ежегодно на рынке лекарственных препаратов появляется не менее 500 новых лекарственных препаратов [24, 35, 106]. Каждый из них потенциально
15 может применяться во время беременности. Поэтому информация о репродуктивной безопасности лекарственных соединений позволит врачу проводить профилактику подобных нежелательных эффектов.
Исследование действия лекарственных веществ на развитие эмбрионов животных, в том числе крыс, позволили выявить, что многие лекарственные препараты характеризуются неблагоприятным действием на эти процессы. Было показано, что нарушения развития и закладки органов могут вызывать препараты из группы нестероидных противовоспалительных веществ [6, 115], гормонов [6, 143], антибиотиков [6, 72, 101], средств, влияющих на функцию периферической нервной системы [6, 31] и иммунитет [106]. Наиболее выраженным тератогенным эффектом обладали лекарства, влияющие на метаболизм и пролиферацию клеток [31, 53, 54, 69]. Для лекарственных средств, использующихся для коррекции нарушений центральной нервной системы, наиболее характерным действием является формирование функциональных пороков развития, проявляющихся в постнатальном возрасте ребенка в виде нарушения поведения и рефлекторной деятельности [10, 35, 45, 63].
Приведенные факты свидетельствуют, что детальное изучение действия каждого препарата на развитие эмбрионов экспериментальных животных должно предшествовать использованию нового лекарства в практической медицине.
1.2. Становления фенотипа гладком ышечных клеток на этапах пренатального развития млекопитающих
Гладкомышечные клетки (ГМК) составляют особую популяцию клеток, ответственную за функционирование многих органов и систем: пищеварительной и дыхательной систем, органов мочевыделения. В сердечнососудистой системе они отвечают за поддержание тонуса и регуляцию диаметра сосудов. Они также играют ключевую роль в формировании патологических процессов в сосудистой стенке [59]. Поэтому, исследование модуляции их фенотипа может способствовать раскрытию механизмов
развития таких заболеваний, как артериосклероз при гипертонии, атеросклероз, рестеноз после аортокоронарного шунтирования и баллонной ангиопластики и
др.
В отличие от скелетной и сердечной мышц, где клеточная
дифференцировка соответствует стабильной экспрессии
мышечноспецифических генов [134, 170], ГМК имеют выраженную фенотипическую пластичность и способность вступать в клеточный цикл [148]. Это уникальное свойство гладкомышечных клеток связано с потерей ими ряда специфических белков [90, 96]. Благодаря этому, сердечно-сосудистая система обладает большой пластичностью и способностью адаптироваться к изменениям потребностей кровотока. В то же время, нарушение пролиферации и дифференцировки гладкомышечных связано с различными заболеваниями кардиоваскулярной системы [96, 148].
Исследование интимных механизмов развития этих процессов позволило бы разработать более эффективную тактику терапии таких заболеваний, как несостоятельность сосудистого трансплантанта, ангиопатий при диабете и гипертонии. Решению этих проблем может способствовать разработка ряда таких вопросов, как: "Что является главным? Гетерогенность происхождения ГМК или гетерогенность пространственно-временных характеристик экспрессии специфических белков". Имеются факты, свидетельствующие о возможности трансдифференцировки зрелых гладкомышечных клеток в другие типы [93]. Исследования, направленные на раскрытие фундаментальных основ функционирования сосудистой системы, позволят решить многие ключевые вопросы стратегии терапии сосудистых заболеваний.
Происхождение гладкомышечных клеток млекопитающих
Три мышечных типа: скелетный, сердечный и гладкий происходят из различных популяций предшественников в течении эмбриогенеза [70, 149]. Скелетные мышцы происходят из сомитов - образований, располагающихся непосредственно вдоль нервной трубки. Компартментализация сомитов дает начало миотому, из которого формируется аксиальная мускулатура [62]. Клетки
17 вентролатерального края дерматомиотома сомита мигрируют в зачаток конечности и формируют мускулатуру конечностей [62]. Сердечная мышца происходит из передне-латерального участка мезодермы. Изначально формируются примитивные сердечные трубы с последующим образованием петли и камерной спецификации [107].
Закладка кровеносных сосудов начинается с дифференцировки из спланхномезодермы эндотелиальных клеток, которые являются главным строительным блоком сосудистой системы. Показано, что значительную роль в этом процессе играет энтодермально-мезенхимальное взаимодействие [136]. После дифференцировки мезенхимальных клеток в предшественники эндотелия они становятся подвижными и формируют сосудистую сеть. На следующем этапе происходит обособление клеток вокруг примитивного эндотелия и формирование среднего слоя крупных артерий и вен.
Однако, не только мезодерма может являться основным локусом происхождения гладкомышечных клеток. В экспериментах in vivo было показано, что первый слой клеток, экспрессирующих а-ГМА, вокруг эндотелиальных труб, трансдифференцируется из эндотелия [75]. Отмечено, что эндотелиальные клетки ряда сосудов (легочные вены) одновременно экспрессируют как эндотелиальные протеины, так и гладкомышечные [102]. На настоящий момент исследуется специфичен ли этот механизм трансдифференцировки только для аорты, где он был впервые выявлен, или это более общий феномен, который может играть роль в утолщении интимы при заболеваниях сосудов.
Кроме эндотелия и спланхномезодермы, имеются и другие источники гладкомышечных клеток. На модели химерного эмбриона было выявлено, что коронарные ГМК происходят из эпикардиальной оболочки посредством ее трансформации. Однако при исследовании развития коронарных сосудов не удалось определить возможность перехода эндотелиальных клеток в гладкомышечные путем их трансдифференцировки [77, 167].
18 Нервный гребень также рассматривается как один из источников гладкомышечных клеток [147]. На модели химерного эмбриона [58, 118] и ретровирусного переноса маркерного гена [58, 132] показано, что из нервного гребня могут развиваться гладкомышечные клетки артерий груди, шеи и головы [127, 147]. Потомки клеток нервного гребня присутствуют также в стенке кардинальных вен [58]. Результаты анализа литературных данных относительно происхождения гладкомышечных клеток крупных артерий после их систематизации нами представлены в таблице 1.
Таблица 1 Источники происхождения гладкомышечных клеток сосудов
млекопитающих
"+" - в литературе имеются сведения о происхождении из данной популяции
"-" - в литературе имеются данные отрицающие происхождение из данной популяции
"?" - в литературе данные о происхождении отсутствуют
В последнее время стали появляться работы, относительно
существования стволовой клетки костного мозга, способной
дифференцироваться в ГМК сосудов [145]. Предполагалось, что выделение и
культивирование подобных клеток позволит использовать их для лечения
заболеваний, связанных с повреждением мышечной ткани (например, инфаркт
миокарда). Но введение мезенхимальных стволовых клеток при
экспериментальном повреждении сердца вызывало дифференцировку
значительной части этих клеток в фибробласты, и лишь незначительная их
часть дифференцировалась по миогенному пути [174].
Изучение процессов дифференцировки популяции гладкомышечных
клеток вызывает разноречивые толкования их результатов разными авторами.
