Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о механизмах действия и клиническое применение препаратов интерферона и индукторов ин терферона при папилломавирусной инфекции гениталий
1.1. Механизмы действия препаратов интерферона и индукторов интерферона 10
1.1.1. Препараты интерферона 10
1.1.2. Индукторы интерферона 13
1.2. Роль цитокинов в противовирусной защите организма 16
1.3. Этиопатогенез и клинические проявления папилломавирусной инфекции гениталий 23
1.4. Применение препаратов интерферона и индукторов интерферона при папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов 29
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 36
2.1. Дизайн исследования 36
2.1.1. Распределение больных по группам исследования 36
2.1.2. Лечение 37
2.1.3. Динамический контроль эффективности лечения 38
2.2. Фармакологическая характеристика исследованных препаратов ... 38
2.2.1. Генферон 39
2.2.2. Йодантипирин 40
2.3. Клиническая характеристика больных 42
2.4. Методы исследования 47
2.4.1. Наружный осмотр 48
2.4.2. Исследование тканей на присутствие ДНК ВПЧ 49
2.4.3. Исследование иммунного статуса 50
2.4.4. Определение уровня цитокинов в крови 52
2.5. Статистическая обработка результатов 55
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
3.1. Влияние генферона, йодантипирина и их комбинированного при менения на клинические симптомы и течение папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов 57
3.2. Особенности иммунного статуса больных папилломавирусной инфекцией гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6,11 типов, после лечения генфероном, йодантипирином и их комбинацией 63
3.3. Динамика уровня цитокинов в крови больных папилломавирусной инфекцией гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, после лечения генфероном, йодантипирином и их комбинацией 67
3.4. Влияние генферона, йодантипирина и их комбинированного применения на элиминацию вируса папилломы человека 6, 11 типов из пораженных тканей 73
3.5. Побочные эффекты генферона, йодантипирина и их комбиниро ванного применения при лечении папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов 75
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 79
4.1. Клинические эффекты генферона, йодантипирина и их комбинированного применения при папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6,11 типов 82
4.2. Иммунотропное влияние генферона, йодантипирина и их комбинированного применения при папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов 88
4.3. Тактика применения генферона, йодантипирина и их комбинации при папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов 100
Заключение 102
Выводы 104
Практические рекомендации 105
Библиографический список 106
- Роль цитокинов в противовирусной защите организма
- Фармакологическая характеристика исследованных препаратов
- Определение уровня цитокинов в крови
- Динамика уровня цитокинов в крови больных папилломавирусной инфекцией гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, после лечения генфероном, йодантипирином и их комбинацией
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема папилломавирусной инфекции человека в последние годы приобрела особую значимость, что обусловлено высокой контагиозностью, широкой распространенностью и онкогенным потенциалом ее возбудителя - вируса папилломы человека [Скрипкин Ю.К. и соавт., 1998; Александрова Ю.Н. и соавт., 2000; Jenkins D., 2001; Новик В.И., 2002]. Число инфицированных людей в мире за последнее десятилетие увеличилось более чем в 10 раз, в России регистрируется 34 случая папилломавирусной инфекции на 100 000 населения. Папилломавирусной инфекции подвержены люди всех возрастных групп, но пик заболеваемости приходится на репродуктивный период, что представляет серьезную медико-социальную проблему [Скрипкин Ю.К. и соавт., 1998; Адаскевич В.П. и соавт., 2003; Кулаков В.И., 2003; Исаков В.А. и соавт., 2007]
В общей структуре заболеваемости папилломавирусной инфекцией большую долю занимают поражения генитальной области. Папилломавирус-ные инфекции гениталий вызывает вирус папилломы человека низкоонко-генных (6, 11, 44, 53) и высокоонкогенных (16, 18, 31,33) типов. Инфицирование сопровождается иммунодефицитом, снижает противовирусную защиту, что способствует персистенции возбудителя и рецидиву заболевания [Du-puy С. et al., 1997; Дубенский В.В. и соавт., 2003; Роговская СИ., 2003]. В связи с этим в настоящее время оптимальной тактикой лечения папилломавирусной инфекции считается иммунокорригирующая терапия, направленная на активацию механизмов противовирусного иммунитета, в котором важнейшую роль играет система интерферона. Интерфероны участвуют в реакциях неспецифического противовирусного ответа и регулируют опосредованные лимфоцитами специфические механизмы, направленные на элиминацию вирусов [Arany I. et al., 1998; Ермоленко Д.К. и соавт., 2003; Дмитриев Г.А. и соавт., 2006; Бурместер Г.Р. и соавт., 2007; Исаков В.А., Ермоленко Д.К.идр.,2007].
