Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
. 1. Тревога и ее нейрохимические механизмы. 11
.1.1. Феномен тревоги. 11
.1.2. Нейроанатом ия тревоги. 14
.1.3. Нейрохимия тревоги. 16
.1.3.1. Основные нейрохимические системы в регуляции тревоги. 17
.1.3.1.1. Серотониновая система. 17
.1.3.1.2. Норадренергическая система. 21
.1.3.1.3. Холинергическая система. 23
. 1.3.1.4. Дофаминовая сие гема. 24
.1.3.1.5. Гистаминовая система. 27
.1.3.1.6. Пуринергическая система. 29
.1.3.1.7. ГАМК-ергическая система. 30
.1.3.1.8. Глутаматергическая система 32
.1.3.2. Нейропептиды в регуляции тревоги. 35
.1.3.2.1. Эндозепины. 35
.1.3.2.2. Кортиколиберин. 36
.1.3.2.3. Тахикинины. 38
.1.3.2.4. Нейротензин. 40
.1.3.2.5. Холецистокинин. 41
.1.3.2.6. Нейропептид Y. 46
.1.3.2.7. Галанин. 48
.1.3.2.8. Вазопрессин. 50
.1.3.2.9. Окситоцин. 52
.1.3.2.10. а-Меланокортин и меланин-концентрирующий пептид. 53
.1.3.2.11. Пролактин. 54
.1.3.2.12. Тиролиберин. 55
.1.3.2.13. Стимуляторы гормона роста и соматостатин. 55
.1.3.2.14. Ангиотензин. 56
.1.3.2.15. Пептиды сна и бодрствования. 58
.1.3.2.16. Семейство глюкагон-сскретинов. 59
.1.3.2.17. Семейство бомбезинов. 60
.2. Эндогенная опиоидная система 63
.2.1 .Опиоидные рецепторы (ОР). 64
.2.1.1. Структура ОР. 64
-
Внутриклеточная передача сигнала. 77
-
Десенситизация ОР. 80
-
Функции ОР. 81 1.2.2.Опиоидные пептиды. 84 1.2.3. Энкефалиндеградирующие ферменты (ЭДФ). 87
-
Классификация и локализация ЭДФ. 87
-
Субстратная специфичность эикефалиназ. 89
-
Ингибиторы ЭДФ. 91 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
-
Характеристика обследованных больных. 94
-
Психологическое тестирование. 95
-
Оценка уровня личностной (врожденной) тревожности 96
-
Тестирование вегетативной дисфункции. 96
-
Сила и интенсивность панических атак 97
-
Используемые животные. 97
-
Тестирование спонтанной двигательной активности животных. 97
-
Обучение и тестирование крыс в «челночной камере». 98
-
Тестирование животных в «открытом поле». 99
-
Тестирование животных в «приподнятом крестообразном лабиринте» (ПКЛ). 99
-
Определение пролиферативной активности лимфоцитов крови крыс. 100
-
Получение мембранной фракции головного мозга крыс. 101
-
Экстракция эндогенных лигандов ОР из плазмы крови и гиппокампа крыс. 102
-
Радиорсцепторный аналіз. 102
-
Определение активности ЭДФ. 103
-
Выбор кинетических параметров реакции. 103
-
Получение плазмы и сыворотки крови. 104
-
Постановка ферментативной реакции. 105
-
ТСХ продуктов ферментативного гидролиза Н-лей-энкефалина. 105
-
ВЭЖХ продуктов гидролиза [G Н]-лей-энкефалина и [G Н]-селанка. 106
-
Определение количества белка. 109
-
Определение общего кортизола в сыворотке крови. 109
-
Статистический анализ данных. 109
-
Материалы. 110 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Влияние препаратов, воздействующих на опиоидную систему, на
поведенческие проявления тревожности животных. 1 1 1
3.1.1. Влияние даларгина на поведение крыс в конфликтном тесте Вогеля. 111
-
Влияние даларгина на стратегию поведения крыс в «челночной камере». 113
-
Влияние пептидных лигандов ОР на поведение крыс в тесте ПКЛ 116
3.1.3.1. Опиоидзависимый анксиолитический эффект периферического
введения даларгина на крыс в ПКЛ. 116
3.1.3.2. Влияние центрального введения даларгина на поведение крыс в ПКЛ. 118
3.1.4. Блокируемый налоксоном анксиолитический эффект селаика на мышей Balb/c. 121
-
Влияние селаика и налоксона на поведение мышей в открытых рукавах ПКЛ. 122
-