Ряд исследователей считает, что дифференцировка ГМК начинается сразу во
19 многих регионах эмбриона [93, 139], тогда как другие авторы [117, 132] отмечают определенную последовательность этого процесса. Если утверждать, что первое предположение является доминирующим, то в реализации программы дифференцировки ГМК основную роль играют генетические факторы. Если в процессах созревания участвуют различные внешние факторы: трофические факторы, цитокины, продуцируемые соседними клетками; физиологические сдвиги, такие как изменение артериального давления, ионного состава, оксигенации крови, то дифференцировка гладкомышечных клеток будет происходить по второму пути. Поэтому дальнейшие исследования в этом направлении позволят более объективно судить о механизмах дифференцировки ГМК и эмбрионального сосудистого русла в процессе пренатального развития млекопитающих.
Экспериментальное обоснование гетерогенности фенотипа гладкомышечных клеток в опытах in vivo и in vitro
Гетерогенность ГМК — общеизвестный научный факт. Однако интерпретация фенотипа, также как и функциональное значение экспрессии различных белков, является не до конца расшифрованными. Идет интенсивный поиск факторов, которые модулируют фенотип клеток в условиях как нормы, так и патологии [73, 93, 122]. Данные, полученные in vitro, объясняют механизм лишь незначительной части фактов, полученных в экспериментах на моделях in vivo. Поэтому понять роль, которую играет отдельно взятый механизм в целом организме, достаточно трудно.
При исследовании фенотипа культивируемых гладкомышечных клеток было выявлено, что с морфологической точки зрения существует два типа гладкомышечных клеток: эпителиоидные (epithelioid - shaped) и веретенообразные (spindle - shaped) [82, 59]. Кроме того, выявлены еще тонкие удлиненные (thin elongated) и стареющие клетки (senescent) [59]. Фенотипические характеристики клеток остаются относительно стабильными, когда в культуре тканей достигался монослой [68]. Однако в субоптимальных условиях, когда в питательной среде недостаточное количество ионов и
20 питательных веществ, контрактильный фенотип ГМК может меняться на синтетический [68]. Эпителиоидные клетки характеризуются меньшим уровнем экспрессии сократительных белков, более высокой степенью пролиферации, что позволяет рассматривать их как предшественники зрелых ГМК [93].
Результаты визуальных морфологических исследований не позволяют зарегистрировать процесс смены фенотипа в динамике, что ставит ряд вопросов. Переключение фенотипа при культивировании может быть обусловлено дедифференцировкой клетки и вступлением ее в митоз или пролиферацией эпителиоидной популяции клеток и повышением их числа в культуре ткани? Поэтому смена фенотипа культуральных клеток может объясняться как собственно сменой фенотипа, так и изменением соотношения между числом клеток эпителиоидного и веретенообразного типа, или, что более вероятно по нашему мнению, обеими механизмами одновременно.
С учетом литературных данных, морфологически идентифицируемые типы в общем соответствуют in vivo классификации клеток на контрактильные (соответствуют веретенообразным) и синтетические (соответствуют эпителиоидным) клеточные типы, мы считаем возможным классифицировать их по схеме представленной на рис. 1.
эксперименты эксперименты
in vivo Sf^SbL* ш v^tro
сократительные*—^- ^KImSI^^-^ эпителиоидные синтетические-*^ Щг^* \0^ веретенообразные
ГМК V стареющие
продольновытянутые
Рис. 1. Классификация гладкомышечных клеточных типов по морфо-функциональной характеристике.
Клетки с сократительным фенотипом составляют основную часть популяции ГМК в зрелом организме млекопитающих. Они характеризуются наличием всех гладкомышечно-специфических белков, функциональной активностью и низким уровнем пролиферации [93].
Популяция клеток с синтетическим фенотипом остается менее изученной. Считается, что эта популяция клеток менее дифференцирована (таб. 2). Клетки с подобным фенотипом появляются при повреждении сосудов [120], присутствуют в сосудах эластического типа [112]. Показано, что для этой популяции клеток характерна высокая способность к миграции, синтезу белков внеклеточного матрикса и пролиферации [173].
Они также характеризуются менее интенсивным синтезом
контрактильных протеинов: а-ГМК, кальпонина и гладкомышечного миозина,
и более высоким содержанием немышечного р-актина и виментина [173]. ГМК
с "синтетическим" фенотипом характеризуются низкой экспрессией десмина и
высокой коннексина 43 - белка клеточных контактов [112]. Кроме того, в
клетках, имеющих "синтетический" фенотип, также зарегистрирована
экспрессия остеопонтина и тромбоспондина [119]. Следует отметить, что
экспрессия генов остеопонтина и матриксного Gla белка, которые выявляются в
костной ткани, наблюдалась в культивируемых клетках аорты [150]. Нельзя
исключить, что кальцификация аорты в ответ на повреждение может быть
связана со способностью ГМК этого сосуда экспрессировать остеогенные
белки.
Таблица 2 Уровень экспрессии специфических белков в ГМ клетках
"сократительного" и "синтетического" типа
Сравнительный анализ данных, эмбрионального, неонатального и взрослого материала показывает, что фенотипические различия закладываются с ранних этапов развития и имеют тенденцию к их усилению к зрелому возрасту.
Относительно распределения контрактильных и синтетических клеточных типов в сосудистой стенке было показано, что как интима, так и средняя оболочка содержат популяции различных типов клеток, однако их соотношение неравнозначно [59]. В тоже время имеются сообщения, утверждающие, что ГМК интимного слоя являются менее дифференцированными по сравнению со средней и наружными оболочками сосуда [109, 153].
В настоящее время, описаны различные механизмы, модулирующие фенотип ГМК [60, 93, 120]. Например, повреждение сосуда сопровождается пролиферацией ГМК и утолщением внутренней оболочки в месте травмы [52, 145]. Введение оксида азота на фоне повреждения сосуда вызывает снижение пролиферации ГМК и последующее утолщение его интимы [119]. В механизме действия оксида азота, как полагают, участвует цГМФ зависимая протеинкиназа, активация которой вызывает экспрессию сократительных белков в ГМК и приобретение ими сократительного фенотипа [60]. Активация этого механизма является недостаточным для контроля над эмбриональной регуляцией фенотипа, что подтверждается отсутствием влияния на пролиферацию клеток в ответ на введение PDGF [60, 93].
Главным фактором запускающим дедифференцировку ГМК является PDGF, однако в зрелых ГМК рецепторов к нему пока не обнаружено. В тоже время при повреждении сосуда экспрессия рецепторов к PDGF значительно повышается в ГМК, локализованных в месте травмы [120]. Вероятно, этот механизм является доминирующим в патогенезе развития сосудистых осложнений во взрослом организме млекопитающих. Немаловажным фактором
23 в активации пролиферации ГМК является снижение экспрессии фактора транскрипции GATA-6 [122].
Таким образом, раскрыты основные закономерности смены, фенотипа гладкомышечных клеток, но до конца не выяснены интимные механизмы и факторы регулирующие их дифференцировку в нормальных и патологических состояниях организма человека и животных.
