Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 15
1.1. Фармакологические свойства ладастена и механизмы их реализации 15
1.2. Рецепторы и внутриклеточные сигнальные системы, участвующие в реализации механизмов действия психофармакологических средств 41
1.3. Механизмы формирования реакций клеток в ответ на действие психофармакологических средств 64
Собственные исследования
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований 78
2.1. Материалы исследований 78
2.1.1. Препарат 78
2.1.2. Экспериментальные животные 78
2.1.3. Извлечение структур головного мозга крыс 78
2.1.4. Бактериальные штаммы и векторы 79
2.1.5. Перечень использованных реактивов и материалов 79
2.2. Методы исследований 84
2.2.1. Методы исследования активности протеинкиназ и Са2+-АТФазы 84
2.2.1.1. Выделение белков цитоплазмы 84
2.2.1.2. Выделение белков мембраны 85
2.2.1.3. Фосфорилирование белков in vivo 85
2.2.1.4. Электрофорез белков 86
2.2.1.5. Определение активности протеинкиназ 86
2.2.1.6. Электроперенос белков из акриламидных гелей на мембранные фильтры (блоттинг) 87
2.2.1.7. Гибридизация с антителами 87
2.2.1.8. Детекция 88
2.2.1.9. Определение активности Са2+-АТФазы 88
2.2.2. Методы исследования дифференциальной экспрессии генов 89
2.2.2.1. Выделение суммарной РНК 89
2.2.2.2. Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы 90
2.2.2.3. Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени 90
2.2.2.4. Гибридизация на макрочипах 96
2.2.2.5. Анализ изображений радиоавтографов 97
2.2.3. Методы исследования метилирования остатков цитозина в ДНК 98
2.2.3.1. Выделение суммарной ДНК 98
2.2.3.2. Модификация нуклеотидов бисульфитом натрия 99
2.2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 99
2.2.3.4. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 100
2.2.3.5. Элюция ДНК из агарозных гелей 101
2.2.3.6. Лигирование продуктов ПЦР 102
2.2.3.7. Подготовка компетентных клеток 102
2.2.3.8. Трансформация компетентных клеток Rcoli рекомбинантной ДНК 103
2.2.3.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК 103
2.2.3.10. Секвенирование ДНК 105
2.2.3.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 105
2.2.4. Методы протеомного анализа белков 105
2.2.4.1. Двумерный электрофорез белков 105
2.2.4.2. Анализ изображений двумерных электрофореграмм 106
2.2.4.3. Гидролиз белков и MALDI-TOF масс-спектрометрия 106
2.2.5. Методы исследования функционального состояния отдельных компонентов иммунной системы 107
2.2.5.1. Выделение лимфоцитов крови 107
2.2.5.2. Приготовление тотального клеточного лизата для иммуноблоттинга 108
2.2.5.3. Определение пролифсративной активности лимфоцитов 108
2.2.5.4. Определение активности апоптоза лимфоцитов, суммарной активности каспаз и белков-регуляторов апоптоза 108
2.2.6. Методы анализа ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов 110
2.2.6.1. Приготовление ядерного экстракта 110
2.2.6.2. Идентификация транскрипционных факторов 110
2.2.6.3. Детекция результатов гибридизации на TranSignal Protein/DNA Arrays 111
2.2.6.4. Анализ результатов гибридизации на TranSignal Protein/DNA Arrays 112
2.2.7. Определение количественного содержания L-ДОФА и дофамина 112
2.2.8. Электрофизиологические исследования 113
ГЛАВА 3 Активность протеинкиназ в клетках головного мозга крыс при однократном введении ладастена 115
3.1. Фосфорилирование белков in vivo 115
3.2. Влияние ладастена на активность Са27фосфолипид-зависимых протеинкиназ (протеинкиназа С) в клетках головного мозга крыс 116
3.3. Влияние ладастена на активность Са27кальмодулин-зависимых протеинкиназ II (СаМК II) в клетках стриатума, гипоталамуса и гиппокампа головного мозга крыс 122
3.4. Влияние ладастена на активность цАМФ-зависимых протеинкиназ (протеинкиназа А) в клетках головного мозга крыс 126
3.5. Влияние ладастена на активность митоген-активируемых киназ (ERK1/2) в клетках стриатума, гипоталамуса и гиппокампа головного мозга крыс 130
3.6. Влияние ладастена на экспрессию генов нейротрофинов
NGF и BDNF 136
ГЛАВА 4 Влияние ладастена на днк-связывающую активность транскрипционных факторов 140
ГЛАВА 5 Дифференциальная экспрессия генов и белков в клетках головного мозга крыс под действием ладастена 152
5.1. Анализ экспрессии генов на макрочипе, содержащем 588 фрагментов генов крысы 152
5.2. Анализ экспрессии генов на макрочипе, содержащем 1176 фрагментов генов крысы 155
5.3. Количественный анализ экспрессии предполагаемых генов-мишеней, выявленных гибридизацией на кДНК макрочипах, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени 158
5.3.1. Гены ферментов различных метаболических путей 165
5.3.2. Гены регуляторных нейропептидов и их рецепторов 167
5.3.3. Гены белков синаптических функций 172
5.3.4. Гены белков цитоскелета и межклеточных взаимодействий 180
5.3.5. Гены, кодирующие компоненты сигнальных путей 183
5.3.6. Гены опухолевых супрессоров 185
5.4. Влияние ладастена на спектр экспрессирующихся белков в клетках головного мозга крыс 187
5.4.1. Белки-ферменты гликолитического метаболизма 190