Влияние селаика и налоксона на поведение мышей в центральном
квадрате ПКЛ. 124
3.2. Воздействие на ЭОС как способ коррекции соматических проявлений тревоги. 128
3.2.1. Влияние селанка на частоту сердечных сокращений мышей в условиях
процедурного стресса, сопровождающегося повышением тревожности. 128
3.2.2. Иммуномодулирующий эффект даларгина на крыс. 130
3.3. Опиоидная система головного мозга животных с различными
проявлениями тревожности. 133
3.3.1. Радиорецепторное исследование ОР мозга крыс с различными
поведенческими характеристиками. 133
-
Взаимосвязь констант связывания ЛЛ-ДАДЛЭ с центральными ОР и спонтанной двигательной активности крыс. 135
-
Взаимосвязь констант связывания ~Н-ДАДЛЭ с центральными ОР и двигательной активности крыс в «открытом поле». 138
-
Константы связывания ' Н-ДАДЛЭ с центральными ОР у крыс
с различным уровнем тревожности в тесте ПКЛ. 141
3.3.2. Вытесняющая активность эндогенных лигандов ОР в гиппокампе крыс
с различной стратегией поведения в «челночной камере». 144
3.3.3. Активность ЭДФ мозга мышей линии Balb/c и С57В1аск/6. 147
3.4. Периферический отдел опиоидной системы у животных с различными
проявлениями тревожности. 150
3.4.1. Активность эндогенных лигандов опиоидных рецепторов плазмы
крови крыс с различной двигательной активностью. 150
3.4.2. Скорость гидролиза лей-энкефалина ферментами плазмы крови
мышей Balb/c и С57В1аск/6. 152
3.5. Ферменты деградации лей-энкефалина в плазме крови человека. Взаимосвязь с
конституционально-личностными характеристиками и развитием тревожных расстройств.
3.5.1. Определение активности индивидуальных ферментов гидролиза
лей-энкефалина в плазме крови человека. 154
3.5.2. Определение суммарной активности ЭДФ. 157
3.5.2.1. Кинетика ферментативного гидролиза лей-энкефакина плазме крови человека. 158
3.5.3. Взаимосвязь активности ЭДФ плазмы крови с конституционально-
личностными характеристиками человека. 161
3.5.3.1 Активность ЭДФ плазмы крови людей с различным уровнем
личностной тревожности. 161
3.5.3.2 Активность ЭДФ плазмы крови у людей с различным типом темперамента. 162
3.5.4. Активность ЭДФ плазмы крови больных с различными формами
тревожных расстройств. 164
-
Параметры активности ЭДФ плазмы крови больных генерализованным тревожным расстройством, паническим расстройством и агорафобией. 164
-
Время полупревращения лей-энкефалина в плазме крови больных генерализованным тревожным расстройством и неврастенией (по МКБ-10). 167
3. 6. Влияние селанка на опиоидную систему. 1 70
-
Радиорецепторное исследование взаимодействия селанка с ОР. 170
-
Влияние селанка и его фрагментов на активность ЭДФ in vitro. 172
-
Влияние селанка на суммарную активность ЭДФ сыворотки крови человека. 172
-
Сравнительный анализ ингибирующего действия селанка и его
пептидных фрагментов на активность ЭДФ сыворотки крови человека. 174
3.6.2.3. Влияние селанка на активность различных групп ЭДФ плазмы крови человека. 175
-
Анализ биодеградации селанка в плазме крови. 175
-
Влияние селанка на ЭДФ мозга крысы. 179 3.6.4.1.Подбор условий определения активности ЭДФ мозга крысы. 179 3.6.4.2. Влияние селанка на активность ЭДФ мозга крысы. 180
-
Влияние селанка на активность ЭДФ плазмы крови и гомогената мозга
мышей Balb/c и C57/Black6 in vivo. 183
3.7. Влияние селанка на ЭДФ плазмы крови больных тревожными расстройствами. 186
3.7.1. Влияние селанка на ЭДФ плазмы крови больных с
тревожно-депрессивными расстройствами. 186
3.7.2. Влияние терапии селанкаом на х 1/2 лей-энкефалина в плазме крови
