Введение к работе
Актуальность проблоші.
Проблема разработки методов коррекции гипоксических состоя-
рпзвквающихсл после воздействия на организм различных экстре-гпых факторов и являшихся общим звеном патогене з многочислен-
заболевагаий сердечно-сосудистой, дыхательной, выделительной, іной и других систем организма, а также факторами профэссиона-ій вредности, занимает в медико-биологической науке особое ме-
В результате исследований, проведенных в течение последних 5 лет, бала выработана тактика профилактики и коррекции данных ояний, зклотагаая применение фармакологических препаратов, из-ітально зазощалщпс организм от действия повреждающего фактора игипсксантов), немедикаментозных методов воздействия юкамерных и высокогорных тренировок, воздействия нормобаричес-пшоксии), покупающих неспвцифическую резистентность организ-
а также проведение симптоматической терапии. В ряде работ тшн И.В. и др., 1984, Столярова Л.Г. и др., 1986, Бобков Ю.Г., ;ова И.Л., 1937, Билонко М.В., 1989) показан положительный эф- при использовании препаратов, обладающих антиокислительной вность»; причем практикуется песколько режимов их применения: юфилактичаской целью - непосредственно перед действием екстреного фактора, как средство фармакокорракцш ухе развившхся 'логически состояний, в патогенезе которых ведущую роль играет лоция процессов свободнорадикального окисления (СРО), а также пістве адаптогенов - при курсовом введении. Однако внедрение оксидаатсв е клиническую практшеу ограничивается существова-I ряда вырагинянх побочных эффектов, обусловленных правде всего ходимостью их применения в достаточно больших дозах (дэсяткп-и мг/кг), зачастую близких к токсическим. В связи о этим уси-псследоватолай направлены на разработку новых фармакологичес-препаратов, обладающих достаточной широтой терапевтического твия. На основании данных, полученных в пооледпеэ время рядом ров (Смирнов Л.Л., Дюмаев К.М., 1989, Bulkley Ы.Н.- Т. et.al., ), mosho предположить, что перспективным должно быть исполъао-о аятиокевдантов из группы р-оксипириданов (амоксипин, мекси-
и пространственно затрудненных фенолов (фэноксан, пробукод).
Другой щ-ть целенаправленной фар<шкокоррвкцип заклшавтея в
индивидуализаи,-і регммов терапевтического воздействия, поиске і Фэктивных и надежных экспресс-мотодов оцэики характера алия указанных средств на организм пациента (т.е., применительно к : ставленной задаче - в разработке физиологичных и надежных мето, динамической оценки состояния организма, его антиоксидантного с туса и устойчивости к гипоксии непосредственно в ходе курса фа макологического воздействия). Больпшнство существующие в настоя
ВрвМЯ ЭКСПерИМеНТаЛЬНЫХ МеТОДОВ ПО ПОЛОМУ РЯДУ ПрИЧИН (ВСЛЗДСТЕ
относительно невысокой чуЕствительностт'. необходимости забора м роколичеств биологического материала для проведения анализа, н кой физпологичности) не могут быть применены при решении данной проблемы.
По нашему мнения перспективным является использование хеми минесцентного метода, т.к. он даэт возможность прямого и достов ного определения концентрации свободных радикалов в изучаемом о екте. Известна взаимосвязь между показателями хемшиминесцеь (ХЛ) с одной стороны и содержанием антиоксидантов в биологсчас проб", а такяэ глубиной развития тканевого гипоксического повр дения - с другой. Таким образом, данный метод ыожет быть прше для оценки антиоксидантного чтатуса организма при гипоксии, а т же с целью определения эффективности использования фармакологач ких препаратов, обладаниях антиокислительной активностью в качо ве антигштоксантов. Однако необходимым условием является перехс анализу параметров ХЛ в образцах, содержащих микроколичества с логического материала, что требует проведения ряда продварителі иесследований.