5.4.2. Стрессовые белки и белки-шапероны 191
5.4.3. Защитные белки 193
5.4.4. Синаптические белки 194
ГЛАВА 6 Экспрессия гена тирозингидроксилазы вразных структурах головного мозга крыс при действии ладастена и эпигенетическиемеханизмы её регуляции 197
6.1. Влияние ладастена на экспрессию гена, белка и активность тирозингидроксилазы и содержание L-ДОФА и дофамина в различных структурах головного мозга крыс 197
6.1.1. Вентральная область покрышки и прилежащее ядро 197
6.1.2. Гипоталамус 200
6.1.3. Стриатум 203
6.1.4. Гиппокамп 206
6.2. Влияние ладастена на характер метилирования цитозина в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса головного мозга крыс 219
ГЛАВА 7 Влияние ладастена на пролиферативную активность и апоптотическую реактивность т-лимфоцитов 235
7.1. Влияние ладастена на активационно-индуцированную экспрессию FAS-рецептора на Т-лимфоцитах и их чувствительность к FAS-индуцированному апоптозу 239
ГЛАВА 8 Влияние ладастена на синаптическую пластичность в гиппокампе 247
Заключение 254
Выводы 272
Список литературы
- Рецепторы и внутриклеточные сигнальные системы, участвующие в реализации механизмов действия психофармакологических средств
- Бактериальные штаммы и векторы
- Влияние ладастена на активность Са27фосфолипид-зависимых протеинкиназ (протеинкиназа С) в клетках головного мозга крыс
- Количественный анализ экспрессии предполагаемых генов-мишеней, выявленных гибридизацией на кДНК макрочипах, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Введение к работе
Актуальность проблемы
Развитие современной фармакологии получило мощный импульс благодаря открытиям молекулярной биологии и генетики, объяснившим многие, ранее неизвестные процессы регуляции функций клетки и организма. Применение созданной за последние десять лет методической базы открыло новые возможности в изучении механизмов действия лекарств, что определяет перспективы совершенствования фармакотерапии как на этапе поиска и разработки фармакологических препаратов, так и при их применении с основной целью повышения эффективности и максимального снижения побочного действия.
Рецепторная теория, оставаясь главной доктриной фармакологии, в свете современных данных о пострецепторных системах вторичных мессенджеров и их взаимоотношениях с геномом дополняется пониманием многокомпонент-ности фармакодинамических процессов, объясняя системный характер фармакологического воздействия, что согласуется с классическими физиологическими принципами [Анохин, 1975; Судаков, 1979; Середенин, 2004]. Благодаря этому определились подходы к анализу комплекса процессов, изменения которых формируют спектр фармакологического влияния. В настоящей работе предприняты попытки изучить механизмы действия нового оригинального препарата ладастена.
Лададстен (Ы-(2-адамаитил) N-парабромфениламин) синтезирован и фармакологически изучен в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН [Климова и соавт., 1990; Морозов и соавт., 1993-2001]. Выбор препарата в качестве объекта исследования обусловлен его высокой фармакологической активностью, подтвержденной во 2-ой фазе клинических испытаний (Незнамов и соавт., 2006), а главное, сложным фармакологическим спектром, включающим психостимулирующие, аиксиолитические и иммунотропные свойства [Морозов и соавт., 1993,2001; Середенин и соавт.. 2001].
В доступной литературе данные о лекарственных веществах с подобным спектром действия не обнаружены, что определяет необходимость изучения механизмов действия ладастена. Поскольку ранее использованные нейрохимические методы не позволяли придти к заключениям о том, как реализуются его эффекты, в настоящей работе в качестве концептуального избран подход оценки функционального состояния потенциальных фармакологических мишеней препарата - генов и кодируемых ими белков.
Предполагалось, что применение биочипов, количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, двумерного электрофореза, данных биоинформатики позволят выявить комплексные изменения клеточного метаболизма, вызываемые ладастеном, анализ которых в сопоставлении с его известными фармакологическими эффектами даст возможность сформулировать научные положения о молекулярных механизмах действия препарата.
Цель исследования
Изучить молекулярные механизмы формирования психостимулирующего, анксиолитического и иммунотропного действия ладастена.
Задачи исследования
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить влияние ладастена (50 мг/кг; in vivo) на активность цАМФ-, Са 7фосфолипид-, Са 7кальмодулин-зависимых и митогенактавируемых про-теинкиназ в клетках головного мозга крыс.
Выявить спектр дифференциально экспрессирующихся генов в клетках головного мозга крыс при однократном введении ладастена в дозе 50 мг/кг.
Определить количественный уровень экспрессии генов-мишеней ладастена методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Установить эпигенетические механизмы регуляции экспрессии отдельных генов-мишеней ладастена.