Роль фенотипа ГМК в формировании сосудов различного типа
Механизм регуляции дифференцировки сосудов на артериальные и венозные, мышечные и эластические являлся всегда предметом интенсивных научных исследований [36, 93, 175]. Архитектура кровеносных сосудов четко соответствует функциональной потребности данного сосуда, в основном, по поддержанию давления и доставки крови к органам. Однако, через какие механизмы реализуются, например, дифференцировка аорты в эластический, а коронарных артерий в мышечные типы остаются не раскрытыми. В тоже время расшифровка этих механизмов позволит изучить адаптацию сосудов к новым условиям после их пересадки и снизить риск их не состоятельности.
Артерии и вены - сосуды тонического типа. Исследование содержания специфических белков выявило, что мезентериальные артерии и вены не отличались по содержанию уровня актина, миозина, кальпонина, тропомиозина и кальдесмона. В артериях отмечалось только значимое увеличение экспрессии кальдесмона. Различие этих сосудов касалось толщины слоя ГМК в средней оболочке и плотности межклеточных контактов, которая была выше в артериальных сосудах [175].
Особенностью артериальных эластических и мышечных сосудов является различный уровень экспрессии десмина и коннексина 43 в них [111, 112], но остается не ясным чем вызвано это различие: уровнем экспрессии в самих ГМ клетках, или соотношением "синтетических" и "контрактильных" популяции клеток в этих сосудах?
Дифференцировка гладкомышечных клеток на этапах эмбрионального гистогенеза
Данные экспериментальных исследований, касающихся относительной взаимосвязи стадий дифференцировки и экспрессии различных гладкомышечных белков приведены в таблице 3.
Экспрессия перечисленных в таблице белков повышается до достижения их уровня, характерного для зрелого организма. Кроме того, в течение эмбриогенеза наблюдается транзиторная экспрессия большого числа белков, таких как цитокератины [154], ряд фибронектинов [95, 97, 153].
Таблица 3
Экспрессия белков на различных стадиях дифференцировки
гладкомышечных клеток.
Вопрос об экспрессии десмина остается предметом обсуждения. В ряде исследований показано, что а-ГМА появляется в эмбриональных гладкомышечных клетках легкого ранее, чем десмин и гладкомышечный миозин [126]. В то же время в скелетной мускулатуре экспрессия десмина наблюдается на более раннем этапе эмбриогенеза, а транзиторная экспрессия гладкомышечных белков лишь на поздних сроках [55, 93]. Причем, как указывалось ранее при дедифференцировке ГМК наблюдалось снижение экспрессии десмина [152]. Эти работы демонстрируют, что вопрос о роли десмина как белка - предшественника миогенных клеток не выяснен полностью.
Интересным является факт, что в формировании сократительного ансамбля и слиянии миобластов в синцитий десмин играет важную роль [129,
25 156]. Поэтому исследование роли а-ГМК, десмина и кальпонина остается важной проблемой, требующей разработки.
Не менее важными являются вопросы, касающиеся причин и механизмов, регулирующих путь дифференцировки сосудов тела. Исследование цитоархитектоники вен, артерий мышечного и эластического типа показали, что в формировании фенотипа сосуда важную роль может играть как клеточный фенотип, так и соотношение популяций различных клеток с разными фенотипами. Как было описано выше, точного ответа о ведущих механизмах регуляции фенотипа ГМК в доступной нам литературе обнаружить не удалось. По данным ряда авторов в этом процессе участвует слишком большое число различных факторов: физические, гормональные, трофические и др [93, 102, 131]. Мы полагаем, что изучение становления фенотипа в пренатальном периоде развития, позволит раскрыть часть этих механизмов и их роль в формировании нормальной архитектоники сосудистого русла.
Роль гладкомышечных клеток в становлении сосудистого русла печени
Первичный клеточный вырост, из которого в дальнейшем образуются секреторные отделы печени вместе с системой протоков и желчных пузырем, называется печеночным дивертикулом. Он возникает на четвертой неделе эмбрионального развития человека с вентральной стороны энтодермальной выстилки кишки. Первоначально печеночный дивертикул представляет собой утолщенный участок, состоящий из быстро размножающихся энтодермальных клеток [42]. Из этой закладки в вентральном и краниальном направлении растет лабиринт ветвящихся и анастомозирующих друг с другом клеточных тяжей. Из дистальных участков этих тяжей возникают секреторные отделы (печеночные балки), а из их проксимальных частей образуются печеночные протоки [42]. Ткань печени в процессе своего роста внедряется между двумя листками сплянхноплевры, образующей на этом уровне кишки вентральную брыжейку [164].
В результате продолжающегося роста печеночного дивертикула происходит отделение двух мезодермальных листков друг от друга и они оказываются лежащими на поверхности растущей железы. Из мезодермальных листков образуется фиброзная соединительнотканная капсула печени с ее мезотелиальным покровом и соединительной тканью, которая разделяет печень на отдельные доли, а также соединительная-ткань и гладкие мышцы протоков печени [164].
Ветвящиеся и анастомозирующие друг с другом балки, представляющие собой дистальные продолжения печеночных протоков, образуют активную секреторную часть печени. Пространства, между балками заполняются лабиринтом широких и неправильных капилляров, называемых синусоидами. Последующая дифференцировка желчных протоков и формирование портальных трактов приближает структуру печени к дефинитивному строению [42].
В течении 2-3 месяца гестации у человека печень быстро растет, достигая к концу этого периода 10% от веса тела. На 6 - 7 неделе эмбрионального развития человека в мезенхиме печени> появляются очаги кроветворения. Образование клеток крови достигает максимума на пятом месяце, а затем начинает постепенно угасать. В печени новорожденных можно встретить лишь небольшие группы гематогенных клеток [42].
Становление венозного сосудистого русла'
Развитие паренхимы печени неразрывно со становлением кровотока. Изначально, растущая печень вызывает эрозию желточных вен и формирование примитивных синусоидов. По мере своего дальнейшего роста и увеличения объема паренхима обрастает пупочные вены, которые к тому времени являются основным коллектором, несущим кровь в эмбрион. Парные желточные вены образуют друг с другом многочисленные анастомозы, что в, конечном итоге, приводит к образованию непарной портальной вены, несущей кровь от всего желудочно-кишечного тракта. Правая пупочная вена редуцируется начиная с ранних этапов эмбриогенеза и к началу фетального периода исчезает. Левая
27 пупочная вена перестает функционировать с момента рождения и во взрослом организме ее рудименты представлены круглой и венозной связками печени [36,42, 164].
Исходя из данных анатомического строения и ремоделирования сосудистой системы можно отметить основные этапы становления кровотока в печени. На ранних этапах эмбриогенеза млекопитающих основными эфферентными сосудами органа являются желточные вены. Включение в систему циркуляции пупочной вены приводит к значительному перераспределению кровотока. Основная масса крови поступает из плацентарного круга. Большая часть-крови из пупочной вены по венозному протоку поступает в нижнюю полую вену. Меньшая часть попадает в печеночные синусоиды, смешивается с кровью желточных вен и по печеночным венам попадает в системный кровоток. После рождения и редукции пупочной вены поступление крови в печень идет через портальную вену и печеночную артерию, а отток через систему печеночных вен [36, 42, 164].