больных Г'ГР и неврастенией. 189
-
Клинико-фармакологическая характеристика действия селанка. 189
-
Клинико-биологическое исследование действия селанка. 192
-
Взаимосвязь клинико-биологических параметров с темпераментом больных. 197
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 200
ВЫВОДЫ 231
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 233
Введение к работе
Тревога - проявление эволюционно выработанного механизма адаптации, предназначенного для мобилизации ресурсов организма в изменившихся условиях существования. Как пониженный, так и повышенный уровень тревожности снижает вероятность выживания особи в природе, снижает качество жизни человека. При этом повышенный уровень тревоги, тревожные расстройства, наряду с депрессиями, являются одними из наиболее распространенных в клинике психических заболеваний.
Нейрохимические механизмы регуляции тревожности, патогенез тревожных расстройств исключительно гетерогенны. В фармакотерапии тревожных расстройств чаще всего используются препараты, модулирующие состояние ГАМК-бензодиазепиновой и серотониновой систем. Вместе с тем, доказано, что в регуляции тревожности принимают участие также норадренергическая, ацетилхолиновая, дофаминовая и глутаматергическая системы (Belzung С, Le Раре G.. 1994. Tanaka М. et al.. 2000, Yoo J.H. et al., 2004, Salgado-Pineda P. et al., 2005, Alt A. et al., 2006).
В последние годы неудержимо растет количество сообщений о. роли регуляторных пептидов как в реализации проявлений тревоги, так и в подавлении их. Суммируя литературные данные, к «протревожным» можно отнести около двух десятков нейропептидов, включая эндозепины, кортиколиберин, холецистокинин, нейротензин, вазопрессин, ангиотензин и другие. Как выяснилось уже после внедрения в клиническую практику бензодиазепинов, эти препараты блокируют связывание «протревожных» эндогенных пептидов эндозепинов с рецепторами (Ашмарин И.П. и соавт., 1999). Антагонисты кортиколибериновых рецепторов прошли клинические испытания, проявив безопасность и эффективность в редукции симптомов тревоги и депрессии (Jetty P.V. et al., 2001, Kehne J, De Lombaert S„ 2002, Holmes A. et al., 2003). Обсуждается перспективность использования антагонистов рецепторов к холецистокинину (Колик Л.Г. и соавт.. 2005, Hebb A.L.O. et al., 2005, Harro J., 2006), вазопрессину (Keck M.E., 2006), меланокортину (Smith D.G. et al., 2006) и нейрокининам (Herpfer I., Lieb K., 2005) в качестве анксиолитиков. Предполагается, что препараты, подавляющие синтез ангиотензина II и/или блокирующие его рецепторы, могут быть эффективны при сочетании гипертензии с тревожными, депрессивными и когнитивными расстройствами (Gard P.R., 2004).
К группе пептидов, выполняющих «противотревожные» функции в ЦНС относятся нейропептид Y, галанин, пролактин, окситоцин, соматостатин, обестатин, нейропептид S и ряд других регуляторных пептидов. В настоящее время аналоги нейропептида Y или антагонисты его ауторецепторов (Heilig М. 2004), нейропептид S (Xu Y.L. et al., 2005) и компоненты галаниновой системы (Barrera G. et al., 2005, Wrenn CC, Holmes A., 2006) рассматриваются в качестве перспективных объектов для создания антидепрессантов и анксиолитических препаратов. Использование лекарственной формы, содержащей дельта-сон индуцирующий пептид, в геронтологической практике оказало выраженное положительное влияние на когнитивные функции и эмоциональное состояние больных, в том числе было обнаружено его анксиолитическое действие (Один В.И. и соавт., 2004).