Методами протеомного анализа выявить спектр экспрессирующихся под влиянием ладастена белков в головном мозге крыс.
Изучить влияние ладастена (10 цМ; in vitro) на синаптическую пластичность в гиппокампе.
Изучить влияние ладастена на иролиферативную и апоптотическую активность лимфоцитов.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное молекулярно-биологическое исследование оригинального препарата ладастена, обладающего широким спектром фармакологической активности. Показано, что ладастен при однократном внут-рижелудочном введении в дозе 50 мг/кг в клетках головного мозга крыс в большой степени фосфорилирует мембранные белки и в зависимости от структуры мозга дифференциально активирует протеинкиназы цАМФ-, Са2+- и МАП-киназных сигнальных каскадов. Впервые выявлено, что ладастен преимущественно активирует Са +-зависимые протеинкиназы, что обусловлено высвобождением Са + из внутриклеточных депо эндоплазматического ретику-лума. Впервые идентифицированы дифференциально экспрессирующиеся под действием ладастена гены и белки в клетках головного мозга крыс, функциональное состояние которых позволяет обосновать психостимулирующую, ан-ксиолитическую и иммуиотропную активности препарата. Впервые установлено, что ладастен увеличивает экспрессию гена тирозингидроксилазы и содержание соответствующего белка, коррелирующее с накоплением продуктов реакции - L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе, гиппокампе и вентральной области покрышки экспериментальных животных. Синтез de novo данного кате-холамина под действием ладастена рассматривается в качестве основного механизма, определяющего особенности психоактивирующего действия препарата. Впервые показано, что изменение транскрипционной активности гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса крыс под действием ладастена может быть связано с изменением характера метилирования CpG-динуклеотидов в промоторной области этого гена: выявлено увеличение частоты деметилирова-ния CpG-динуклеотидов в последовательностях, ассоциированных с сайтами связывания отдельных транскрипционных факторов. Установлено, что ладастен
ингибирует активность гистондеацетилаз в стриатуме и гиппокампе крыс. Впервые показано, что ладастен оказывает влияние на синаптическую пластичность в гиппокампе, способствуя переходу кратковременной потенциации в долговременную. Данный процесс обусловлен усилением дофаминергической нейропередачи на фоне препарата и является зависимым от синтеза белка de novo. Экспериментально установлено, что комитогеиный эффект ладастена в культуре Т-лимфоцитов сопряжен с активацией конечных эффекторов МАП-киназного каскада - протеинкиназ ERK1/2. Впервые показано, что ладастен снижает чувствительность Т-лимфоцитов к Fas-индуцированному апоптозу. Эти результаты подтверждают наличие у ладастена иммуностимулирующих свойств.
Научно-практическая значимость
Установленные геномные и внутриклеточные механизмы действия ладастена подтверждают данные о спектрах фармакологической активности препарата, что определяет целесообразность его использования в клинике при необходимости коррекции ряда состояний. Полученные данные учтены при составлении инструкции по применению ладастена в качестве антиастенического средства. Выявленные фармакологические мишени препарата могут быть рассмотрены как в качестве "маркеров" состояния, что необходимо для молекулярной диагностики, так и в качестве предикторов назначения ладастена. При выполнении фармакогеномного и фармакопротеомного исследования апробирован комплекс молекулярно-биологических методов, внедрение которых целесообразно при выполнении фундаментальных фармакологических исследований.
Внедрение результатов исследования в практику
Методические подходы, использованные в данной работе, могут найти применение на этапах доклинического исследования потенциальных лекарственных препаратов с целью уточнения спектра действия и анализа механизмов их активностей. Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций студентам на кафедре общей биологии и генетики Башкирского
12 государственного педагогического университета, а также на кафедре фармакологии № 2 Башкирского государственного медицинского университета. Основные положения, выносимые на защиту
Предметом защиты данной работы являются следующие основные результаты исследований:
Реализация фармакологических эффектов ладастена сопряжена с активацией протеинкиназ различных сигнальных каскадов (РКА, РКС, СаМКН, ERK1/2).
Одним из механизмов, обеспечивающим особенности психоактиви-руюшего действия ладастена является усиление экспрессии гена и белка тиро-зингидроксилазы и биосинтеза дофамина в отдельных структурах мозга крыс. В регуляцию транскрипционной активности данного гена вовлекаются эпигенетические механизмы, что проявляется в увеличении частоты деметилирования цитозинов в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов в про-моторной его области, а также в ингибировании активности гистондеацетилаз.
Ладастен при однократном воздействии оказывает влияние на функциональное состояние многих генов и белков в мозге крыс, которые могут быть охарактеризованы в качестве мишеней препарата и определять направление протекания метаболических процессов.
Иммунопротектииные свойства ладастена связаны с комишіенной его активностью и способностью снижать чувствительность Т-лимфоцитов к Fas-индуцированному апоптозу.
Механизмы нейропластичности, которые реализуется при действии ладастена, связаны с усилением экспрессии везикулярных, транспортных, цито-скелетных и некоторых других белков.
Влияние ладастена на синаптическую пластичность в гиппокампе обусловлено усилением дофаминергической нейропередачи и является зависимым от синтеза de novo дофамина и белка.
