Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Роль эндотелия и васкуляризации в развитии, функционировании и репаративной регенерации костной ткани 14
1.2. Дисфункция эндотелия, принципы ее фармакологической коррекции и основные группы эндотелиопротективных препаратов 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Моделирование генерализованного остеопороза, переломов бедренной кости и последующего остеосинтеза переломов 40
2.2. Измерение микроциркуляции в костной ткани и проведение функциональных сосудистых проб 41
2.3. Гистоморфометрическая оценка изменений, происходящих при генерализованном остеопорозе и его коррекции 45
2.4. Обоснование доз и дизайн эксперимента 46
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 49
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 50
3.1. Комплексная оценка развития генерализованного остеопороза в эксперименте с использованием результатов измерения микроциркуляции в кости, функциональных проб и гистоморфометрического исследования 50
3.2. Изучение остеопротективного действия ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана при экспериментальном генерализованном остеопорозе 68
3.3. Изучение влияния ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов 79
Заключение 87
Выводы 94
Список литературы 96
- Дисфункция эндотелия, принципы ее фармакологической коррекции и основные группы эндотелиопротективных препаратов
- Измерение микроциркуляции в костной ткани и проведение функциональных сосудистых проб
- Изучение остеопротективного действия ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана при экспериментальном генерализованном остеопорозе
- Изучение влияния ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов
Введение к работе
Актуальность исследования
«Остеопороз (ОП) - системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы кости в единице объема и нарушением микроархитектоники костной ткани, приводящими к увеличению хрупкости костей и высокому риску их переломов». Данное определение ОП было сформулировано на международных конференциях в Копенгагене (1990) и Гонконге (1993) и в настоящее время является общепринятым [22, 73].
В основе развития остеопороза лежит дисбаланс между двумя основными процессами костного ремоделирования: костной резорбцией и костеобразованием [52, 73]. Важным звеном в патогенезе остеопороза, особенно иммобилизационного, является снижение кровоснабжения кости [109, 193], приводящее к торможению активности и уменьшению количества остеобластов, а также к усиленной деятельности остеокластов.
В настоящее время ОП является одним из наиболее частых и тяжелых заболеваний скелета, этиологические и патогенетические аспекты которого представляются не до конца изученными [5, 52, 55]. По мнению ВОЗ ОП занимает четвертое место по значимости вслед за сердечно-сосудистыми, онкологическими заболеваниями и сахарным диабетом [22]. Поэтому в конце XX века возникла идея организации борьбы с этим патологическим состоянием, а ВОЗ провозгласила первое десятилетие XXI века «Декадой костей и суставов».
Однако статистические данные свидетельствуют не только о росте заболеваемости ОП, но и о неуклонном увеличении числа его осложнений -остеопоротических переломов [50]. По прогнозам экспертов к 2050 году в мире частота одних только переломов шейки бедра, связанных с ОП, возрастет с 1,7 млн. до 6,3 млн. случаев в год (по данным «Osteoporosis in the European Community»). Показатели смертности в течение первого года после такого перелома составляют от 12 до 40% (по данным National Osteoporosis
Foundation). У половины больных, выживших после перелома бедра, значительно снижается качество жизни, каждый третий больной утрачивает способность к самообслуживанию, нуждается в длительном постоянном уходе и внушительных материальных затратах на лечение и реабилитацию.
Для успешной консолидации перелома также большое значение имеет васкуляризация костных отломков [109, 193]. Всякий перелом трубчатой кости сопровождается повреждением мягких тканей; при этом повреждаются сосуды и нервы, проникающие в кость со стороны надкостницы. Чем больше повреждение питающих сосудов и надкостницы, то есть значительнее нарушение кровоснабжения отломков, тем условия для сращения перелома менее благоприятны, и тем медленнее протекают процессы репаративной регенерации кости.
Значительную роль в поддержании на адекватном уровне процессов костного ремоделирования, а также репаративной регенерации костной ткани играет кровоснабжение кости. Переломы у пациентов, страдающих остеопорозом, возникая на фоне структурных, количественных и качественных изменений в костной ткани, требуют иных подходов к лечению, чем повреждения костей у здоровых лиц.