Биологические механизмы регуляции тревожности как пептидами, так и другими регуляторными соединениями связаны, как правило, с модуляцией активности основных нейрохимических систем. Гармоничное функционирование систем регуляторных пептидов позволяет поддерживать уровень тревожности, адекватный сложившейся ситуации. Логично предположить, что на начальных стадиях отклонения уровня тревожности от нормы, в случае пограничных тревожных расстройств коррекция этих регуляторных систем может быть терапевтически эффективной.
Исследованию роли опиоидных пептидов, эндогенной опиоидной системы в патогенезе тревоги к моменту начала диссертационного исследования были посвящены лишь немногочисленные и противоречивые публикации (Ng G.Y. et aL 1996, Tsuda M. et al., 1996). Вместе с тем, важнейшая роль этой системы в регуляции эмоционатьной сферы, в реализации развития психоэмоциональных и соматических проявлений стрессовых реакций не вызывает сомнений. Кроме того, опиоидная система функционально тесно связана с серотониновой (Oomagari К., 1989. Agmo A.. Belzung С. 1998, Yilmaz В. et al, 1998), ГАМК-ергической (Stanford IM, Cooper AJ., 1999, Shen KZ, Johnson SW., 2002, Roberto M, Siggins GR., 2006), холецистокининовой (Hebb A.L.O. et al., 2005) и другими нейрохимическими системами, роль которых в развитии тревоги твердо доказана.
В настоящее время особое внимание уделяется разработке психотропных препаратов пептидной природы. Преимуществом пептидных препаратов является крайне низкая вероятность токсичности при введении даже в больших дозах, поскольку продуктами их деградации являются природные аминокислоты. Кроме того, регуляторные пептиды выполняют, в основном, гомеостатические функции, что существенно снижает вероятность развития отрицательных побочных эффектов при их использовании. Прогресс в синтезе пептидных препаратов, устойчивых к разрушающему действию ферментов и способных проникать через гематоэнцефалический барьер, современные технологии, позволяющие целенаправленно создавать из такого пластичного материала, как пептиды, соединения с заранее прогнозируемыми свойствами дали определенные результаты. Только в нашей стране уже создан ряд эффективных лекарственных препаратов пептидной природы. Один из них, семакс, успешно используется в клинической практике при лечении инсультов и других неврологических заболеваний (Гусев Е.И., Скворцова В.И.,2001).
Другим результатом многолетнего целенаправленного исследования по поиску и изучению нейротропного действия пептидов явилось создание оригинального пептидного соединения - селанка - (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro). С использованием ряда поведенческих моделей в доклинических исследованиях были получены данные об эффективности селанка как анксиолитика, обладающего также ноотропным и стресс-протективным действием (Середенин СБ. и соавт., 1995, 1996, 1998). Вместе с тем, биологический механизм действия селанка до конца не изучен. Можно предположить, что один из механизмов анксиолитического эффекта селанка связан с его воздействием на эндогенную опиоидную систему. Изучение влияния селанка на опиоидную систему может быть интересно также с точки зрения уточнения показаний к его применению при лечении тревожных расстройств.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было выявление изменений в опиоидной системе при формировании тревожных состояний и изучение опиоидергических механизмов действия новых анксиолитиков.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
1. Экспериментальное исследование анксиолитических эффектов агонистов опиоидных рецепторов (ОР) дельта- и мю-типов.
2. Исследование параметров, характеризующих состояние опиоидной системы (константы связывания центральных ОР, активность эндогенных лигандов ОР и скорость ферментативной деградации лей-энкефалина в мозгу и крови), у животных с различными поведенческими проявлениями тревожности.