13 Конкурсная поддержка работы
Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (10002-251 /П-10/142-448/260503 -196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ - 2217.2003.4), РФФИ - Агидель (02-04-97904).
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на VIII-м и Х-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2001, 2003); 3-й Международной Конференции " Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Суздаль, 2001); 5-м Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2002); 2-м Съезде Российского Научного Общества Фармакологов (Москва, 2003); 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация"^ Іущино, 2003); Научно-практической конференции "Проблемы создания новых лекарственных средств" (Уфа, 2003); FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (Brussels, 2003); XVI-й зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004); Ш-м Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004); XXIV CINP Congress (Paris, 2004); 6th Meeting of the German Neuroscience Society (Gottingen, 2005); 8th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005); V-м Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006); Научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону , 2006). Работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии и генетики (протокол № 9 от 15 сентября 2006г.)
14 Публикации
По теме диссертации опубликована 31 работа, в том числе в зарубежных изданиях - б.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 336 страницах, содержит 11 таблиц и 60 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава ]), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3-8), заключения, выводов и списка литературы, включающего 589 источников.
Рецепторы и внутриклеточные сигнальные системы, участвующие в реализации механизмов действия психофармакологических средств
Для подавляющего большинства лекарственных средств природа фармакологического эффекта рассматривается в рамках рецепторной теории, предполагающей более или менее избирательное взаимодействие лекарственного вещества со специфическими рецепторами. Основы современной концепции о рецепторах как участках клеточной поверхности, селективно связывающих физиологически активные вещества и лекарства и опосредующих таким образом их воздействие на клетку, были заложены Дж.Лэнгли и П. Эрлихом [Langley, 1906; Ehrlich, 1909]. Однако лишь к 60-м гг. прошлого века благодаря внедрению в клиническую практику первого нейролептика аминазина, развитию методов исследования структуры и функций рецепторов, а также все возрастающему количеству данных о нейромедиаторах и основах функционирования мозга, сформировались представления о рецепторах нейромедиаторов как о мишенях действия психофармакологических средств. По современным представлениям около 2/3 всех известных лекарственных препаратов имеет рецепторный механизм действия, а в психофармакологии этот показатель приближается к 100% [Therapeutic Target Database: http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cittd/ttd.asp1. По характеру взаимодействия с рецепторами лекарства могут проявлять свойства агонистов, антагонистов, а также позитивных или негативных аллостерических модуляторов тех или иных типов рецепторов, что определяет специфику и конечный результат клеточного ответа. Кроме того, лекарственные средства могут проявлять свойства непрямых агонистов, не взаимодействуя непосредственно с рецепторами и связанными с ними структурами [Сергеев и соавт., 1999]. Фармакологическое действие может быть также направлено на ферменты, транспортеры, опосредоваться липидами, ионными каналами и другими процессами. Некоторые данные о фармакологически значимых мишенях различных, в том числе и психофармакологических средств, приведены в статье Imming et al. [2006].
Существенный прогресс в идентификации новых рецепторных мишеней психофармакологических средств достигнут в результате фундаментальных исследований патогенетических основ формирования различных заболеваний и расстройств ЦНС. Так, например, появившиеся в начале 60-х годов XX века теории, обосновывающие развитие психозов избыточным функционированием дофаминовой системы, сохранили свою принципиальную значимость до настоящего времени. Carlsson et al, [1963] показали, что особенности клинического действия нейролептиков обусловлены их общими нейрохимическими свойствами, заключающимися в способности избирательно
Лэнгли и П. Эрлихом [Langley, 1906; Ehrlich, 1909]. Однако лишь к 60-м гг. прошлого века благодаря внедрению в клиническую практику первого нейролептика аминазина, развитию методов исследования структуры и функций рецепторов, а также все возрастающему количеству данных о нейромедиаторах и основах функционирования мозга, сформировались представления о рецепторах нейромедиаторов как о мишенях действия психофармакологических средств. По современным представлениям около 2/3 всех известных лекарственных препаратов имеет рецепторный механизм действия, а в психофармакологии этот показатель приближается к 100% [Therapeutic Target Database: http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cittd/ttd.asp1. По характеру взаимодействия с рецепторами лекарства могут проявлять свойства агонистов, антагонистов, а также позитивных или негативных аллостерических модуляторов тех или иных типов рецепторов, что определяет специфику и конечный результат клеточного ответа. Кроме того, лекарственные средства могут проявлять свойства непрямых агонистов, не взаимодействуя непосредственно с рецепторами и связанными с ними структурами [Сергеев и соавт., 1999]. Фармакологическое действие может быть также направлено на ферменты, транспортеры, опосредоваться липидами, ионными каналами и другими процессами. Некоторые данные о фармакологически значимых мишенях различных, в том числе и психофармакологических средств, приведены в статье Imming et al. [2006].