На основании излозиенного выше были определены цель а зад проведенного нами исследования.
Целью данной работы явился поиск путей повышения вффоктш ста использования антиоксидантов для фарыакокоррокцид гяпоксіг-ких состояний организма.
В связи о етим были поставлены следующие задачи:
І.'Разработать чувствительный акешрэос-штод оценки антиоз дадтного отатуов организма при действии екстремальних факторе антиоксидантов.
2. Изучьгь зависимость кввду антиоксидантним статусом oprj
* и его устойчивостью, к гипоксии.
3. Провеет;! сравнительную сиэнку антиокяслителыюй активности'
шх антиоксидантних препаратов: мексидола и пробукола в условиях
vitro.
-
Изучить антиокислитальное действие ме'ксидолв. и пробукола в 19ft популяции' гзшотных и в группах с различным антиоксидантним зтусом.
-
Провести сравнительный анализ действия мексидола и прсОу-ча на показателя свободнорадикального окисления крови при острой тобарической гипоксии.
Научная новизна работа.
В данной работа Епэрвыэ Сил использован микроматод хемилгми-:ц8ятного анализа, который позволил проводить динамическую оцен-ангиоксидантного статуса организма многократно в ходе фзрнако-ричоского эксперимента. Получены результаты, свидетольствушкэ о цестЕовании взаимосвязи между уровнем ХЛ плазмы крови и устойчи-:тьв организма к гипоксии. Выявлены оптимальные дозы антиокси-ганше препаратов мексидола и пробукола, приводяине к внрааепноку тибировашш процессов СРО. При сравнительном изучении их антиок-іантного действия в обвей популяции животных и в группах с раз-t устойчивостью к гипоксия показано, что положительный вффект от гонения указанных препаратов проявляется, главным образом, в ,-nno жпвотких с низкой устойчивостью к кислородной нэдостаточно-I. Показано, что введение антиокепдантов сопровокдпется перз-юикей работы эндогенной системы штиокислительноЯ защитыj что содит свое Еырсгопие в изменении нэкоторнх показателей, харйкте-зупцих уровень СРО крови (активности каталаза, содержания гоксфэрола, коіш/штрьцин ТБК-активпых продуктов).
Практическая ценность.
Разработан экспрэсс-мотод оценки антиоксидантного статусе ор-шама и определения эффективности действия антиокекдантоя in іго, что имеет практическое значоние при ревении задачи оптимиста режимов применения фармакологических препаратов^ обладашосс гискислительпой активностью. Олредолены оптикальннэ рвяимн планенпя мексидола и пробуїсола в качестве антигипоксантов. сазано, что целесообразным является ах однократное введение зк-фиментальннм злівотішм с исходно низкой устойчивостью к кисло-
родкой недостаточности в дозах 10-50 мг/кг.
Апробация работы.
Основные результаты работы дслокены и обсуздены на Всесоюз конференциях:. "Оценка фармакологической активности химических единений: принципы и подхода" (Купаша, 1939) и "Фармакологичес коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), на учредите ном Международном патофизиологическом съезде (Москва, 1991), заседании Московского" общества фармакологов (1992), п также ка учных конференциях кафедры молекулярно* фармакологии и радиобис гии РГМУ.
Публикации. По материалам диссертации опубліжовано 7 печ ных работ.
Объем и структура дассертации.
Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текст состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и тодов исследования, результатов исследования и их обсуждения, водов и библиографического указателя, включающего 173 неточна Иллюстративный материал представлен 10 рисунками и 18 таблицами
В работе была использована плазма крови белых беспород крыс-самцов (400 кивотных). Пробы получали путем забора крон гепаринизировакные капилляры в количестве 0,02 мл из хвостовой ны последущого ее разведения в 1,0 мл фосфатного буфера, цент фугирования при 3000 об/мин. в течение 10 мин. и отбора супер танта. Полученные образцы исследовались тотчас »е после забоя вотных, либо хранились в кидком азоте не более 2 суток.