Данные, полученные ультразвуковым методом исследования печени, позволили выявить ряд новых закономерностей сосудистого кровотока. Было показано, что в течении развития плода человека с 20 по 40 неделю гестации, происходит увеличение объема крови, проходящего через пупочную вену и венозный проток в 8,2 и 3 раза, соответственно, тогда как относительный объем фракции, проходящий через венозный шунт, уменьшается с 50% до 20% [138]. Подобный характер распределения кровотока необходим для нормального развития всех остальных внутренних органов. При окклюзии венозного протока у плода овцы, вызывавшей увеличение печеночной фракции кровотока, наблюдалось увеличение массы внутренних органов и усиление пролиферации клеток практически всех тканей [158]. В то же время, при сравнительных исследованиях различных видов животных отмечается значительная вариабельность строения данного отдела сосудистой системы, вплоть до полного отсутствия, наблюдаемого у морских свинок [66].
На основании литературных данных можно полагать, что становление венозного кровотока в печени проходит в три этапа: вителлиновый, пупочный и портальный [164]. Однако, не ясно, каким образом сосудистое русло меняется на столь быстро меняющиеся условия кровоснабжения. В литературе отсутствуют данные относительно изменения фенотипа сосудов печени как на ранних, так и на поздних этапах эмбриогенеза млекопитающих.
Становление артериального кровотока и желчевыводящей системы
Несмотря на то, что исследование гистоструктуры печени началось с начала 20 века и уже тогда были выяснены основные закономерности, ряд моментов продолжают оставаться не полными и требуют дальнейшего изучения. Одним из "белых пятен" современных знаний об эмбриологии печени является становление смешанного портального кровотока и механизма развития желчных протоков печени. В ранних работах, основанных на концепции эпителиального происхождения печени считается, что закладка желчных протоков, артериальных сосудов начинается с ранних этапов эмбриогенеза и уже на стадии печеночного дивертикула в печени присутствуют все компоненты портальной системы [36,42,164].
Внедрение иммуногистохимических методов исследования позволило значительно продвинуться в понимании данных вопросов. Было показано, что клетки экстрапеченочных и печеночных желчных протоков имеют различные эмбриональные предшественники. Изучение экспрессии белков цитоскелета в развивающейся печени показало, что гепатобласты, располагающиеся в области портальных трактов, экспрессируют цитокератины, характерные для клеток желчных протоков. Это позволило выдвинуть гипотезу, что образование внутрипеченочных желчных протоков идет через дифференцировку портальных гепатобластов. Однако, в дальнейших исследованиях были выявлены факты, не укладывающиеся в рамки указанной гипотезы. Было установлено, что процесс дифференцировки желчных протоков портальных трактов растянут по времени. Даже на срезах печени новорожденных обнаруживались высокодифференцированные протоки центральной области и
29 малодифференцированные на периферии этой железы. Во-вторых, было выявлено, что все гепатобласты экспрессирую холангиолярные цитокератины, но в различных зонах ацинуса их экспрессия не одинакова. При иммуногистохимическом исследовании наблюдается градиент экспрессии, в области портальных трактов он максимален, тогда как на периферии ацинуса содержание холангиолярных цитокератинов минимально [159]. Возникает резонный вопрос: каким образом и где происходит стыковка экстрапеченочных и интрапеченочных протоков и как реализуется этот процесс? Более того, рядом исследователей описана аномалия развития желчевыводящеи системы -билиарная атрезия, когда не происходит развития желчных протоков в печени и в портальных трактах отсутствуют ее элементы [76, 144].
На основании противоречий литературных данных можно предположить, что развитие желчевыводящеи системы идет за счет прорастания ветвей экстрапеченочных желчных протоков в портальные тракты, и что развитие печеночной артерии может идти параллельно с становлением желчных протоков. Подтверждением этого являются сведения исследователей, регистрировавших либо сформированные портальные тракты, либо наличие только портальной вены в них [98, 159]. Таким образом, изучение становления артериальной системы печени в эмбриогенезе позволит внести ясность в этот вопрос.
Становления'фенотипа гладкомышечных клеток на этапах пренатального развития млекопитающих
Гладкомышечные клетки (ГМК) составляют особую популяцию клеток, ответственную за функционирование многих органов и систем: пищеварительной и дыхательной систем, органов мочевыделения. В сердечнососудистой системе они отвечают за поддержание тонуса и регуляцию диаметра сосудов. Они также играют ключевую роль в формировании патологических процессов в сосудистой стенке [59]. Поэтому, исследование модуляции их фенотипа может способствовать раскрытию механизмов развития таких заболеваний, как артериосклероз при гипертонии, атеросклероз, рестеноз после аортокоронарного шунтирования и баллонной ангиопластики и др. В отличие от скелетной и сердечной мышц, где клеточная дифференцировка соответствует стабильной экспрессии мышечноспецифических генов [134, 170], ГМК имеют выраженную фенотипическую пластичность и способность вступать в клеточный цикл [148]. Это уникальное свойство гладкомышечных клеток связано с потерей ими ряда специфических белков [90, 96]. Благодаря этому, сердечно-сосудистая система обладает большой пластичностью и способностью адаптироваться к изменениям потребностей кровотока. В то же время, нарушение пролиферации и дифференцировки гладкомышечных связано с различными заболеваниями кардиоваскулярной системы [96, 148]. Исследование интимных механизмов развития этих процессов позволило бы разработать более эффективную тактику терапии таких заболеваний, как несостоятельность сосудистого трансплантанта, ангиопатий при диабете и гипертонии. Решению этих проблем может способствовать разработка ряда таких вопросов, как: "Что является главным? Гетерогенность происхождения ГМК или гетерогенность пространственно-временных характеристик экспрессии специфических белков". Имеются факты, свидетельствующие о возможности трансдифференцировки зрелых гладкомышечных клеток в другие типы [93]. Исследования, направленные на раскрытие фундаментальных основ функционирования сосудистой системы, позволят решить многие ключевые вопросы стратегии терапии сосудистых заболеваний. Происхождение гладкомышечных клеток млекопитающих Три мышечных типа: скелетный, сердечный и гладкий происходят из различных популяций предшественников в течении эмбриогенеза [70, 149].