Как известно, строение микроциркуляторного русла костной ткани существенно отличается от морфологии сосудистого русла остальных тканей организма. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев. Таким образом, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью.
В то же время в доступной литературе мы не нашли сведений о том, чтобы кто-либо использовал эндотелий костных сосудов как мишень фармакологического воздействия при остеопорозе и переломах на его фоне.
В условиях повреждения тканей активируются процессы неоангиогенеза. Одним из основных условий для нормального протекания ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что
7 преимущественно связывают с действием оксида азота (NO) [8, 20, 177]. Повышение проницаемости сосудов необходимо для выхода белков плазмы крови, что приводит к образованию фибриновой основы для последующей миграции эндотелиоцитов. Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов, источником которых могут быть эндотелиальные клетки, тучные клетки, макрофаги и другие клетки. Под действием ангиогенных факторов происходит активация эндотелиоцитов и миграция их за пределы базальной мембраны с формированием ответвлений основных сосудов [83, 205].
Таким образом, одной из причин нарушения регионарного кровоснабжения является дисфункция эндотелия [25, 57, 82]. Следовательно, дисфункция эндотелия посредством нарушения микроциркуляции может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым ряд остеологических заболеваний, в том числе и остеопороз.
Увеличение частоты остеопороза и его осложнений показывает, что в настоящее время нет надежных методов медикаментозного лечения и профилактики этого заболевания. Современная патогенетическая терапия остеопороза традиционно включает препараты, стимулирующие костеобразование, замедляющие костную резорбцию и препараты многопланового действия [26, 53, 67, 81], но не уделяется никакого внимания препаратам, обладающим положительным влиянием на кровоснабжение костной ткани. Это указывает на актуальность исследования остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эндотелиотропными эффектами.
Номер государственной регистрации темы - 01.2.007 05271.
Цель исследования
Провести оценку остеопротективного действия эналаприла и лозартана и их влияния на процессы репаративной регенерации костной ткани при
8 переломах проксимального метафиза бедренной кости на модели остеопороза, вызванного билатеральной овариэктомией.
Задачи исследования
1. Оценить развитие экспериментального генерализованного
остеопороза при билатеральной овариэктомии в эксперименте с
использованием результатов измерения микроциркуляции в костной ткани,
функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования.
Изучить остеопротективное действие ингибитора АПФ эналаприла на модели билатеральной овариэктомии.
Изучить остеопротективное действие блокатора ATI-рецепторов лозартана на модели билатеральной овариэктомии.
Оценить качество репаративных процессов в костной ткани при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости с использованием результатов измерения микроциркуляции в межотломковой зоне и рентгенологического исследования.
5. Изучить влияние ингибитора АПФ эналаприла на качество
репаративных процессов при экспериментальных остеопоротических
переломах проксимального метафиза бедренной кости.
6. Изучить влияние блокатора ATI-рецепторов лозартана на качество
репаративных процессов при экспериментальных остеопоротических
переломах проксимального метафиза бедренной кости.
Научная новизна
В работе впервые показано, что через восемь недель после билатеральной овариэктомии развивающийся генерализованный остеопороз характеризуется значительным снижением уровня микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости, отрицательной динамикой морфологических показателей, наличием тесной прямой зависимости между величиной кровоснабжения кости и шириной костных трабекул в ней.
Кроме того, обнаруживаются изменения соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) в костной ткани.
Впервые продемонстрировано, что эналаприл и лозартан, вводимые в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно крысам ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель после билатеральной овариэктомии, обладая эндотелиопротективным действием, эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани. Тем самым изучаемые препараты способствовали замедлению истончения костных трабекул в губчатой костной ткани и предотвращению возникновения микропереломов трабекул, то есть обладали остеопротективным действием. Достоверно более выраженным действием обладал лозартан.
Было обнаружено, что консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости через двенадцать недель после билатеральной овариэктомии протекает на фоне снижения кровоснабжения зоны перелома по сравнению с переломами бедра у крыс без остеопороза.
Впервые показано, что эналаприл и лозартан, вводимые в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно крысам ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель после билатеральной овариэктомии и еще в течение четырех недель после моделирования и остеосинтеза перелома, увеличивали показатели микроциркуляции в межотломковой зоне проксимального метафиза бедренной кости выше таковых у крыс с переломами бедра без остеопороза. Достоверно более выраженным воздействием на уровень кровотока в зоне перелома обладал лозартан. Оба исследуемых препарата статистически значимо увеличивали частоту сращения экспериментальных остеопоротических переломов.