В данной работе был разработан и в дальнейшей неполное микрометод хемилюминесцентного анализа. Целесообразность его пользования определялась необходимостью проведения динамичест анализа параметров, характеризующих уровень СТО при работе о >. кими экспериментальными животными. Исследования проводили еле; щим образом. Регистрировали кинетику "быстрой вспыи Ре -кндуцирсванной хемилшинесг нщш образцов, содержащих шш количества плазмы крош. При проведении вкспериментов In vltr кювету хемилвмивдметра последовательно вносили 3.0 мл фосфата буфера, содержащего исследуемые соединения в концентрациях б»1С 10- и 1,0 ь.. 2.7 Mil раствора воєнна (его концентрация была пс
зна экспериментально путем определения минимального количества, зспечиващего предельный показатель интенсивности "быстрой вспн-t" ХЛ). После 2-минутной инкубации при постоянном перемешивании темной камере в систему добавляли 1,0 мл 33,5 мМ раствора Peso. эогистрировали свечение в течение 20-30 секунд.
При исследовании антиоксидантних свойств препаратов в экспе-лантах In vivo хемилюмикесцентньй анализ биологических проб про-хился аналогичным образом с той лишь разницей, что изначально в звту хемилнспгамэтра вносили 3,0 мл фосфатного буфера, 4 шел ззкы крови и 1,0 мл 2,7 мМ раствора эозина. Затем расчитывали эдущие параметры ХЛ: интенсивность "быстрой вспышки" (І^ в, в і.од.), период ее полузатухания (*w2* в сек-) к максимальную зрость ингибирования tvmax, в усл.ед.) (см.рис.1). Затем регит тировали свечение контрольных проб, пе содержащих антиоксидан-з. Конечные результаты представляли в виде:
z0.B.ioa^ t1/2(on) ^(оп.)
іб.В. "1/2 ' vmaz ~
Хб.В.(К.) tl/2(K') \лх{К'^
Все Ентиоксидактные препараты, использованные в эксперимэн-
п>ных исследованиях, подвергали предварительному тестировании на
шчио антіюкислительной активности (АОА) в модельной системе
>гослойных липосом из липопротеидов желтка куриных яиц с помощью
годики, опи'їнкой ранее (Лопухин Ю.Ы. и др.,1983).
Для оценки чувствительности вновь предлагаемого метода на
звом этапе исследования регистрация кинетики "быстрой вспышки*'
+-индуцироваивоЯ ХЛ проводилась в ходе воздействия на организм
зличных экстремальных факторов, повышающих интенсивность ПОЛ
:трая гипобарическая гипоксия, частичная ишемия головного мозга,
шическая ингаляция табачным дымом) (Меерсон Ф.З., 1983, Билешю
)...1339, Prootor Р.Н., Reynolds E.S.,1934, Mo Cord J.M., 4988), a
И9 При В03Д6ЙСТВИЯХ, ПРИВОДЯЩИХ К СЕИ2ЄНИЛ ЕП'ГЄНСИВЕОСТЛ CBO-
даорадикальных решеций (введении экзогенного антиоксиданте гаксфзрола и воздействии умеренной нормобарической гипоксии) ин А.Н., 1987, Стрелков Р.Б. и др., 1987, Меерсон Э.З. и др., 19).
Оструи гипобярнчэекую гипоксию (ОГБГ) моделировали в юкамера путем подъема животных "высоту" 9000 м со скоростью 33 !. Частичная ишемия головного мозга создавалась под эфирным нар-
1,0-
0,5-.
0 Рис.1
Регистрируемые параметри "быстрой вспышки"
1,вг+-индуцировонной хемилюминесценции плазмы крови.
По оси абсцисс - t - время, в сек.