Скелетные мышцы происходят из сомитов - образований, располагающихся непосредственно вдоль нервной трубки. Компартментализация сомитов дает начало миотому, из которого формируется аксиальная мускулатура [62]. Клетки вентролатерального края дерматомиотома сомита мигрируют в зачаток конечности и формируют мускулатуру конечностей [62]. Сердечная мышца происходит из передне-латерального участка мезодермы. Изначально формируются примитивные сердечные трубы с последующим образованием петли и камерной спецификации [107]. Закладка кровеносных сосудов начинается с дифференцировки из спланхномезодермы эндотелиальных клеток, которые являются главным строительным блоком сосудистой системы. Показано, что значительную роль в этом процессе играет энтодермально-мезенхимальное взаимодействие [136]. После дифференцировки мезенхимальных клеток в предшественники эндотелия они становятся подвижными и формируют сосудистую сеть. На следующем этапе происходит обособление клеток вокруг примитивного эндотелия и формирование среднего слоя крупных артерий и вен. Однако, не только мезодерма может являться основным локусом происхождения гладкомышечных клеток. В экспериментах in vivo было показано, что первый слой клеток, экспрессирующих а-ГМА, вокруг эндотелиальных труб, трансдифференцируется из эндотелия [75]. Отмечено, что эндотелиальные клетки ряда сосудов (легочные вены) одновременно экспрессируют как эндотелиальные протеины, так и гладкомышечные [102]. На настоящий момент исследуется специфичен ли этот механизм трансдифференцировки только для аорты, где он был впервые выявлен, или это более общий феномен, который может играть роль в утолщении интимы при заболеваниях сосудов. Кроме эндотелия и спланхномезодермы, имеются и другие источники гладкомышечных клеток. На модели химерного эмбриона было выявлено, что коронарные ГМК происходят из эпикардиальной оболочки посредством ее трансформации. Однако при исследовании развития коронарных сосудов не удалось определить возможность перехода эндотелиальных клеток в гладкомышечные путем их трансдифференцировки [77, 167]. Нервный гребень также рассматривается как один из источников гладкомышечных клеток [147]. На модели химерного эмбриона [58, 118] и ретровирусного переноса маркерного гена [58, 132] показано, что из нервного гребня могут развиваться гладкомышечные клетки артерий груди, шеи и головы [127, 147]. Потомки клеток нервного гребня присутствуют также в стенке кардинальных вен [58]. Результаты анализа литературных данных относительно происхождения гладкомышечных клеток крупных артерий после их систематизации нами представлены в таблице 1. В последнее время стали появляться работы, относительно существования стволовой клетки костного мозга, способной дифференцироваться в ГМК сосудов [145]. Предполагалось, что выделение и культивирование подобных клеток позволит использовать их для лечения заболеваний, связанных с повреждением мышечной ткани (например, инфаркт миокарда).
Но введение мезенхимальных стволовых клеток при экспериментальном повреждении сердца вызывало дифференцировку значительной части этих клеток в фибробласты, и лишь незначительная их часть дифференцировалась по миогенному пути [174]. Изучение процессов дифференцировки популяции гладкомышечных клеток вызывает разноречивые толкования их результатов разными авторами. Ряд исследователей считает, что дифференцировка ГМК начинается сразу во многих регионах эмбриона [93, 139], тогда как другие авторы [117, 132] отмечают определенную последовательность этого процесса. Если утверждать, что первое предположение является доминирующим, то в реализации программы дифференцировки ГМК основную роль играют генетические факторы. Если в процессах созревания участвуют различные внешние факторы: трофические факторы, цитокины, продуцируемые соседними клетками; физиологические сдвиги, такие как изменение артериального давления, ионного состава, оксигенации крови, то дифференцировка гладкомышечных клеток будет происходить по второму пути. Поэтому дальнейшие исследования в этом направлении позволят более объективно судить о механизмах дифференцировки ГМК и эмбрионального сосудистого русла в процессе пренатального развития млекопитающих. Экспериментальное обоснование гетерогенности фенотипа гладкомышечных клеток в опытах in vivo и in vitro Гетерогенность ГМК — общеизвестный научный факт. Однако интерпретация фенотипа, также как и функциональное значение экспрессии различных белков, является не до конца расшифрованными. Идет интенсивный поиск факторов, которые модулируют фенотип клеток в условиях как нормы, так и патологии [73, 93, 122]. Данные, полученные in vitro, объясняют механизм лишь незначительной части фактов, полученных в экспериментах на моделях in vivo. Поэтому понять роль, которую играет отдельно взятый механизм в целом организме, достаточно трудно. При исследовании фенотипа культивируемых гладкомышечных клеток было выявлено, что с морфологической точки зрения существует два типа гладкомышечных клеток: эпителиоидные (epithelioid - shaped) и веретенообразные (spindle - shaped) [82, 59]. Кроме того, выявлены еще тонкие удлиненные (thin elongated) и стареющие клетки (senescent) [59]. Фенотипические характеристики клеток остаются относительно стабильными, когда в культуре тканей достигался монослой [68]. Однако в субоптимальных условиях, когда в питательной среде недостаточное количество ионов и питательных веществ, контрактильный фенотип ГМК может меняться на синтетический [68]. Эпителиоидные клетки характеризуются меньшим уровнем экспрессии сократительных белков, более высокой степенью пролиферации, что позволяет рассматривать их как предшественники зрелых ГМК [93].
Методы исследования
Для каждой крысы, включенной в исследование, определяли динамику массы на протяжении беременности, потребление ею воды, пищи. Кроме того, следили за общей поведенческой активностью и характеристику вегетативной деятельности (частота мочеиспускания и дефекации). После вывода крысы из эксперимента выделяли органы крысы для последующего взвешивания и гистологического исследования: печень, почки, сердце, селезенку, тимус, мозг, гипофиз, надпочечники, легкое, поджелудочную железу, аорту, трахею с щитовидной железой, участок тонкой кишки, желудок. Для ряда органов животных определяли коэффициент их массы (печень, почки, сердце, селезенка, тимус, мозг, гипофиз, надпочечники). Оценка смертности и общего развития потомства крыс На 20 день гестации самку наркотизировали эфирным наркозом. Вскрывали живот продольным разрезом и на место соединения матки с влагалищем накладывали шелковую лигатуру. Далее, разрезом по брыжейке матку и яичники выделяли из брюшной полости. От матки с плодами отделяли яичники для последующего подсчета количества желтых тел. Отдельно подсчитывают желтые тела на каждой стороне. После этого яичник взвешивали, посчитывали коэффициент массы, фиксировали в формалине и заливали в парафин. Желтые тела представляли собой шаровидные образования, розового цвета, располагающиеся на поверхности яичника. Каждое желтое тело представляет собой оставшиеся после овуляции клетки фолликула. Далее, делали продольный разрез вдоль всей стенки матки, отделяли плоды и их плаценты от стенки матки. После выделения всего помета, осматривали стенку матки для подсчета числа мест имплантаций и тел резорбций. Место имплантации представляло собой участок матки в который произошла имплантация бластоцисты. При визуальном осмотре стенки матки оно выглядело как локальное утолщение. Раннее тело резорбции представляло собой эмбрион, погибший на ранних этапах эмбриогенеза. При визуальном осмотре полости матки выглядело, как округлый комочек слизи, темно красного цвета. В отличие от места поздней резорбции в нем невозможно отдифференцировать плаценту и зародыш. Эмбрион, погибший на поздних этапах эмбриогенеза приводил к образованию позднего тела резорбции. При визуальном осмотре полости матки оно выглядело, как плотное образование в котором различается плацента и погибший эмбрион. Далее осматривали каждый плод в отдельности.