В ходе исследования были разработаны вспомогательные лабораторные инструменты, а также рационализированы некоторые манипуляции.
Научная- новизна подтверждается получением двух патентов РФ (патент РФ № 62505 от. 27.04.2007 г. «Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений»; патент РФ № 62512 от 27.04.2007 г. «Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных»); Поданы две заявки на получение патентов РФ (заявка № 2008122134 от 02.06.2008 г. «Способ коррекции; остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов эналаприлом»; заявка № 2008122136і от 02.06.2008 г. «Способ коррекции остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов лозартаном»). Получены два удостоверения на рационализаторские предложения (рационализаторское предложение № 1793-07 от 05.10.2007 г. «Способ' моделирования метафизарных переломов у мелких лабораторных животных»; рационализаторское предложение № 1794-07 от 05:10.2007 г. «Способ остеосинтеза метафизарных переломов у мелких лабораторных животных»).
Практическая значимость
В работе обоснована эффективность применения ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана для коррекции остеопоротических изменений костей скелета, а также для улучшения качества консолидации переломов при генерализованном остеопорозе. В- эксперименте доказано, что использование исследуемых препаратов позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых реакций^ на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить уменьшение кровоснабжения костной- ткани при остеопорозе и остеопоротических переломах, а также добиться замедления отрицательной динамики
морфометрических показателей кости и значительно увеличить количество положительных результатов сращения переломов на фоне остеопороза.
Результаты исследования позволяют рекомендовать проведение целенаправленных клинических испытаний эналаприла и лозартана при системном остеопорозе, а также остеопоротических переломах костей скелета.
Внедрение результатов научного исследования
Материалы диссертационного исследования, касающиеся
остеопротективной активности эналаприла и лозартана, а также положительного влияния указанных препаратов на качество сращения переломов костей скелета при системном остеопорозе, используются в лекционных курсах кафедр фармакологии и травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии КГМУ.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на 72 итоговой межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2007), заседании Курского регионального отделения ассоциации травматологов-ортопедов России (Курск, 2007), VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)» (Ярославль, 2007), конференции «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов» (Курск, 2008), II Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2008), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008).
Апробация диссертации проведена на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, травматологии, ортопедии
12 ' и военно-полевой хирургии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, анатомии, НИИ Экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе две из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Положения, выносимые на защиту
Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, сопровождающееся увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии в кости. Как следствие, значительно ухудшается кровоснабжение костной ткани, что приводит к развитию генерализованного остеопороза, проявляющегося истончением и микропереломами костных трабекул.
Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии имеют выраженное эндотелиопротективное действие, снижая коэффициент эндотелиальной дисфункции до уровня интактных (ложно оперированных) животных; предотвращают снижение уровня микроциркуляции в костной ткани бедра, удерживая его на значениях, не отличающихся от интактных (ложно оперированных) крыс; обладают статистически значимым остеопротективным действием, проявляющимся в замедлении истончения костных трабекул и предотвращении возникновения в них микропереломов. Более выраженными остеопротективными свойствами обладает лозартан.
3. Сращение экспериментальных остеопоротических переломов
проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии Вистар
протекает на фоне снижения значений микроциркуляции в кости по
сравнению с переломами бедра у крыс без остеопороза, что отрицательно
13 сказывается на результатах их консолидации и приводит к увеличению числа неудовлетворительных исходов консолидации - несращению переломов.
4. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг повышают показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до значений, достоверно превышающих таковые у крыс с экспериментальными остеопоротическими переломами, а также увеличивают количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника, из которых 87 отечественных и 146 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 36 рисунков.