Широкий спектр действия интерферонов, лежащий в основе их противовирусного, иммуномодулирующего и антипролиферативного эффектов, обосновал применение препаратов интерферона и индукторов интерферона при папилломавирусной инфекции гениталий [Сухих Г.Т. и соавт., 2000; Уд-жухуВ.Ю. и соавт., 2005]. Это позволило существенно повысить эффективность лечения, но не решило проблему рецидивирования, что связано со сложным иммунопатогенезом, трудностью своевременной диагностики ранних стадий папилломавирусной инфекции, отсутствием общепринятых подходов к интерферонотерапии и критериев ее эффективности. Кроме того, фармакологические свойства препаратов интерферона и индукторов интерферона при различных формах папилломавирусной инфекции гениталий изучены недостаточно. Это диктует необходимость расширения знаний об особенностях лечебного действия данных групп препаратов с целью разработки патогенетически обоснованных подходов к их применению.
Цель исследования. Изучить особенности действия и обосновать тактику применения препарата интерферона генферона и индуктора интерферона йодантипирина при различных формах папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6,11 типов.
Задачи исследования:
Оценить клиническую эффективность генферона, йодантипирина и их комбинации при различных формах папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов.
Выявить особенности изменений иммунного статуса и содержания цитокинов в крови больных с различными вариантами течения папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека б, 11 типов, до и после лечения генфероном, йодантипирином и их комбинацией.
Разработать тактику применения генферона и йодантипирина при различных вариантах течения папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов.
7 Научная новизна.
С использованием современных методов исследования проведена сравнительная оценка клинической эффективности препарата интерферона (ген-ферон) и индуктора интерферона (йодантипирин) и их комбинации при различных вариантах течения папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6,11 типов. Показано, что при клинически выраженных формах папилломавирусной инфекции гениталий (первый эпизод, рецидивирующее течение кондиломатоза) генферон после деструкции кондилом быстро и эффективно купирует клинические симптомы, но мало эффективен для профилактики рецидивов инфекции; йодантипирин проявляет низкую активность в период клинических проявлений, но существенно снижает частоту рецидивирования инфекции; комбинированное применение генферона и йодантипирина сочетает клинические эффекты монотерапии: купирует клиническую симптоматику и предупреждает развитие рецидивов. Монотерапия генфероном или йодантипирином эффективна для профилактики манифестации папилломавирусной инфекции гениталий при бессимптомном вирусоносительстве вируса папилломы человека 6, 11 типов.
При папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, генферон существенно не влияет на иммунологический статус и концентрацию цитокинов в крови пациентов, йодантипирин стимулирует выработку а-, В-, у- интерферонов, восстанавливает баланс провоспалительных (интерлейкин-2, фактор некроза опухолей-а) и противовоспалительных (интерлейкин-10) цитокинов.
Установлено, что при комбинированной терапии йодантипирином и генфероном папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, не увеличивается частота побочных эффектов, регистрируемых при монотерапии.
Практическая значимость работы.
Разработан и внедрен в клиничекую медицину алгоритм применения генферона и йодантипирина при генитальной папилломавирусной инфекции,
8 вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, в зависимости от характера течения инфекции. При бессимптомном носительстве вируса папилломы человека 6, 11 типов, первом клиническом эпизоде кондиломатоза эффективно раздельное применение генферона и йодантипирина в сочетании с удалением кондилом. При рецидивирующем кондиломатозе необходимо проведение комбинированной терапии генфероном и йодантипирином. Положения, выносимые на защиту.
При папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6,11 типов, генферон после деструкции кондилом купирует клинические симптомы, но не предотвращает развития рецидивов; йо-дантипирин эффективен для профилактики рецидивов.
При папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, генферон существенно не влияет на иммунологический статус, лишь повышает в крови больных концентрацию а-интерферона; йодантипирин проявляет выраженную иммуномодулирующую активность, повышает в крови уровень а-, В-, у- интерферонов, восстанавливает баланс провоспалительных (интерлейкин-2, фактор некроза опухолей-а) и противовоспалительных (интерлейкин-10) цитокинов.
При клинических формах папилломавирусной инфекции гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов (первый клинический эпизод, рецидивирующее течение кондиломатоза) необходимо применять комбинированную терапию генфероном и йодантипирином при одновременном удалении кондилом; при бессимптомном вирусоносительстве генферон и йодантипирин в одинаковой степени ускоряют элиминацию вирусов из кожи и слизистых оболочек гениталий и предупреждают манифестацию инфекции.
Реализация результатов работы. По результатам работы получен 1 патент РФ на изобретение «Комплексный способ лечения остроконечных кондилом аногенитальной локализации» (№ 2341258 от 20.12.2008 г.). Результаты диссертационного исследования используются при лечении больных на кафедрах дерматовенерологии и акушерства и гинекологии Сибир-
9 ского государственного медицинского университета, в клиниках Томского военно-медицинского института, медицинском объединении «Здоровье» г. Томска.
Апробация работы. Материалы работы обсуждались на заседании кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета (2006-2008), областной научно-практической конференции «Рак шейки матки: проблемы ранней диагностики» (Томск, 2005), Российской научно-практической конференции «Здоровье девочки, девушки, женщины» (Томск, 2006), научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Томского военно-медицинского института «Актуальные вопросы медицинского обеспечения войск, подготовки и усовершенствования военно-медицинских кадров» (Томск, 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), XII Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Дерматовенерология Сибири: наука и практика» (Новосибирск, 2008), межрегиональной научно-практической конференции «Основные направления и пути снижения материнской и перинатальной смертности в Сибирском федеральном округе в рамках национального проекта «Здоровье» (Новосибирск, 2008), XIII региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы охраны репродуктивного здоровья подростков и молодежи» (Томск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 260 источников (186 отечественных и 74 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 4 рисунками.
Роль цитокинов в противовирусной защите организма
Вирусное инфицирование организма человека запускает многокаскадный механизм противовирусной защиты, в котором важнейшую роль выполняет система ИФН - а-, В-, у-ИФН, их гены, репрессоры, специфические клеточные интерфероновые рецепторы и активируемые при взаимодействии ИФН с рецепторами ферментные системы [Кузнецов В.П., 1987; Pestka S. et al., 1987; Dianzani F., 1993; Muller U. et al., 1994; Чекенев СБ., 1996; Волкова M.A., 1999]. ИФН - гетерогенный класс белков, продуцируемых в ответ на воздействие различных агентов (индукторов) и способных подавлять репро дукцию широкого круга вирусов. ИФН являются эндогенными иммуномоду-ляторами, оказывающими как стимулирующий, так и ингибирующий эффекты в зависимости от дозы и продолжительности воздействия [Кузнецов В.П., 1998; Роговская СИ., 2003]. Индукция синтеза ИФН в натуральных киллерах, клетках моноцитар-ного ряда, а .также в дендритных клетках под воздействием инфекционных агентов предшествует формированию специфических иммунных реакций и является сущностью неспецифического иммунного ответа. Специфические защитные эффекты ИФН реализуются при участии Т-хелперов (Th) I или II типов [Тазулахова Э.Б., 1980; Ершов Ф.И., 1996; Gollob J.A. et al., 1998; Пащенков М.В. и соавт., 2002]. Клетки организма человека синтезируют ИФН трех классов: лейкоцитарный (а-ИФН), фибробластный ф-ИФН), иммунный (у-ИФН) [Ершов Ф.И. и соавт., 2005]. С учетом эффектов они распределены на два типа: I тип (а-ИФН и р-ИФН) и II тип (у-ИФН). Для а- и [3-ИФН в большей степени характерны противовирусные свойства, для - у-ИФН - иммунорегуляторные и ан-типролиферативные. Считается, что у-ИФН действует как супрессор иммунитета [Кузнецов В.П., 1989; Baron S. et al., 1991; Gazzinelli R., 1996; Ари-ненко Р.Ю. и соавт., 1997]. Биологическое действие ИФН универсально: цитокины активны в отношении ДНК- и РНК-содержащих вирусов. ИФН обладают специфической тканевой активностью (активны только в гомологичных структурах) и последействием (в обработанных клетках репликация вирусов подавляется даже после удаления ИФН) [Рафальский В.В., 1997; Кузнецов В.П., 1998].