Если при прикосновении браншей пинцета к плодику наблюдалось тоническое сокращение мышц тела, то данный плод считали живым. Если тонического рефлекса не наблюдалось, то плод считали мертвым [28]. Все полученные данные заносили в протокол. После этого оценивали степень развития плодов. Для этого эмбрионы и их плаценты взвешивали, определяли краниокаудальный размер, диаметр плаценты, аногенитальную дистанцию. Краниокаудальный размер (crounramth length) считали как размер от края носа до основания хвоста. Аногенитальная дистанция (anogenital distance) — расстояние от края полового бугорка до анального отверстия. У особей мужского пола она была больше в 1,5—2 раза, что позволяло отдифференцировать плоды разного пола. После анализа результатов всех опытов рассчитывали показатели пред- и постимплантационной смертности. Показатель предимплантационной смертности оценивали как индекс, показывающий отношение общего числа имплантаций к количеству желтых тел. Он позволяет выявить какая часть яйцеклеток погибла, не имплантировавшись в матку. Постимплантационную смертность оценивали, как индекс, показывающий отношение разности числа мест имплантации и количества живых плодиков к числу мест имплантаций. Этот коэффициент демонстрирует какая часть имплантировавшихся яйцеклеток погибла в процессе эмбриогенеза. Оценка аномалий развития у плодов крысы После оценки показателей эмбриональной гибели все плодики осматривали на наличие внешних аномалий развития лицевой, шейной, грудной области, наличие геморрагии и кровоизлияний на туловище. Также оценивали правильность закладки всех отделов конечностей. В конце эксперимента весь помет от крысы делили на три части, 1/3 помещали в раствор Буэна для морфометрического исследования, 2/3 в 96% или 70% спирт для исследования по методике Доусона. Эмбрионы фиксировались в растворе Буэна на протяжении одной недели. После этого серией разрезов бритвой получали сегменты тела, которые изучали под микроскопом. Первый разрез производится на уровне головы перпендикулярно нижней челюсти, непосредственно за вибриссами. На этом срезе оценивали состояние нижней челюсти, переднего отдела твердого неба и носовой полости. Второй разрез, для исследования правильности закладки глаз и обонятельных луковиц, проводили через середину глазных яблок. На третьем разрезе изучали состояние коры больших полушарий. Четвертый разрез проводили за ушной раковиной в области мозжечка и продолговатого мозга. Пятый разрез делали через туловище на уровне гортани. На нем оценивали пищевод, спинной мозг, сосуды, слюнные железы. На шестом разрезе, проходящем параллельно предыдущему, изучали пищевод, трахею, спинной мозг, сосуды. Седьмой разрез делали под передними конечностями. На нем наблюдали сердце, легкие, бронхи, спинной мозг и пищевод. Восьмой срез проводили на половине расстояния от седьмого среза до пупочного кольца. На разрезе осматривали печень, а после ее удаления — диафрагму. Девятый разрез проводили ниже пупочного кольца, на нем осматривали печень, желудок, кишечник, поджелудочную железу.
Осмотрев все это, осторожно удаляли печень и петли кишечника и осматривали почки, мочеточники, мочевой пузырь, половые органы. Для оценки скелета по методике Доуссона плоды фиксировали в 100% этаноле не менее семи дней, удаляли внутренности и погружали в 1% раствор КОН для просветления мягких тканей на 1 - 3 суток. Затем, полученные препараты вынимали, промывали водопроводной водой и переносили их в раствор А (150 мл глицерина, 300 мл дистиллированной воды и 10 г КОН), к которому добавляли несколько капель раствора Б (1% раствор ализарина красного) до появления светло-фиолетового окрашивания. Через 6-7 суток окостеневшие участки скелета окрашивались в красно-фиолетовый цвет. Для обесцвечивания мягких тканей плоды переносили в раствор А на 7 - 14 дней. Затем их последовательно проводили через водные растворы глицерина возрастающей крепости с целью обезвоживания. Для последующего хранения плоды оставляли в глицерине. Препараты в дальнейшем изучали под бинокулярным микроскопом с микрометром. Учитывали аномалии скелета, величину и количество точек окостенения в различных костных образованиях. Обнаруженные костные аномалии фиксировали в протоколе и фотографировали на фотоаппарат Olimpus. 2.2.2. Гистологические и иммуногистохимические методы исследования Депарафинирование парафиновых срезов проводили в двух сменах толуола (экспозиция 5 мин), двух сменах абсолютного этанола (экспозиция 5 мин) и двух сменах 96% этанола (экспозиция 5 мин). Из второй смены 96% этанола препараты переносили в дистиллированную воду на 5-10 мин для регидратации. Окрашивание гематоксилин-эозином Для окрашивания применяли квасцовый гематоксилин Караци [27] и 1% водный раствор эозина. Окрашивание проводили по следующей схеме. После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали 30-45 сек с раствором гематоксилина, затем дифференцировали окраску в водопроводной воде (7-10 мин). Далее на 2-3 мин на срезы наносили раствор эозина, после чего споласкивали в дистиллированной воде и заключали в глицерин-желатину [27]. Окрашивание парафиновых срезов эмбрионов крысы антителами против а-ГМА Парафиновые срезы исследуемых эмбрионов крысы окрашивали антителами к а-ГМА (клон 1А4, DAKO, Denmark; разведение 1:50). Окрашивание проводили стрептавидин-биотиновым методом. После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали 20 мин с 1% раствором перекиси водорода в ТБС, споласкивали в ТБС и инкубировали 45 мин с первичными антителами. После инкубации трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали 30 мин с биотинилированными вторыми антителами (Link, DAKO LSAB+Kit Peroxidase).
Оценка влияния курсового введения димефосфона на фетометрические параметры плодов
Для оценки морфометрических показателей всех живых эмбрионов извлеченные плоды осматривали для определения половой принадлежности, их массы и длины тела. Было выявлено, что средняя масса и длина плода маловариабельные параметры. Курсовое введение димефосфона не оказывало влияния на эти показатели мужских и женских особей (Таб. 6). Результаты оценки массы и диаметра плацент крыс показали, что введение препарата не оказывало влияния на параметры этого органа. При внешнем осмотре было выявлено, что на 20 день гестации плоды как контрольной, так и опытной групп хорошо сформированы (рис. 6, 7). В лицевом отделе отмечались признаки физиологической незрелости: закрытая глазная щель, ушные плакоды, примыкающие к коже теменной области, и закрывающие наружный слуховой проход. В ротовой полости плодов имелись: сформированный язык, небные валики были полностью сращены и отделяли носовую полость от ротовой. В обеих группах плодов крыс расщелины неба, верхней и нижней челюсти не были обнаружены. На 20 день гестации эмбрионы имели полностью сформированные верхние и нижние конечности, на которых имелись по пять пальцев. На данном сроке исследования в обеих группах плодов не было выявлено ни одного плода с признаками пупочной грыжи, что свидетельствовало о полном ее исчезновении. Пупочный канатик плодов представлял собой тяжистую структуру, содержащую сосуды. При внешнем обследовании пуповины не было обнаружено наличие варикозов, геморрагии и кистозных образований, как в контрольной, так и в группе опытных животных. Визуальный осмотр области позвоночника показал отсутствие таких нарушений развития как рахиошизис, сколиоз, уменьшение длины. Все плоды крыс имели хорошо сформированный хвост без каких-либо утолщений и деформаций. Визуальное исследование генитальной области плодов показало, что все детеныши имели хорошо сформированный половой бугорок без Оценка развития лицевого отдела черепа плодов крыс показала, что к 20 дню гестации глазницы, верхняя и нижняя челюсть, носовые ходы были хорошо сформированы и в них визуализировались все основные анатомические структуры. Димефосфон не вызывал развития аномалий лицевого отдела черепа. Изучение мозговой части черепа показало, что плоды крыс имели сформированный головной мозг, содержащий все анатомические структуры, характерные для взрослого организма: полушария, мозжечок, желудочки (рис. 8, 9).