Дисфункция эндотелия, принципы ее фармакологической коррекции и основные группы эндотелиопротективных препаратов
При гипоксии или в условиях повреждения тканей активируются процессы роста сосудов. Одним из основных условий для нормального протекания ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что преимущественно связывают с действием оксида азота (N0) [8, 20, 177]. Повышение проницаемости сосудов необходимо для выхода белков плазмы крови, и в первую очередь - фибриногена, что приводит к образованию фибриновой основы для последующей миграции эндотелиоцитов. Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов, источником которых могут быть эндотелиальные клетки, тучные клетки, макрофаги и другие клетки. Под действием ангиогенных факторов происходит активация эндотелиоцитов (преимущественно в посткапиллярных венулах) и миграция их за пределы базальной мембраны с формированием ответвлений основных сосудов [83, 205].
Таким образом, одной из причин нарушения регионарного кровоснабжения и микроциркуляции является дисфункция эндотелия, которая может приводить к спазму сосудов и усиленному тромбообразованию [25, 57, 82]. Следовательно, эндотелиальная дисфункция (ЭД) посредством нарушения микроциркуляции может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарацищ вызывая тем самым ряд остеологических заболеваний, в том числе и остеопороз. Эндотелиальные клетки сосудов, синтезируя локально действующие медиаторы, ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока. N0 в данном случае является ведущим гуморальным эндотелиальным модулятором вазодилатации, вырабатываемым эндотелиоцитами [14, 29, 71, 116, 157]. В норме эндотелий регулирует тонус сосудов посредством высвобождения ряда вазодилатирующих и вазоконстрикторных факторов, модулирует сократительную активность гладкомышечных клеток сосудов, а также регулирует гемостаз и вырабатывает некоторые факторы роста сосудов [9,16,27,164]. Эндотелий секретирует ряд мощных вазоактивных веществ, а именно вазодилататоры (N0, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин) и вазоконстрикторы (АТ-2, эндотелии, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин F2 альфа и тромбоксан А2) [18,45,87]. В широком смысле, ЭД может быть определена как неадекватное (увеличенное или сниженное) образование в эндотелии различных биологически активных веществ. В последнее время сложилось более узкое представление об ЭД как о состоянии эндотелия, при котором имеется недостаточная продукция NO. Поскольку NO принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия, такое представление вполне корректно [40, 82]. N0 вызывает расслабление гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов, влияет на коагуляцию крови, ингибируя агрегацию тромбоцитов и экспрессию молекул адгезии на моноцитах и нейтрофилах, предупреждает структурную перестройку клеток эндотелия, ингибируя рост и миграцию ГМК. N0 присутствует во всех эндотелиоцитах, вне зависимости от локализации, размеров или функции сосудов.
В состоянии покоя эндотелий постоянно секретирует N0; поддерживая нормальный тонус сосудов артериального звена. Такие медиаторы, как брадикинин, ацетилхолин, гистамин, АТФ, АДФ, тромбин и некоторые физические факторы (например, поток крови, пульсовое давление и другие), а также антидиуретический гормон стимулируют секрецию оксида азота [21, 70, 144, 148]. NO является основным стимулятором образования цГМФ. Увеличивая выработку цГМФ, он уменьшает содержание кальция в тромбоцитах и гладких миоцитах. ЦГМФ, активизируя цГМФ-зависимую протеиназу, создает условия для открытия многочисленных калиевых и кальциевых каналов. Открытие этих каналов для калия приводит к расслаблению гладкой мускулатуры сосудов благодаря выходу калия и кальция из мышц при реполяризации (затухание биотока действия). Активирование калиевых и кальциевых каналов, плотность которых на мембранах клеток очень велика, является основным механизмом действия NO [20]. Поэтому конечный эффект N0 — противосвертывающий и вазодилататорный. N0 также
Измерение микроциркуляции в костной ткани и проведение функциональных сосудистых проб
Уровень микроциркуляции оценивали в ткани проксимального метафиза бедренной кости. Для этого после наркотизации (хлоралгидрат 300 мг/кг) и доступа к проксимальному метафизу бедра животное размещали и фиксировали на предложенном нами столике (патент РФ № 62512 от 27.04.2007 г. «Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных»). Столик состоит из столешницы, стойки, держателя с механизмом его перемещения, фиксатора, зажимов и винтов (рис. 2.1). На столешнице неподвижно установлена стойка с резьбовым отверстием. Держатель выполнен Г-образным, состоящим из втулки и примыкающей к ней консольно-расположенной планки. На консоли планки неподвижно размещена втулка, через которую направляется инструмент для сверления или датчик от измерительных приборов, а на наружной поверхности втулки выполнен паз для установки в него фиксатора. Держатель имеет возможность перемещения вдоль оси стойки и вращения вокруг нее. Механизм перемещения выполнен из винта и шайбы. Винт состоит из рукоятки, паза на одном конце и резьбовой части на другом. Резьбовым концом винт соединен подвижно со стойкой. В паз винта входит шайба с открытым пазом. Шайба винтами крепится к держателю. Фиксатор выполнен П-образной формы с фиксирующим зубом, он установлен в пазу столешницы, крепится подвижно винтом и прижат пружиной в направлении, перпендикулярном продольной оси держателя. Для крепления объекта исследования предусмотрены зажимы с винтами, установленные на столешнице. Стол для хирургических манипуляций на мелких животных работает следующим образом: животное размещается на столешнице и закрепляется зажимами (рис. 2.2). Держатель устанавливается над местом исследования или хирургической манипуляции, фиксатор зубом вводится в паз держателя.