Противовирусные (неспецифические) механизмы действия ИФН заключаются в стимуляции продукции противовирусных белков в интактных клетках; активации естественных киллеров (NK-клеток), приводящей к лизису пораженных вирусом клеток; активации макрофагов [Покровский В.И. и соавт., 1986; Парфенов В.В. и соавт., 1990; Dianzani F., 1993; Ляшенко, В.А., 1995; Ляшенко В.А. и соавт., 1998; Змызгова, А.В., 2002; Волкова Л.В. и со-авт., 2007]. В остром периоде инфекции уровень ИФН в крови значительно повышается, при хроническом инфекционном процессе их продукция находится на обычном уровне [Ершов Ф.И и соавт., 1996; Роговская СИ., 2003]. Система ИФН функционирует как цепная реакция: индукция, в результате которой дерепрессируются гены ИФН и происходит транскрипция информационных РНК с последующей трансляцией синтеза белка на рибосомах; синтез ИФН; защита ИФН клеток путем подавления трансляции чужеродных РНК или разрушения их с помощью эндогенных нуклеаз [Ершов Ф.И. и соавт., 2005]. Установлено, что в норме гены ИФН репрессированы, их тракскрипция начинается только после индуцирующего воздействия. При этом индуктор не взаимодействует с генами ИФН прямо, а включает систему ядерных интер-феронрегулирующих факторов [Stark G.R. et al., 1998]. Чувствительность клеток к ИФН определяется рецепторной системой, кодированной для ИФН I типа в хромосоме 21, для у-ИФН - в хромосоме 6 [Кузнецов В.П., 1998]. ИФН I типа связываются с общими рецепторами, расположенными на поверхности клеток-эффекторов [Lutfalla G. et al., 1992]. Для адекватного сигнала используются, в основном, интерфероновые рецепторы I типа: IFNAR 1 (Interferon activation receptor) и IFNAR 2с [Lutfalla G. et al., 1995]. Количество рецепторов на клеточной мембране - величина динамическая, колеблется от сотен до десятков тысяч в зависимости от происхождения клетки и обратно пропорциональна уровню ИФН. Недостаток рецепторов ИФН I типа существенно снижает противовирусную защиту организма. у-ИФН связывается с другим рецептором, состоящим из двух субъединиц IFNAR 1 и IFNAR 2 [Кузнецов В.П., 1998; Ершов Ф.И.и соавт., 2005; Svens-son A. et al., 2006]. После соединения ИФН с обеими субъединицами интерферонового рецептора активируются интерферонзависимые гены, главными из них являются гены 2 ,5 -олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы фактора инициации синтеза белка (eiF2). Активность 2 ,5 -олигоаденилатсинтетазы проявляется в присутствии двуспиральной РНК - промежуточного продукта вирусной репликации. Этот фермент катализирует синтез коротких моно-, ди-, три- и тет-раполиаденилатов на основе АТФ с 2 ,5 -фосфодиэфирной связью.
Последние активируют клеточные эндонуклеазы, в частности, РНКазу L. Эта нук-леаза предотвращает считывание чужеродной генетической информации, так как эффективно разрушает моноспирали вновь синтезируемой (вирусной) РНК [Соколова Т.М. и соавт., 1991; Carpick В. W. et al., 1997; Кузнецов В.П., 1998]. Другим противовирусным механизмом действия ИФН является активация протеинкиназы фактора инициации синтеза белка (eiF2), в присутствии дсРНК. Фосфорилирование eiF2 с участием АТФ полностью останавливает синтез нового белка, в том числе белков вириона [Carpick B.W. et al., 1997]. Противовирусное действие ИФН также связано со стимуляцией экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) I типа на поверхности антигенпрезентирующих клеток [Reis L.F. et al.,1992] и активацией Т-лимфоцитов, проявляющих цитотоксические свойства в отношении клеток, инфицированных вирусом [Boehm U. et al., 1997]. Блокируя ключевые процессы репродукции репликативной формы РНК и белка вирусного нуклеокапсида, ИФН подавляют практически все вирусы. Взаимодействие ИФН с инфицированными клетками обеспечивает быстрое их разрушение цитотоксическими лимфоцитами [Кирдей Е. Г., 2000; Хаитов P.M. и соавт., 2000; Liu Т. et al, 2001; Исаков В.А. и соавт., 2007]. Иммуномодулирующее действие ИФН реализуется посредством активации неспецифических клеточных реакций иммунитета и регуляции функций эффекторов в иммунном ответе. В этой связи система ИФН рассматривается как элемент сложной взаиморегулируемой системы иммунных цитоки-нов [Кузнецов В.П., 1998; Черешнев В.А. и соавт., 2001; Мезенцева М.В. и соавт., 2002; Симбирцев А.С., 2004; Мезенцева М.В., 2006] (табл. 2).