При исследовании в головном мозге, таких аномалий как гидроцефалия, кровоизлияния, уменьшение его размеров не были выявлены, как в опытной, так и контрольной группе плодов крыс. Отмечавшееся полнокровие сагиттальных синусов было отмечено в обеих группах (таб. 7). Стволовые отделы головного мозга, мозжечок, продолговатый мозг хорошо визуализировались, и при их исследовании также не было выявлено аномалий. Наблюдаемые при исследовании головы плода слюнные железы не отличались в обеих группах. При визуальном исследовании органов шеи определялись крупные сосудисто-нервные пучки, пищевод, трахея, спинной мозг, щитовидная железа. У всех обследованных особей не было выявлено таких аномалий органов шеи как агенезия, дисплазия или кровоизлияние в них. Сравнительная оценка их не выявила различий, как в контрольной, так и в опытной группе плодов. При изучении сегментов тела на уровне грудной полости хорошо визуализировались все внутренние органы: сердце, легкие, бронхи, спинной мозг и пищевод. Как в контрольной, так и в опытной группе плодов не было отмечено появление грубых аномалий: декстрокардии, агенезии. Отмечавшиеся случаи полнокровия предсердий и сосудов легких в обеих группах животных был равнозначными. Осмотр диафрагмы показал, что у всех особей грудобрюшная преграда была полностью сформирован. Как в опытной, так и в контрольной группе животных не было выявлено дефектов или кровоизлияний в диафрагме. При визуальном осмотре органов брюшной полости плодов все органы печень, почки, кишечник и др. хорошо визуализировались (рис. 10, 11). В отдельных случаях были отмечены кровоизлияния в стенку брюшной полости, но эти различия были статистически незначимы в обеих группах. Печень занимала большую часть брюшной полости. Как в опытной, так и в контрольной группе животных аномалий печени, селезенки и поджелудочной железы не наблюдалось. Внешний осмотр кишечника не выявил различий между опытной и контрольной группой плодов. При исследовании почек и мочеточников отмечались гидронефроз и гидроуретер (рис. 12). Однако оценка этих различий между группами не выявила достоверных различий (таб. 8). При визуальном осмотре органов малого таза визуализировались мочевой пузырь, мочеточники и половые органы. При сравнении плодов опытной и контрольной группы не было выявлено каких-либо аномалий развития (рис. 13, 14). При визуальном исследовании скелета плодов крыс наблюдались признаки физиологической его незрелости. Все кости черепа как лицевого, так и мозгового отдела были сформированы не полностью (рис. 15, 16). Сравнительная оценка результатов не выявила аномалий или различий в контрольной и опытной группах плодов крыс (таб. 9). Все позвонки имели по три точки оссификации. При исследовании всех отделов позвоночного столба не было выявлено искривлений, деформаций или отсутствия позвонков. Эти показатели были равнозначными в обеих группах. При исследовании передних конечностей хорошо визуализировались точки окостенения пояса верхних конечностей (лопатки, ключицы) и свободной их части (плечевой, локтевой, лучевой). Как в контрольной, так и опытной группе плодов крыс не было выявлено отсутствия точек оссификации, деформации или появление окостенения в аномальных участках.
При осмотре хорошо визуализировались грудина и ребра. Грудная клетка плодов имела правильную форму. У всех исследованных эмбрионов не отмечалось расщепления грудины или ее отсутствие. Как в контрольной, так и в опытной группе плодов крыс не было выявлено каких-либо аномалий развития в виде отсутствия или деформации костей этой области (рис. 17, 18). Количество ребер было равнозначным в обеих группах животных (по 12 пар). При визуальном исследовании тазового отдела отмечался правильный характер закладки всех отделов таза у всех исследуемых особей. Точки окостенения бедренной, малоберцовой, болыпеберцовой костей и стопы были одинаковы в обеих группах животных. Не отмечалось признаков нарушения закладки костей всех отделов пальцев стопы. Морфометрическое изучение точек окостенения различных отделов скелета не выявило отличия плодов опытной группы от контрольной (таб. 10). Длина точек окостенения костей задних конечностей (бедренной, большеберцовой, малоберцовой костей) были равнозначными в обеих группах животных. Оценка этих параметров передней конечности (плечевой, локтевой костей) не выявила значимых изменений длины зачатка плечевой (рис. 19, 20) и локтевой кости. Форма и расположение зачатка этой кости были одинаковы в исследуемых группах. Подсчет количества точек окостенения в стопе и кисти не выявил отличий опытной группы плодов от контроля. Расчет соотношения плодов разных полов показал, что как в контрольной, так и в опытной группе плодов крыс эти показатели были равнозначными (таб. 11). Измерение аногенитальной дистанции показало, что исследуемый препарат не влияет на эту величину, как в контрольной, так и опытной группе крыс эти показатели были равнозначными. Последующий расчет аногенитального индекса позволил выявить, что препарат не изменял как абсолютной величины, так и относительной величины аногенитальной дистанции. Считается, что нарушение эмбрионального развития может реализовываться по трем основным путям, регистрируемым исследователем: эмбриолетальность, общая задержка развития и аномалии наружных и внутренних органов, скелета [28]. Результаты наших исследований свидетельствуют, что введение димефосфона с 1 по 19 день гестации не приводит к нарушениям, как на уровне организма беременной крысы, так и на уровне эмбрионального развития ее плодов. Оценка результатов выживаемости эмбрионов показала, что в группе димефосфона показатели предимплантационной и постимплантационной гибели не превышают контрольного уровня. Эти факты свидетельствуют об отсутствии влияния изучаемого препарата, как на процессы имплантации бластоцисты в стенку матки, так и ее дальнейшего развития до фетальной стадии.