Предварительно винтом устанавливается положение хирургического инструмента (сверла) или датчика над конечностью животного в месте исследования. Инструмент направляется через втулку, ему придается вращательное движение от дрели, а вращением винта по часовой стрелке осуществляется подача инструмента до окончания сверления на требуемую глубину. После засверливания отверстия глубиной 2,5-3 мм в проксимальном метафизе бедра в него с целью стабилизации датчика, используемого для измерения микроциркуляции в кости, вводили предложенный нами стержень-кондуктор (патент РФ № 62505 от 27.04.2007 г. «Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений»). Стержень-кондуктор выполнен ступенчатым и состоит из рабочей, направляющей и хвостовой частей (рис. 2.3). Через стержень-кондуктор проходит сквозной канал. На конце хвостового отдела выполнен открытый паз, расположенный перпендикулярно продольной оси стержня. На конце рабочей части по торцу выполнены режущие зубья. Диаметр рабочей части равен 2 мм, диаметр канала, проходящего через рабочую часть стержня-кондуктора - 1 мм. Количество зубьев - 6, их высота и другие элементы избраны конструктивно, исходя из диаметра рабочей части стержня.
Для получения данных о состоянии микроциркуляции в кости использовали оборудование производства компании Biopac systems: полиграф MP 100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным игольчатым датчиком TSD144, который через канал стержня-кондуктора вводился непосредственно в ткань проксимального метафиза бедренной кости. После измерения внутрикостного уровня микроциркуляции, не изменяя положения датчика, проводили пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг [161] и эндотелийнезависимую вазодилатацию -(ЭКЗД)»в ответ на болюсное: внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в;дозе-30 мкг/кг fl4]:. Регистрация и обработка результатов ЛДФ производилась, с помощью программы, AcqKnowledge версии: 3.8vl ;5 значения? микроциркуляции выражались.вшерфузионных единицах (ЗД5).
Изучение остеопротективного действия ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана при экспериментальном генерализованном остеопорозе
Согласно дизайну эксперимента, генерализованный остеопороз моделировали путем проведения у половозрелых самок крыс линии Вистар билатеральной овариэктомии. Исследуемые препараты (эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг) на киселе из 1% крахмального раствора вводили с помощью зонда внутрижелудочно ежедневно однократно в сутки в течение 56 дней. На 57 сутки животных брали в эксперимент. Результаты влияния эналаприла и лозартана на средний уровень микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс через восемь недель после овариэктомии изображены на рисунке 3.17. Было обнаружено, что эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг эффективно предотвращали снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани бедра, сохраняя значения микроциркуляции на уровне интактных (Л-О) крыс. Результаты ЛДФ в группах крыс, получавших эналаприл и лозартан, достоверно не отличались от таковых в группе интактных (Л-О) животных (р=0,252 и р=0,926 соответственно) и не различались между собой (р=0Д81), а также достоверно отличались от показателей в группе крыс с остеопорозом (рис. 3.17). На рисунках 3.18, 3.19, 3.20, 3.21, 3.22 и в таблице 3.4 представлены результаты проведения функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с экспериментальным генерализованным остеопорозом на фоне лечения в течение восьми недель эналаприлом 0,5 мг/кг и лозартаном 6 мг/кг с последующим расчетом коэффициента эндотелиальной дисфункции по данным ЛДФ.