Фармакологическая характеристика исследованных препаратов
Для терапии больных ПВИ гениталий были использованы препараты, соответствующие следующим критериям: - разрешенные для применения на территории Российской Федерации; - наиболее эффективные по сравнению с известными препаратами, используемыми при лечении вирусных инфекций, в том числе урогенитальной локализации; - перспективные в плане расширения области применения. На основании анализа данных литературы и собственного опыта лечебной практики для лечения больных ПВИ гениталий были выбраны интер-феронсодержащий препарат генферон и индуктор эндогенного интерферона йодантипирин (перспективный для лечения ПВИ). Выбор генферона был продиктован и тем обстоятельством, что, несмотря на рекомендацию инструкции применять препарат при ПВИ, сведения о результатах терапии ген-фероном при данной патологии отсутствуют. Генферон (суппозитории по 250 000 ME и 500 000 ME, «Биокад», Россия, регистрационный № 001812/01) — комбинированный препарат, содержащий ИФН-а2, таурин и бензокаин (анестезин). Генферон оказывает местное и резорбтивное действие, проявляет мембраностабилизирующие, гепато-протективные, антиоксидантные и противовоспалительные свойства, связанные с фармакологической активностью его ингредиентов [Серов В.Н. и со-авт., 2006; Уджуху В.Ю. и соавт., 2005]. ИФН-а2 обладает противовирусным, противомикробным и иммуномо-дулирующим действием; повышает активность NK-клеток, Т-хелперов, фагоцитов, активирует дифференцировку
В-лимфоцитов за счет стимуляции лейкоцитов, содержащихся в слизистых оболочках, обеспечивает их активное участие в ликвидации патологических очагов и восстановлении продукции иммуноглобулина (Ig) А. ИФН-а2 непосредственно ингибирует репликацию и транскрипцию вирусов и хламидий. При вагинальном или ректальном применении генферона ИФН-а2 всасывается через слизистую оболочку, поступает в окружающие ткани и лимфатическую систему. Местное действие обу словлено фиксацией на клетках слизистых оболочек. Снижение уровня ИФН в крови через 12 ч после применения генферона обусловливает необходимость его повторного применения. Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) - условно незаменимая аминокислота, участвует в модуляции клеточного уровня ионов кальция, стабилизации антиоксидантного состояния; оказывает репаративное, гепато-протективное, антиоксидантное и противовоспалительное действие [Pasantes-Morales Н. et al., 1984; Нефедов Л.И. и соавт., 1990]. Бензокаин - местный анестетик, препятствует возникновению болевых ощущений. Генферон применяется в составе комплексной терапии при инфекци-онно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта: генитальном герпесе, хламидиозе, уреаплазмозе, микоплазмозе, рецидивирующем вагинальном кандидозе, гарднереллезе, трихомониазе, папилломавирусной инфекции, бактериальном вагинозе, эрозии шейки матки, цервиците, вульвова-гините, бартолините, аднексите, простатите, уретрите, баланите, баланопо-стите. Генферон обладает минимальными побочными эффектами. Его применение допускается во второй половине беременности. Редкими побочными действиями генферона являются: аллергические реакции в виде кожных высыпаний и зуда (исчезают через 72 ч после прекращения введения препарата или уменьшения дозы).