Влияние курсового введения димефосфона беременным крысам на гистоструктуру некоторых органов эмбрионов крыс на 20 день гестации
У эмбрионов опытных крыс на 20 день гестации при морфологическом исследовании было выявлено, что структура ткани их внутренних органов: печени, почек, пищевода, кишечника не отличалась от их таковой у плодов контрольных животных. Ткань пищевода имела двухслойную мышечную оболочку. В ткани этого органа не были обнаружены очаги десквамации эпителия, дистрофии клеток различных органов (рис. 38, 39). Исследование спинного мозга показало, что гистоструктура этого органа при действии препарата была не изменена. В ней отсутствовали очаги кровоизлияния, некроза или дистрофии (рис. 40). Исследование ткани печени не выявило признаков ее поражения у плодов крыс, получивших димефосфон в период беременности. На гистопрепаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, определялись гепатоциты, кроветворные клетки (мегакариоциты, эритробласты). Признаков некроза гепатоцитов и повышения объема соединительной ткани не было выявлено в печени как контрольной (рис. 41), так и опытной группе плодов крыс (рис. 42). Исследование срезов губчатых костей плодов животных опытной и контрольной групп показало, что на 20 день гестации в костномозговой полости их имелись кроветворные клетки. Исследование гистологических препаратов, окрашенных антителами к десмину, показало, что в скелетных мышцах контрольных плодов визуализировался только десмин. Кальпонин и а-ГМА в миофибриллах не экспрессировались. Димефосфон не менял характер экспрессии белков в скелетных мышцах. В аорте экспрессия исследуемых белков была сходна в обеих группах плодов крыс. Десмин не выявлялся, тогда как а-ГМА (рис. 43) и кальпонин (Рис. 44) присутствовали в ней. Исследование пупочной вены эмбрионов, как опытной, так и контрольной групп не выявило различий по экспрессии белков. В обеих исследуемых группах плодов крыс десмин и кальпонин не выявлялись в плодовой части пупочной вены, в отличие от а-ГМА. В стенке экстраплодовой части пупочной вены визуализировались все исследуемые белки, как в опытной так и контрольной группе. Изучение гистологических препаратов ткани сердца показало, что в обеих группах плодов в этом органе экспрессировался десмин, тогда как а-ГМА и кальпонин не выявлялись.
При морфологическом исследовании в легких отмечалась различная степень дифференцировки бронхов как в опытной, так и контрольной группах животных. А-ГМА выявлялся в стенке бронхов как крупного, так и среднего калибра (рис. 45), тогда как кальпонин был только в стенке крупных бронхов (Рис. 46). Такое соотношение уровня экспрессии указанных белков было обнаружено как в контрольной, так и опытной группах плодов крыс. Десмин, а-ГМА и кальпонин регистрировались в подслизистом и мышечном слоях всех отделов желудочно-кишечного тракта плодов обеих групп. Как видно из рисунков 47 и 48 визуализировалось два слоя клеток положительных на а-ГМА и кальпонин, соответственно. В гистологических препаратах ткани печени, окрашенных на исследуемые белки на данном сроке десмин не был выявлен в ее сосудах. А-ГМА присутствует как в венозных, так и артериальных сосудах этого органа (рис. 49), в то время как число сосудов, имеющих кальпонин положительные клетки в оболочке было намного снижено. Подобное распределение белков было аналогичным в обеих группах экспериментальных плодов крыс. При исследовании паренхимы печени как контрольных, так и опытных плодов крыс не было выявлено клеток положительно окрашенных на а-ГМА Использованию лекарственного препарата в медицинской практике должна предшествовать всесторонняя оценка его влияния на репродуктивную функцию. Информация об этих эффектах лекарственного препарата должна быть доступна как для врачей, так и для пациентов и она должна быть достоверной. Отсутствие информации о репродуктивной безопасности или преуменьшение вероятности развития действия лекарственного средства на развитие эмбриона может привести к различным аномалиям внутриутробного развития. Фосфорорганические вещества нашли широкое применение в медицине, благодаря выраженному биологическому действию. Условно все фосфорорганические вещества разделяются по их способности ингибировать активность холинэстеразы. Препараты с антихолинэстеразным типом действия широко применяются в медицине для коррекции нарушений холинэргических систем организма. Фармакологические свойства этих лекарственных препаратов хорошо изучены и они используются в офтальмологии, неврологии, хирургии и других областях медицины [45]. Однако механизм действия и возможные области применения лекарств из группы неантихолинэстеразных ФОС до конца не изучены и продолжают оставаться предметом интенсивного исследования [7, 9, 38]. К фосфорорганическим соединениям, проявившим выраженные фармакологические свойства, относятся представители монофосфонатов и бисфосфонатов. Согласно международной номенклатуре IUPAC бисфосфонаты относятся к дифосфоновым кислотам и характеризуются наличием двух Р-С связей [29]. С 70-х годов прошлого века они начали интенсивно изучаться в качестве объектов, проявляющих биологическую активность, и специфические фармакологические свойства. Было выявлено, что наиболее выраженное действие этих соединений связано с вмешательством их на обмен кальция в организме [166]. Бисфосфонаты подобны органическому пирофосфату, содержащему Р=0=Р связь, в их структуре атом кислорода заменен на атом углерода [87].
Такое изменение их химической структуры привело к тому, что они оказались устойчивыми к ферментативному гидролизу [166]. Благодаря высокой афинности к фосфату кальция, эти вещества связывались с поверхностью кристаллов фосфата и ингибировали их рост in vitro; аналогичный механизм проявлялся в условиях in vivo. При поступлении бисфосфонатов в организм они прочно адсорбировались на поверхности гидроксиапатитных кристаллов костной ткани и препятствовали их разрушению [88]. Ряд исследователей полагают, что связь является необратимой и бисфосфонаты остаются в костной ткани на протяжении всей жизни млекопитающих, в том числе, и у человека [4, 123]. Известно, пирофосфат играет важную роль в организме, участвуя в процессах минерализации. Он препятствует кальцификации мягких тканей и образованию камней и содержится в плазме, моче, синовиальной жидкости. Однако, при поступлении в организм извне соединения близкие к пирофосфату по структуре гидролизуются пирофосфатазой [166], что не позволяет использовать их в медицинской практике. Бисфосфонаты в отличие от пирофосфата при поступлении в желудочно-кишечный тракт не разрушаются пирофосфатазой стенки кишечника и в неизмененном виде поступают во внутреннюю среду организма [168]. Основная терапевтическая ценность бис- и монофосфонатов связана с их способностью ингибировать остеокласт опосредованную резорбцию кости [4, 123]. Замена ОН группировок у атома углерода позволила синтезировать большое количество бисфосфонатов с различными физическими, химическими свойствами, фармакологическими и неоднозначной терапевтической ценностью. Эти препараты нашли широкое применение при нарушениях костной ткани, характеризующейся увеличением резорбции кости: болезни Педжета, остеопорозе, вторичном гиперпаратиреозе, остеопорозе [88, 166]. Вместе с тем зарегистрировано, что при применении бисфосфонатов наблюдается ряд нежелательных эффектов: преходящая лихорадка и лимфопения. Они наиболее выражены при внутривенном введении альдроната и других аминобисфосфонатов [168]. Предполагается, что в реализации этих эффектов основную роль играет высвобождение IL-1 макрофагами.
![Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии [Электронный ресурс]](/i/i/4449/188653.png "Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии [Электронный ресурс] Шилова Наталья Владимировна")