Было выявлено, что эналаприл и лозартан приводили пропорции между площадями треугольников над кривыми восстановления уровня микроциркуляции в кости в ответ на введение нитропруссида и ацетилхолина к таковым у интактных (Л-О) животных (рис. 3.18, 3.19, 3.20, 3.21). Тем самым изучаемые препараты достоверно снижали КЭД до значений 1,6±0,1 и 1,5±0,2 соответственно, тогда как в группе контрольных животных он составлял 2,4±0,2 (рис. 3.22). Как и в случае измерения уровня микроциркуляции в костной ткани, значения КЭД у крыс, получавших эналаприл и лозартан, достоверно не отличались от таковых в группе интактных (Л-О) животных (р=0,238 и р=0,384 соответственно) и не различались между собой (р=0,871). Рис. 3.18. Кривая восстановления микроциркуляции при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию у животных с остеопорозом, получавших в течение восьми недель после овариэктомии эналаприл 0,5 мг/кг. Рис. 3.20. Кривая восстановления микроциркуляции при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию у животных с остеопорозом, получавших в течение восьми недель после овариэктомии лозартан 6 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют об эффективном, достоверном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного на основании ЛДФ, под влиянием эналаприла и лозартана у животных с моделированием экспериментального генерализованного остеопороза. Это позволяет нам заключить, что значительную роль в поддержании адекватного кровоснабжения костной ткани играет сохранение функции эндотелия сосудов, питающих кость. В свою очередь, сохранение уровня микроциркуляции в кости на значениях, близких к значениям у интактных (Л-О) животных, способствует поддержанию нормального протекания процессов костного ремоделирования и препятствует развитию остеопороза. Данное положение подтверждается результатами гистоморфометрического исследования костей скелета у крыс, получавших в течение восьми недель после овариэктомии эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг. При световой микроскопии срезов костей скелета у крыс, получавших лечение, обнаружили отсутствие микропереломов трабекул, сохранение структуры костной ткани и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом, не получавших лечения, во всех исследуемых локализациях. Результаты гистоморфометрии губчатой костной ткани в группах крыс с экспериментальным остеопорозом на фоне лечения эналаприлом и лозартаном представлены на рисунках 3.23, 3.24 и. 3.25. Выявили, что эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг препятствовали снижению средней ширины костной трабекулы до уровня животных с экспериментальным остеопорозом в исследуемых локализациях, однако средняя ширина трабекул не достигала значения интактных (Л-О) крыс.
Так, например, средняя ширина костной трабекулы в проксимальном метафизе бедра под влиянием эналаприла была на 22,7%, а под воздействием лозартана - на 37,4% больше, чем у животных с генерализованным остеопорозом. В проксимальном метафизе плечевой кости средняя ширина костной трабекулы у крыс, получавших в течение восьми недель после овариэктомии эналаприл, оказалась больше на 22,9%, чем у животных с остеопорозом, а у крыс, получавших лозартан, - на 38,7%). Влияние эналаприла и лозартана на среднюю ширину костной трабекулы в поясничных позвонках заключалось в увеличении последней под влиянием препаратов на 42,9% и 61,5% соответственно по сравнению с крысами, не получавшими лечения. Кроме того, значения средней ширины костных трабекул в проксимальных метафизах бедренной и плечевой костей и телах поясничных позвонков у крыс, получавших исследуемые препараты, достоверно отличались от значений как животных с остеопорозом, так и интактных (Л-О) крыс, а также достоверно отличались друг от друга во всех локализациях (р 0,05). Таким образом, эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии у крыс обладали выраженным остеопротективным действием, заключающимся в предотвращении истончения костных трабекул и, таким образом, хотя и не предотвращали полностью, замедляли развитие генерализованного остеопороза. Достоверно более выраженным остеопротективным действием обладал лозартан 6 мг/кг. В группах крыс, получавших исследуемые препараты, нами также было выявлено и подтверждено наличие прямой зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра и средней шириной костной трабекулы в данной зоне. Коэффициент корреляции Пирсона (г) между указанными параметрами у крыс, получавших эналаприл, составил 0,4, у получавших лозартан - 0,8. Зависимость между обозначенными показателями в обеих группах животных, получавших лечение, отражена на рисунках 3.26 и 3.27.