При введении генферона ежедневно в дозах выше 1000000 ME появляются нарушения, типичные для экзогенной интерферони-зации - озноб, лихорадка, утомляемость, анорексия, мышечная и головная боль, боль в суставах, потливость, лейко- и тромбоцитопения. Йодантипирин (таблетки по 100 мг, «Наука Техника Медицина», Россия) (регистрационное удостоверение 96/316/5; ЛС-002505 от 29.12.2006 г.; ЛСР-000055/08 от 17.01.2008 г.). Иодантипирин обладает противовоспалительной, вируснейтрализую-щей, интерферониндуцирующей и иммуномодулирующей активностью [Са-ратиков А.С и соавт., 1975, 2000; Евстропов А.Н. и соавт., 1990; Евстропов А.Н., 1992]. Препарат ингибирует репродукцию РНК- и ДНК-содержащих вирусов при участии генома клетки на стадии транскрипции генетической информации [Саратиков А.С. и соавт., 1975, 1996, 2000; Евстропов А.Н., 1992]. Иодантипирин стимулирует в клетках выработку а-, 6- и у-ИФН. Через 4 ч после его введения экспериментальным животным содержание ИФН в сыворотке крови значительно возрастает и сохраняется на высоком уровне вплоть до 48-72 ч эксперимента за счет стимуляция продукции ИФН лейкоцитами и спленоцитами [Евстропов А.Н., 1992; Саратиков А.С. и соавт., 1996, 1998]. Иодантипирин оказывает мембраностабилизирующее действие, благодаря чему тормозит проникновение вирусов в клетки; повышает синтез вируснейтрализующих антител, стимулирует клеточный иммунитет, увеличивает число зрелых Т-лимфоцитов, NK-клеток и Т-хелперов, тормозит активность Т-супрессоров [Саратиков А.С. и соавт., 1975; Грищенко Л.Н. и соавт., 1990]. Показаниями к применению йодантипирина являются грипп, парагрипп, острые респираторные заболевания, клещевой энцефалит, неполио-миелитные энтеровирусные инфекции Коксаки и ECHO, вирусные везикулярные стоматиты, герпес, геморрагическая лихорадка, цитомегаловирусная инфекция При приеме внутрь иодантипирин быстро попадает в кровь, элиминируется почками. Иодантипирин малотоксичен, не обладает мутагенными, эмбриотоксическими, тератогенными, аллергогенными и иммунотокси-ческими свойствами [Грищенко Л.Н. и соавт., 1990; Лепехин А.В. и соавт., 2000; Саратиков А.С. и соавт., 1996, 1975, 2000].
Определение уровня цитокинов в крови
Уровень а-, Р-, у-ИФН в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Определение уровня а-ИФН в сыворотке крови. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами, которые связывают имеющийся в пробе а-ИФН. Несвязавшийся материал удаляли, связавшийся материал взаимодействовал с пероксидазой хрена после инкубации с конъюгатом антител к а-ИНФ человека. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливали до давлением раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность жёлтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце сс-ИНФ. В работе использовали набор «альфа-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-Бест («Вектор Бест», Новосибирск). Определение проводили с использованием рекомендаций производителя тест-систем. В лунки микропланшета вносили по 100 мкл сыворотки и инкубировали 120 мин при комнатной температуре в шейкере. Затем 5 раз промывали и вносили в лунки по 100 мкл конъюгата. Вновь инкубировали стрипы в течение 60 мин при тех же условиях, после чего снова промывали. На следующем этапе в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и оставляли на 30 мин в темном месте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением в лунки 100 мкл стоп-реагента и немедленно измеряли оптическую плотность. Концентрацию а-ИНФ в пробах определяли по калибровочному графику. Результаты представляли в пг/мл. Определение уровня fi-ИФН в сыворотке крови. Исследование проводили методом твердофазного иммуноферментного «сэндвича» (ELYSA) [Clark R. et al.3 1981]. В работе использовали набор «HuINF-p» (BioSource International, США). Анализ проводили согласно инструкции, предлагаемой производителем тест-системы. 96 лунок микропланшета покрывали аффинно выделенными поликлональными антителами к HuINF-p\ таким образом, первые антитела были иммобилизованы в лунках микропланшета. Антиген ((3-ИФН), присутствующий в исследуемых сыворотках, стандартах и контролях, во время инкубации связывается с первыми антителами. Меченые ферментом моноклональные антитела к HuINF-(3 также связываются с антигеном, образуя «сэндвич» - комплекс «антитело - антиген», состоящий из первых антител, иммобилизованных в лунках микропланшета, антигена HuINF-(3, содержащегося в пробах, и меченных ферментом вторых антител. В качестве фермента в наборе использовали пероксидазу хрена.