Существенный прогресс в идентификации новых рецепторных мишеней психофармакологических средств достигнут в результате фундаментальных исследований патогенетических основ формирования различных заболеваний и расстройств ЦНС. Так, например, появившиеся в начале 60-х годов XX века теории, обосновывающие развитие психозов избыточным функционированием дофаминовой системы, сохранили свою принципиальную значимость до настоящего времени. Carlsson et al. [1963] показали, что особенности клинического действия нейролептиков обусловлены их общими нейрохимическими свойствами, заключающимися в способности избирательно
Сходная динамика прослеживается во взглядах на механизмы возникновения тревожных расстройств и родственной патологии с тем отличием, что фокус приходится здесь на ГАМКергическую систему как основную мишень для іранквилизаторов. Патогенетическая и терапевтическая значимость ГАМКд-рецспторов не уменьшилась, однако, обнаружение новых центров (например, стероидный) связывания лигандов на этом типе рецепторов открыло иные перспективы для создания ГАМКергических анксиолитиков. С другой стороны, открытие других рецепторных структур (глутаматных, холецистокининовых, серотониновых, каннабиноидных, ГАМКв), участвующих в патогенезе тревожности, свидетельствует о возможности создания препаратов, имеющих мишени, отличные от ГАМКл-рецепторов [Ashton, et al„ 2003; Bergink et al., 2004; Cryan et al., 2004; Gordon et al., 2004; Kehneetal.,2002].
Представленные выше краткие сведения о вовлеченности различных нейрохимических систем в патогенез психических расстройств позволяют заметить, что, во-первых, одни и те же медиаторные системы принимают участие в развитии нескольких психических патологий, во-вторых указанные системы являются мишенями для разнообразных психофармакологических средств [Мосолов, 1995,2002]. В связи с этим современной психофармакологии неизвестны лекарственные средства, проявляющие исключительную селективность взаимодействия только с одним связывающим участком. Следует особо подчеркнуть, что для всех изучавшихся и использующихся в практике психофармакологических средств не выявлена специфичность в отношении какого-либо одного типа рецептора, чем в ряде случаев объясняется сочетание нескольких видов фармакологической активности, подчас противоположных по направленности, а также побочные эффекты
Бактериальные штаммы и векторы
Измерение флуоресценции во время реакции проводилось с использованием оптического модуля, анализ - iCycleriQ Realime Detection System software версии 3.0.6070 (BioRad, США). Для выравнивания всех измерительных каналов и минимизации всех неоднородностей системы регистрации и погрешностей дозирования рассчитывался динамический Фактор лунок (Well Factor) с экспериментального планшета. Накопление данных флюоресценции в ходе ПЦР происходило на этапах отжига праймеров и элонгации. Для построения стандартной кривой производилось четыре серии разведений кДНК из каждой реакции обратной транскрипции: 1, 0.5, 0.25, 0.1. Эффективность реакции определяется углом наклона стандартной кривой, и рассчитывается по формуле: Е = 10 "1 "s оре), где Е - эффективность реакции, slope - наклон стандартной кривой. Количественному анализу подлежали лишь данные тех экспериментов, эффективность реакций которых была равна 100 ± 10%, а коэффициент корреляции не менее 0.9. Каждая реакция требовала дополнительной "качественной" проверки, т.к. наличие димеров, неспецифического отжига праймеров и других факторов могло отрицательно отразиться на достоверности количественного анализа результатов. Специфичность реакции проверяли построением кривой плавления непосредственно после завершения ПЦР по следующему протоколу: 95С - 1 мин, 65 С - 1 мин., затем 60 циклов + 0.5С через каждые 10 сек, в течение которых происходило накопление данных о флюоресценции. В расчете использовались данные реакции с одним пиком на кривой и ожидаемой температурой плавления продукта. Длина амплификата контролировалась путем электрофореза продуктов реакции в 1.5%-ном агарозиом геле. Уровень мРНК каждого подтверждаемого гена нормализовали по уровню мРНК гена "домашнего хозяйства1 HPRT {hypoxanthine-gimnine phosphoribosyl transferase), принятого в качестве внутреннего контроля. Определение относительного уровня мРНК исследуемых генов проводилось с помощью модификации С(0-метода [Applied Biosystems, 2001 ] с использованием так называемых пороговых циклов [C(t)J - точек пересечения кривой амплификации с базовой линией в самом начале экспоненциальной фазы ПЦР. Базовая линия определялась автоматически, либо же вручную. После определения пороговых циклов, рассчитывалось их среднее значение для каждой группы образцов (контрольной и опытной). Изменения в уровнях экспрессии генов рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы REST Tool VI.9.9 (Corbertt Research, CIIIA), обладающей возможностью статистической обработки данных [Pfaffl et al., 2002]. В данной программе для определения разницы в экспрессии гена между опытными и контрольными группами используются значения пороговых циклов исследуемого гена и гена "домашнего хозяйства". Модификация технологии рандомизации данных (число повторов 50000) позволяет использовать в анализе нормализацию по уровню экспрессии генов "домашнего хозяйства", эффективность ПЦР, а так же определить доверительный интервал, стандартное отклонение экспрессионного уровня и статистическую значимость изменений в экспрессии генов. Относительное значение уровня экспрессии гена рассчитывается по формуле: ГаПО - \L(argeJ preference,) Дс ratio - отношение уровня синтеза мРНК исследуемого гена в опытных образцах к контрольным; Е1агееі - эффективность ПЦР реакции в режиме реального времени исследуемого гена; ЕгегсгспСе - эффективность ПЦР реакции в режиме реального времени для гена HPRT; ACt(control - experiment) - разность средних значений пороговых циклов амплификации контрольной и опытной матриц. Разница в экспрессиоииом уровне гена между опытной и контрольной группой считалась статистически значимой при р 0.05. Программа REST Tool VI.9.9 (Corbertt Research, США) так же позволяет провести визуализацию результатов в виде интерквартильного размаха с медианой генной экспрессии и минимумами и максимумами значений. Таблица2- Последовательности праймеров для амплификации фрагментов
Гибридизацию меченых кДНК, полученных из контрольных и опытных образцов проводили на "Atlas Rat cDNA Expression Array"(7738-1; BD Biosciences, США) и "Atlas Rat 1.2 Array II" (7856-1; BD Biosciences, США). В первом случае на каждой положительно заряженной нейлоновой мембране иммобилизовано 588 амплифипированных фрагментов кДНК известных генов крысы, каждый из которых нанесен дважды, а во втором - 1176 фрагментов генов, нанесенных без повторностей.