Определение параметров, характеризующих активность энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) в крови людей с различными конституционально-личностными характеристиками и у больных с разными формами тревожных расстройств.
Изучение влияния пептидного анксиолитика селанка и его отдельных пептидных фрагментов на активность ЭДФ in vitro.
5. Экспериментальное исследование роли опиоидной системы в механизмах поведенческих эффектов селанка: сопоставление выраженности этих эффектов с действием препарата на активность ЭДФ in vivo и изучение возможности блокирования анксиолитического действия селанка антагонистом ОР налоксоном.
6. Экспериментальное исследование способности синтетического аналога энкефалинов даларгина и селанка, параллельно с анксиолитическим действием, препятствовать развитию стресс-индуцированных соматических нарушений на уровне сердечно-сосудистой и иммунной систем.
7. Сопоставление клинических эффектов селанка и медазепама с изменением активности ЭДФ в крови больных генерализованным тревожным расстройством.
Научная новизна. Установлена принципиальная возможность и перспективность нового подхода к фармакотерапии тревожных расстройств, связанного с активацией опиоидной системы путем воздействия на ОР 8-типа и/или ингибирования ферментов деградации эндогенных опиоидных пептидов.
Впервые получены и опубликованы данные об анксиолитическом эффекте агониста 5-ОР даларгина.
Впервые обнаружено, что один их механизмов биологического действия нового пептидного анксиолитика селанка опосредован его влиянием на опиоидную систему.
Впервые продемонстрировано, что для животных с различным уровнем поведенческих проявлений тревоги характерны различия по ряду параметров функционального состояния опиоидной системы: характеристики связывания центральных ОР, концентрация и скорость гидролиза эндогенных лигандов ОР в мозге и крови.
Впервые продемонстрированы различия в состоянии опиоидной системы здоровых людей с различными конституциональными характеристиками и больных с разными формами тревожных расстройств. Эти данные позволяют понять один из механизмов конституционально обусловленной предрасположенности человека к заболеваниям, в патогенезе которых существенно нарушение опиоидной системы.
Практическая значимость. Разработана методика хроматографического разделения продуктов деградации равномерно меченного тритием лей-энкефалина, позволяющая одновременно оценивать активность всех групп ЭДФ в микроколичестве биологических жидкостей и тканей человека и животных. Методика информативна для диагностики пациентов с тревожно-фобическими расстройствами и другими заболеваниями. нуждающихся в коррекции эндогенной опиоидной системы. В результате проведенного исследования установлено, что при генерализованном тревожном расстройстве (ГТР) наблюдается изменение состояния опиоидной системы, которое в значительной степени нормализуется в процессе терапии селанком. Сопоставление этих данных с результатами клинической эффективности селанка и опиоидзависимым механизмом его действия свидетельствует о патогенетической обоснованности применения препарата при ГТР.
Поскольку опиоидная система участвует в регуляции широкого спектра функций организма, предполагается целесообразным расширение показаний к использованию селанка и даларгина в целях профилактики и терапии психических и соматических заболеваний, характеризующихся значимыми нарушениями состояния этой системы. Данные о кардиотропном эффекте селанка свидетельствуют о перспективности его использования при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы, сопровождающихся тревожными расстройствами. Практический интерес представляют также данные о нормализующем действии даларгина на иммунную систему животных в условиях хронического стресса, что дает основание рекомендовать использование этого препарата для иммунокоррекции при истощении опиоидной системы.
Внедрение результатов исследования. Результаты проведенных исследований внедрены в работу ГУ Научного центра психического здоровья РАМН, ГУ Научно-исследовательского института фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, Российского государственного медицинского университета и ФГУ Национального научного центра наркологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
![Церебропротекторный эффект препаратов антиоксидантного и антикоагулянтного типа действия при эндотоксикозе [Электронный ресурс]](/i/i/4349/187907.png "Церебропротекторный эффект препаратов антиоксидантного и антикоагулянтного типа действия при эндотоксикозе [Электронный ресурс] Бородина Татьяна Александровна")