Добавление субстрата акти вировало ферментативную реакцию. Количество Р-ИФН, связанного с твёрдой фазой, измеряли по интенсивности развившегося под действием фермента окрашивания. После промывки лунок микропланшета 400 мкл буфера и их последующего осушения в каждую лунку вносили 50 мкл меченых антител и 100 мкл сыворотки. Микропланшет закрывали пленкой и инкубировали 120 мин в шейкере при температуре 20-30 С. После завершения реакции антиген-антитело стрипы трижды промывали буфером. Затем во все лунки вносили 100 мкл рабочего раствора субстрата и инкубировали 30 мин при прежних условиях. Реакцию останавливали стоп-раствором (0,5 моль/л H2SO4). Абсорбцию измеряли при длине волны 450 нм, с помощью микропланшетного ридера фирмы Biorad. Концентрацию Р-ИФН в образцах рассчитывали по калибровочной кривой. Результаты представляли в пг/мл. Определение уровня у-ИФН в сыворотке крови. Для исследования использовали набор «гамма-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-Бест» («Вектор Бест», Новосибирск). В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора для разведения сывороток и исследуемых образцов и инкубировали 2 ч при 37С в шейкере при периодическом встряхивании. После инкубации стрипы промывали 5 раз фосфатно-солевым буферным раствором с твином. Затем добавляли по 100 мкл конъюгата № 1, содержащего биотинилированные антитела к у-ИФН и инкубировали 60 мин при тех же условиях. На следующем этапе вновь выполняли промывку и вносили в лунки по 100 мкл конъюгата № 2, содержащего стрептавидин-пероксидазу хрена, после чего вновь инкубировали 30 мин. После третьей инкубации стрипы промывали, добавляли 100 мкл хромогена и оставляли на 30 мин при комнатной температуре в темном месте. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп-реагента и измеряли оптическую плотность. Результаты представляли в пг/мл. Определение уровня интерлейкшов в сыворотке крови. Количество сывороточных ИЛ-2 и ИЛ-10 определяли методом твердофазного иммунофер
Динамика уровня цитокинов в крови больных папилломавирусной инфекцией гениталий, вызванной вирусом папилломы человека 6, 11 типов, после лечения генфероном, йодантипирином и их комбинацией
Цитокины выполняют важнейшую роль в противовирусном ответе организма, в том числе участвуют в прямых неспецифических реакциях противовирусной защиты и выступают в качестве регуляторов межклеточных взаимодействий в процессе формирования специфического иммунного ответа [Ершов Ф.И. и соавт., 2005]. В ходе динамического наблюдения за пациентками с ПВИ гениталий, вызванной ВПЧ 6, 11 типов, нами было исследовано содержание ряда цитокинов, играющих ключевую роль в противовирусной защите организма. В результате было установлено, что при бессимптомном вирусовыделении со У пациенток с первым клиническим эпизодом ПВИ уровень а-, В- и у ИФН, ИЛ-2 и ФНО-а в крови был соответственно в 4,6; 5,6; 5,7 и 1,5 раза выше, концентрация ИЛ-10 - в 2,2 раза ниже, чем у здоровых доноров. При рецидивирующем течении кондиломатоза изменения цитокинового статуса отличались противоположной направленностью: содержание в крови а-, В-, у-ИФН, ИЛ-2 и ФНО-а были ниже соответствующих показателей здоровых доноров в среднем в 1,5; 2,8; 9,5; 3 и 2,8 раза при одновременном повышении содержания ИЛ-10 в 3,8 раза (табл. 18). Выявленные изменения свидетельствуют об активации цитокинового звена иммунитета при бессимптомном вирусоносительстве и впервые возникшем заболевании и угнетении цитокиногенеза при рецидивирующей форме инфекции. Лечение больных ПВИ гениталий, вызванной ВПЧ 6, 11 типов, изменяло соотношение цитокинов в крови. Результаты интерферонотерапии варьировали при разных клинических