Получение меченых проб, гибридизацию и анализ проводили согласно протоколу производителя. Р или Р-меченые фрагменты кДНК получали в реакции обратной транскрипции 2-5 мкг суммарных препаратов РНК в присутствии [а-32Р или u-33P]dATP (3000 Ки/моль), ген-специфичных праймеров, представляющих собой смесь праймеров, комплементарных фрагментам кДНК, представленным на мембранах; 10 dNTP; 5 реакционного буфера и 100 ед. обратной транскриптазы M-MuLV. Невключившуюся радиоактивную метку удаляли па колонках NucleoSpin Extraction Columns (BD Biosciences, США).
Мембраны предгибридизовали в 5 мл гибридизационного буфера ExpressI lyb (BD Biosciences, США) и 0.5 мг ДНК спермы лосося в течение 2-3 ч при 68С. После соответствующей подготовки образцы (удельная активность находилась в пределах 2-4.5 106 имп/мин/мкг в зависимости от образцов) добавляли к мембранам. Гибридизацию проводили в приборе "Micro 4 Hybridization Oven" (Hybaid, Великобритания) в течении 14-16 ч при 68С в стеклянных флаконах при постоянном вращении. После окончания гибридизации мембраны последовательно отмывали 3 раза в растворе, содержащем 2 SSC и 1% ДДС-Na при 68С, затем один раз при той же температуре в 0.1 SSC и 0.5% ДДС-Na и один раз при комнатной температуре в 2 SSC. Затем влажные мембраны помещали и кассеты для авторадиографии. Мембраны экспонировали на рентгеновскую пленку Kodak BioMax MS (Kodak, США) в кассетах для авторадиографии с усиливающим экраном различные промежутки времени (24 ч, 48 ч, 72 ч и более), а затем сканировали с разрешением 600 п/см сканере Epson Perfection 3200 PHOTO.
Влияние ладастена на активность Са27фосфолипид-зависимых протеинкиназ (протеинкиназа С) в клетках головного мозга крыс
Фосфорилирование FOX01 ПКВ по Ser253 и Ser316 приводит к инактивации транскрипционного фактора за счет его транслокации из ядра, следствием чего является ингибирование транскрипции генов-мишеней [Biggs et al., 1999]. Таким образом, ПКВ негативно регулирует активность FOX01. Имеются сведения о том, что FOX01 способен связывать инсулин-чувствительные элементы (IRE) и трансактивировать промоторы некоторых генов, например, генов, кодирующих Fas лиганд и белок, связывающий инсулин-подобный фактор роста (IGF-BP1). Предполагается, что экспрессия факторов роста, в частности инсулина, индуцируется при каких-либо цитотоксических воздействиях и, посредством активации PI-3K - РКВ - FOX01 сигнального каскада приводит к супрессии транскрипции генов апоптоза, вероятно, способствуя клеточной выживаемости [Brunet et al., 1999]. Таким образом, выявленное нами ингибирование активности ТФ FKHR (FOX01) в клетках мозга крыс при действии ладастена, вероятно, свидетельствует, во-первых, об активации PI-ЗК-зависимого пути, а во-вторых, о возможной индукции апоптотических сигналов.
NPAS2, или Neuronal PAS domain protein 2 (нейронный PAS-доменный белок 2) - транскрипционный фактор с преобладанием экспрессии в среднем мозге. NPAS2 принадлежит к bHLH-PAS суперсемейству транскрипционных факторов и содержит пространственные домены типа "спираль-летля-спираль" и гем-содержащие домены PAS. NPAS2 имеет структурное сходство с ТФ CLOCK и участвует в регуляции транскрипции генов, контролирующих циркадные ритмы в областях мозга, отличных от CLOCK, в частности в соматосенсорнои, визуальной коре и обонятельных луковицах среднего мозга [Dudley et al., 2003]. Не так давно показано, что мыши-нокауты по гену NPAS2 обнаруживают нарушения формирования эмоциональной долговременной памяти, а также демонстрируют сниженную способность к восприятию сенсорных стимулов [Garcia et al., 2000]. Основываясь на данных тестирования трансгенных мышей в различных поведенческих методиках, авторы цитированных работ полагают, что NPAS2 регулирует тканеспецифичную
149 экспрессию многих генов, участвующих в механизмах консолидации долговременной памяти (т.к. называемых генов синаптической пластичности) и процессинге сенсорной информации, а также вовлеченных в контроль эмоций -страха и тревоги. Однако к настоящему времени специфические гены-мишени NPAS2 в клетках мозга не установлены. Принимая во внимание факты об индуцируемых при действии ладастена изменениях экспрессии ряда генов, вовлеченных в молекулярные аспекты обучения и памяти (гл. 5), можно предполагать участие транскрипционного фактора NPAS2 в регуляции транскрипции этой группы генов, хотя, конечно же, подтверждение этого предположения требует дальнейших исследований.