Изучение влияния ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов
В соответствии с протоколом исследования, остеопоротические переломы моделировали через восемь недель после билатеральной овариэктомии, так как за это время формировались генерализованные остеопоротические изменения костей скелета. На 57 сутки у животных производили моделирование и остеосинтез переломов проксимального метафиза правой бедренной кости, после чего животных содержали в виварии еще четыре недели. Все это время (12 недель) крысам ежедневно внутрижелудочно вводили в качестве плацебо кисель из 1% раствора крахмала. На 29 день после остеосинтеза переломов у крыс измеряли уровень микроциркуляции в межотломковой зоне в случае сращения перелома, а также макроскопически и рентгенологически оценивали качество консолидации переломов. Результаты лазерной допплеровской флоуметрии в группах крыс с экспериментальными переломами показали, что при сращении переломов на фоне генерализованного остеопороза средний уровень микроциркуляции в межотломковой зоне был достоверно ниже, чем у крыс без остеопороза (рис. 3.28). Это соответствует данным, полученным при проведении ЛДФ у крыс без переломов (рис. 3.1). Следовательно, консолидация остеопоротических переломов протекает на фоне сниженного уровня кровотока в зоне перелома, что может негативно отразиться на результатах сращения остеопоротических переломов. При макроскопической оценке зоны перелома проксимального метафиза бедра у крыс выявили, что у большинства животных в обеих группах через четыре недели после перелома и остеосинтеза отмечались признаки формирования костной мозоли.
Однако, наблюдались случаи неудовлетворительных результатов консолидации переломов. В группе крыс с переломами бедра без остеопороза в четырех случаях из 20 наблюдалось несращение перелома и развитие тугого ложного сустава (рис. 3.29). Ложные суставы развивались у крыс, диаметр просвета костномозгового канала бедра у которых незначительно превышал диаметр спицы, фиксирующей перелом, то есть 1 мм. Это допускало наличие подвижности спицы по оси бедренной кости и, соответственно, костных отломков относительно друг друга, что и явилось причиной несращения переломов у данных крыс. Тем не менее, опороспособность правой нижней конечности у всех этих животных была сохранена в полном объеме. В группе крыс с остеопоротическими переломами бедра число неудовлетворительных результатов было вдвое больше (восемь против четырех из 20) (рис. 3.29). У этих животных отмечалась значительная подвижность интрамедуллярно введенной спицы и отсутствие консолидации перелома: спица свободно перемещалась по костномозговому каналу 4; 20% бедренной кости, приводя к нестабильности в зоне перелома. Прижизненно у половины (четырех) крыс это проявлялось в нарушении опороспособности конечности. Подобное явление можно объяснить тем, что, наряду с генерализованным остеопорозом в результате билатеральной овариэктомии, на «качество» бедренной кости также влиял металлический имплантат, увеличивая скорость развития и степень выраженности остеопороза в непосредственной близости от места введения спицы. Рентгенологическое исследование бедренных костей с экспериментальными переломами у крыс обеих групп проводилось после макроскопического исследования. При изучении рентгенограмм оценивали качественные и количественные критерии консолидации переломов. Во всех случаях удовлетворительных результатов консолидации переломов отмечали рентгенологические признаки сращения - отсутствие диастаза между костными отломками, сохранение оси бедренной кости, формирование костной мозоли.
При несращении переломов у крыс с остеопорозом на рентгенограммах бедренных костей наблюдали деформацию сегмента конечности, угловые и ротационные смещения отломков относительно друг друга, наличие диастаза между костными отломками, отсутствие признаков формирования костной мозоли (рис. 3.30). У животных без остеопороза с несросшимися переломами при рентгенологическом исследовании также обнаружили незначительный диастаз между костными отломками, отсутствие формирования костной мозоли, однако ось бедренной кости была сохранена и ротационные смещения отломков отсутствовали. Количественные характеристики качества консолидации экспериментальных переломов по данным рентгенографии совпадали с таковыми при макроскопической оценке в обеих группах. Таким образом, заживление экспериментальных остеопоротических переломов ввиду