По оси ординат - I - интенсивность свечения, в уод.е,
I- в - интенсивность "быстрой вспышки" ХЯ,
t *"- период полузатухания "быстрой вспышки",
v - максимальная скорость ингибирования "быстр
max. вспышки"
ізом путем перевязка аа. carotec оовяипіоапв. Динамика процессов гайового поврекдвдля прослеживалась в течение ЗЄО минут с парал-ільгохм забором проб для проведения хэмилшинэсцентного анализа на й, і5-й, 30-й, 60-й, 180 и 360-а минутах после ьачала зкспари-иіта. Ингаляция крыс дымом сигарет "Столичные" фабрики "Ява про-'дилась в вакуумних каморах при соотношении воздух:дым » 1:4 на ютяжвшіа 3 месяцев 5 дней в нэдэлго с двухдневным перерывом іог.ш ежедневного воздействия - две сигареты,' "накуриваемые" с [тсрзалом 40 минут).
Нормсбзричсскув гипоксии моделировали путем экспозиции кивот-ос в среде, содержащей 10,0+1,0 кислорода и 90,0+1,0 азота ТС-10), которую получали путем смешивания Еоздуха и газообразно-1 ) азота в строго подобранном соотношении в изолированной от внеш-ifl среды камеро. Концентрашія кислорода в камере контролировалась помощью газового монитора "Datsx" (Финляндия). Масляный раствор токоферола ацетата вводился внутримышечно однократно в дозах 10, ) и 100 мг/кг. Контрольная группа животных получала мзеляпув оо-іву препарата; зффэкт оценивался через 24 часа.
В экспериментах in vivo исследовались антиоксидантше в аити-шсксичэскпе сбойстбв двух фармакологических препаратов: ыаксидо-) и щюОукола.
Жирорастворимый препарат пробуїсол еводдлся ЕиутрпОрлпиняо в істворо димотилсульфоксида (ДМСО) в дозах 10, 50„ .100 и 200 '/кг. ЗЯфект оценивался через 24 часа. Водный раствор ыекелдола годился внутряоркхпппно в дозах 10,50, 100 и 200 мт/кт. Эффект 19ШШОЛСЯ через 4 часа. Контрольные группы аизотных получали эк-пзаленткоо количество даСО и физиологического раствора. При кур-гасм введении тавотные получали оятиоксидаптпыв препарата: кокси-)л и пробукол в течение 5 дней (разовая ежедневная доза составля-
! 50 1.ЇГ/КГ).
Индивидуальная устойчивость к кислородной недостаточности іучелась на модели (ОГБГ) путем определения резервного времени ізпл 2ШВ0ТПЫХ на "высоте" И000 м. Подъем осуществлялся со сред->Я скоростью 33 и/с. Момент гибели тавотных регистрировался по :тановкэ дыхания.
Антиоксидентпнй статус организма п аитшкислитзльвув актив-)сть фармакологических препаратов оценивали с помощью: разрвбо-umoro в данной работе микремотода хемилюминесцентного анализа, а
таюке определения активности каталазы, регистрации содержания а-токсферола и концентрации ТБК-активных продуктов.
Активность каталазы в крови определяли перманганатометрич заїм методом .(Бах А.Н., Зубкова G.3., 1963). Принцип методики, пользованной для определения содержания а-токоферола в плазме к ви состоял в измерении флуоресценции данного соединения, экстра рованного из плазмы крови гексаном (Черняускеке Р.Ч. и др., 193 Содержание ТБК-активных продуктов определяли спектрофотометричэ в двухволновсм режиме: А.,-- 522 нм, Ag - 530 нм. с помощью метод (Aeakawa Т. et.al, 1930).
В работе били использованы стандартные методы статистическ анализа. Достоверность различий.между экспериментальными групп да изучаемым шрамах^. їм оценивалась с помощью параметричэск т-критерия Стьюдента и нопараметрического и-криторпя Вилкоксо Манна-Уитни.