Еще одним представителем семейства транскрипционных факторов HLH-PAS является HIF-1 (hypoxia-inducible factor). HIF-1 играет ключевую роль в зависимой от гипоксии экспрессии генов. HIF-1 - гетеродимерный ТФ, состоящий из HIF-la и HIF-lp субъединиц. Гипоксия способствует возрастанию уровня HIF-la, его димеризации с HIF-lp и связыванию димера с последовательностью HRE (hypoxia-response element) в регуляторных областях генов-мишеней [Semenza, 1999]. Идентифицированы гены, регулируемые HIF-1, среди которых фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эритропоэтин, переносчик глюкозы-1, гликолитические ферменты - энолаза І, лактат дегидрогеназа. Считается, что индукция транскрипции чувствительных к гипоксии генов является необходимым этапом адаптации к гипоксии, поскольку показано, что продукты этих генов опосредуют механизмы увеличения доставки Ог, либо вовлекаются в процессы, направленные на снижение потребности в кислороде в условиях гипоксии [Semenza, 2000]. На модели фокальной ишемии мозга крыс, вызванной пережатием средних мозговых артерий, выявлено увеличение уровня мРНК и белка HIF-1, а также некоторых гликолитических ферментов [Bergeron et al., 1999]. Имеются данные, свидетельствующие о том, что некоторые хелаторы железа предупреждают индуцированную оксидативным стрессом гибель культур кортикальных нейронов на счет позитивного влияния на активность HIF-1 и регулируемых им 150 генов [Zaman et al., 1999]. Таким образом, увеличение активности HIF-1 в клетках мозга крыс при действии ладастсна, возможно, отражает реализацию протективных механизмов.
Обращает на себя внимание значительное увеличение связывающей активности SAA элемента промотора гена предшественника р-амилоидного белка крыс (J5-APP). SAA элемент содержит консенсусные последовательности для связывания ТФ Spl, АР-4, АР-1, USF [Hoffman, Chernak, 1995]. В норме р-амилоидный белок участвует в организации межнейрональных контактов. В то же время, как известно, в каскаде молекулярно-клеточных событий, ведущих к амилоидозу и гибели нервных клеток, участвуют амилоидные пептиды, образующиеся посредством расщепления протеолитическими ферментами большого белка-предшественника и вступающие в межмолскулярные взаимодействия в результате конформационных перестроек с образованием патогенных структур, р-амилоидный пептид является основным компонентом фибриллярного амилоида, откладывающегося в сенильных бляшках у больных болезнью Альцгеймера [Theuns, Broeckhoven, 2000]. К числу факторов, которые могут привести к возрастанию fi-APP относятся гипогликемия, оксидативный стресс, увеличение локального образования провоспалительных цитокинов и др. [Dewji, Do, 1996]. С большой долей осторожности можно предположить вероятность индукции ладастеном или его метаболитами экспрессии гена р-АРР в клетках мозга крыс. Не исключено также, что выбранная нами доза препарата может быть токсичной для данного вида животных, в связи вопрос о некоторых возможных негативных аспектах действия ладастена требует дальнейших исследований, которые включали бы в себя проведение модельных экспериментов, проверку влияния различных доз препарата на активность ТФ у различных видов животных и другие исследования.
Количественный анализ экспрессии предполагаемых генов-мишеней, выявленных гибридизацией на кДНК макрочипах, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени
В последние годы накоплено много данных о том, что психостимуляторы, антидепрессанты, анксиолитики и другие психоактивные вещества, наряду с изменениями электрофизиологических и нейрохимических параметров, также модифицируют структуру и активность компонентов синаптического сигналинга, и как следствие, функционального состояния везикулярных, мембранных, транспортных и ряда других белков [Berke et al., 1998J. Как уже отмечалось выше, ладастен оказывает влияние на экспрессионный статус генов Syn 1А&1В, rEXO70, rabphilin ЗА, RAB7, CPG2 в клетках мозга крыс (рис. 29).