формах ПВИ, что объясняется особенностями исходного содержания цитокинов в крови при различных формах заболевания. Через 40 сут после начала наблюдения в крови у пациенток с бессимптомным вирусоносительством, лечившихся генфероном, в среднем в 4 раза повышался уровень а-ИФН, на 29% - концентрация у-ИФН, на 60% снижалось содержание В-ИФН, на 70% - ИЛ-2, на 53% - ИЛ-10 (табл. 19). Через 3 мес от начала лечения в крови у пациенток данной группы уровень а-ИФН уменьшался и достигал среднестатистической нормы, возникала положительная динамика уровней В-ИФН, ИЛ-2 и отрицательная — концентрации у-ИФН, ИЛ-2 и ФНО-а. Содержание противовоспалительного цито-кина ИЛ-10 существенно не изменялось. Прием йодантипирина женщинами с бессимптомным носительством ВПЧ 6, 11 типов повышал в крови уровень провоспалительных цитокинов, в том числе а-, В-, у-ИФН, ИЛ-2, снижал концентрацию ФНО-а и ИЛ-10, выполняющего роль «ингибитора цитокинов» и участвующего в формировании гуморального иммунного ответа [Бурместер Г.Р. и соавт., 2007]. Эффект терапии был продолжительным, так что выявленные изменения сохранялись и через 3 мес от начала лечения (табл. 19).
При комбинированной терапии йо-дантипирином и генфероном бессимптомной формы ПВИ гениталий, вызванной ВПЧ 6, 11 типов, регистрировались сдвиги изученных показателей цитокинового статуса, такие же как при раздельном приеме препаратов. При этом отмечалось повышение уровня всех изученных провоспалительных цитокинов и снижение уровня ИЛ-10. Важно отметить, что при данном лечении значительно возрастал уровень а-ИФН и В-ИФН, что в целом можно расценить как «суммирование» фармакологических эффектов генферона и йодантипирина (табл. 19). У больных с первым клиническим эпизодом кондиломатоза гениталий через 40 сут после лечения генфероном отмечались разнонаправленные изменения содержания цитокинов в крови: на фоне сохранения исходно высокого уровня а-ИФН и ИЛ-2, выявленного до начала лечения, снижался уровень В-, у-ИФН, повышалась концентрация ИЛ-10 и ФНО-а. В эти же сроки исследования особенностью действия йодантипирина у пациенток с аналогичной формой ПВИ явилось изменение в сторону нормы содержания а- и у-ИФН, повышение уровня ИЛ-10, снижение ниже нормы количества ФНО-а при стабильно высокой концентрации ИЛ-2 (табл. 20). Через 3 мес от начала приема йодантипирина определялись признаки нормализации содержания цитокинов в крови пациенток: уровень у-ИФН и ФНО-а приближался к показателям здоровых доноров, остальные параметры сохранялись статистически значимо измененными (табл. 20). Комбинированная терапия больных с впервые выявленной ПВИ гениталий в большей степени, чем при монотерапии йодантипирином и генферо-ном нормализовала уровень цитокинов в крови. Через 40 сут от начала лечения в крови пациенток повышался уровень а-, В-, у-ИФН, ИЛ-2, ИЛ-10, снижалась концентрация ФНО-а. Через 3 мес после начала терапии характер ци-токинограмм указывал на восстановление уровня у-ИФН, ИЛ-10, ФНО-а. Сохранялось повышенное содержание а- и В-ИФН - провоспалительных ци-токинов неспецифического противовирусного ответа (табл. 20). При рецидивирующей форме ПВИ гениталий, характерной особенностью которой была наиболее выраженная (по сравнению с остальными формами течения инфекции) дисцитокинемия с преобладанием противовоспалительного ИЛ-10, лучший терапевтический эффект достигался после применения комбинированной терапии. У больных через 40 сут от начала лечения в крови повышалась концентрация провоспалительных цитокинов - а-, В-, у-ИФН, ИЛ-2, ФНО-а, снижалась концентрация ИЛ-10. Исследование через 3 мес от начала наблюдения свидетельствовали о сохраняющихся эффектах терапии (табл. 21).