В настоящее время комплекс биохимических и биофизических молекулярных процессов, происходящих при высвобождении нейромедиаторов, хорошо изучен. Охарактеризованы также различные интегральные белки, участвующие в кооперативной регуляции и опосредовании отдельных этапов экзо-и эндоцитоза. Согласно современным представлениям, высвобождение медиаторов посредством экзоцитоза включает в себя четыре основных этапа: 1) направленный транспорт везикул, заполненных медиатором из резервного запаса в пул, доступный к высвобождению, располагающийся в активной зоне мембраны пресииаптического окончания; 2) стыковка (docking) везикулы со специфическим сайтом высвобождения в активной зоне мембраны; 3) слияние мембраны везикулы с плазматической мембраной (собственно экзоцитоз); 4) рециклизация везикул посредством эндоцитоза [Lin et al., 1997; Jahn et al., 1999].
В первом этапе принимают участие семейство белков-синапсинов. Синапсины - семейство фосфопротеинов, локализованных в пресинаптических нервных окончаниях, специфически ассоциированных с цитоплазматической поверхностью мембраны синаптических везикул. Данное семейство представлено 4 гомологичными белками - синапсинами IA, IB и НА, ИВ, в сумме составляющими около 9% всех везикулярных белков и 0.6% от общих белков мозга. Отдельные гены кодируют Synl и Synil; а и b изоформы образуются в результате альтернативного сплайсинга транскриптов [Као et al., 1989]. Синапсины взаимодействуют со многими белками цитоскелета, включая актин, тубулин, спектрин. Синапсин 1 обратимо связывает сииаптические везикулы с актиновыми микрофиламентами, и это связывание модулируется фосфорилированием синапсина преимущественно сАМР- и/или Са27кальмодулин-зависимыми протеин киназами. Фосфорилирование синапсина І ПКА или CaMKIV и СаМКИ ингибирует связывание синапсина с везикулами и актиновыми микрофиламентами, что приводит к диссоциации тройного комплекса везикулы - синапсин - актин, высвобождению везикул из цитоскелета с последующим экзоцитозом депонированных в везикулах нейромедиаторов в синаптическую щель. Параллельно увеличивается содержание свободного синапсина I в цитозоле [Greengard et al., 1993].
В наших исследованиях (глава 3) показано увеличение уровня рСаМКП в гипоталамусе, гиппокампе и стриатуме крыс. Активация СаМКП, как было отмечено выше, приводит к фосфорилированию синапсина I (как одной из мишеней данной протеинкиназы), и, в конечном счете, к увеличению содержания свободного синапсина в цитоплазме нейронов. Наблюдаемое нами инигбирование экспрессии гена Syn IA&1B, возможно, происходит в ответ на повышение уровня синапсина.
Одним из белков, входящим в состав мультибелкового комплекса, ассоциированного с везикулами, является гЕХО70. Данный белок, как полагают, является фактором, определяющим направление движения (targeting) везикул к определенным сайтам активных зон мембран, и важен для пространственной регуляции секреции нейромедиаторов [Wang et al., 2004].
В регуляции последующих этапов экзоцитоза - направленного транспорта и стыковки (docking) - большое значение отводится Rab-белкам семейства малых ГТФаз [Zerial et al., 2001]. Белки подкласса Rab3 экспрессируются преимущественно в нейронах и являются важнейшими интегральными компонентами мембраны малых пресинаптических везикул. Данные белки вовлечены в регуляцию поздних этапов Са2 -зависимого экзоцитоза везикул различных нейромедиаторов, а также в процессы антероградного транспорта синаптических везикул [Geppert et al, 1997]. Rabphilin ЗА - эффекторный белок, также ассоциированный с везикулами, специфически взаимодействующий с ГТФ-связанной формой Rab3a и стабилизирующий ее в активном состоянии [Ostermeier et al., 1999]. Rabphilin ЗА также взаимодействует с другими белками, вовлеченными в направленный транспорт везикул, экзо- и эндоцитоз, например, с белками SNARE - комплекса, Р-аддуцином и др. [Miyazaki et al., 1994; Lian et ah, 1994]. Показано, что повышенная экспрессия Rabphilin ЗА усиливает экзоцитоз, тогда как блокирование антисмысловыми кДНК к Rabphilin ЗА ингибируют секрецию. Предполагается, что Rabphilin ЗА является позитивным регулятором экзоцитоза [Chung et al., 1995].
Заключительный этап кругооборота везикул состоит в их рециклизации, т.е. образовании новых везикул из фрагментов пресинаптической мембраны. Этот процесс заключается в том, что после экзоцитоза образуется везикула, которая через стадию эндосомы вновь заполняется медиатором и может далее участвовать в повторных циклах высвобождения медиаторов. Rab7, также являющийся ГТФ-связанным белком, ассоциирован с мембранами поздних эндосом и участвует в механизмах слияния окаймленных пузырьков с мембранами. Rab7 непосредственно вовлечен в регуляцию транспорта между поздней эндосомой и лизосомой [Verhoeven et al, 2003].
Ген CPG2 кодирует белок, также участвующий в процессах клатрин-опосредованного эндоцитоза рецепторов. Данный белок локализуется исключительно в постсинаптических зонах экзоцитоза возбуждающих синапсов и непосредственно регулирует интернализацию постсинаптических NMDA, АМРА рецепторов, регулируя, таким образом, их количество в синапсе. Увеличение экспрессии гена CPG2, как показано Cottrell et al. [2004] сопровождается усилением клатрин-опосредованного эндоцитоза NMDA
