Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1 Клиническая фармакология аминогликозидов 11
1.1.1 Общие сведения 11
1.1.2 Механизмы действия аминогликозидов на микроорганизмы . 1 3
1.1.3 Механизмы резистентности 15
1.1.4 Фармакокинетика 18
1.1.5 Факторы, влияющие на фармакокинетические параметры...22
1.1.6 Нежелательные реакции аминогликозидов 24
1.1.7 Выбор режима дозирования 26
1.2 Использование аминогликозидов в урологии 30
1.2.1 Инфекции мочевыводящих путей 30
1.2.2 Пер и операционная антибиотико профилактика 32
ГЛАВА II. Материалы и методы
2.1 Объём и методы исследования 35
2.2 Характеристика пациентов группы превентивной антибиотикотерапии 41
2.3 Характеристика группы пациентов с клиническими проявлениями инфекций мочевыводящих путей 46
2.4 Определение аминогликозидмодифицирующих ферментов 49
2.5 Статистический анализ 52
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение
3.1 Анализ фармакокинетических параметров нетилмицина 53
3.1.1 Исследование фармакокинетики нетилмицина в сыворотке крови 53
3.1.2 Исследование фармакокинетики нетилмицина в ткани предстательной железы 59
3.1.3 Анализ эффективности различных режимов превентивной антибиотикотерапии 65
3.2 Фармакодинамическое обоснование применения нетилмицина в урологическом стационаре 69
3.2.1 Анализ структуры и резистентности возбудителей инфекций мочевыводящих путей 69
3.2.2 Анализ механизмов резистентности 72
3.2.3 Анализ эффективности нетилмицина при лечении инфекций мочевыводящих путей в урологическом стационаре 76
Заключение 87
Выводы 94
Практические рекомендации 96
Список литературы
- Механизмы действия аминогликозидов на микроорганизмы
- Характеристика пациентов группы превентивной антибиотикотерапии
- Исследование фармакокинетики нетилмицина в ткани предстательной железы
- Анализ эффективности нетилмицина при лечении инфекций мочевыводящих путей в урологическом стационаре
Механизмы действия аминогликозидов на микроорганизмы
Основные представители антибиотиков-аминогликозидов, широко применяемые в клинической практике, содержат в своём составе 2-дезоксистрептамин. Последний сам по себе не обладает биологической активностью. Но при введении остатков различных аминосахаров одновременно в положении 4 и 5, или 4 и 6 отмечается достаточно высокая активность [16,21]. Производные дезоксистрептамина, замещённого по положениям 4 и 5. Наиболее известные представители этой группы - неомицины, главным из которых является неомицин В, полученный в 1949 г. из культуры Streptomyces fradiae. Неомицин применяют только местно из-за высокой токсичности. Производные дезоксистрептамина, замещённого по положениям 4 и 6.
Эта группа антибиотиков получила наиболее широкое распространение в клинике. Первым представителем этой группы, используемым в медицине, был канамицин А, полученный в 1957 г. из культуры Streptomyces kanamyceticus. В 1963 г. из культуры Micromonospora purpurea был выделен гентамициновый комплекс, содержащий гентамицины Сь Cia, Со [16]. Позже в медицинскую практику были введены тобрамицин и сизомицин. В дальнейшем был синтезирован амикацин.
Позднее был синтезирован нетилмицин, или 1-N-этилсизомицин. Не-тилмицин обладает более широким спектром действия, чем гентамицин. Его главным приемуществом является меньшая токсичность. Нетилмицин является полусинтетическим производным гентамицина Сіл, имеет молекулярную формулу С 21Н41 N5 О7. Он практически не связыавется с белками плазмы, гидрофилен, не подвергается метаболизму; эффективен в отношении некоторых гентамицинустойчивых штаммов микроорганизмов.
Нетилмицин обладает широким спектром активности, включающим представителей семейства Enterobacteriaceae, неферментирующие грам (-) бактерии, такие как Acinetobacter spp. [20]. Безусловным преимуществом не-тилмицина является низкая токсичность. Его нефротоксичность варьирует в пределах 2,8% (по сравнению с 8-11% для других аминогликозидов); ототок-сичность 2,3% (по сравнению с 8-14% для других аминогликозидов)[49, 17].
Аминогликозиды обладают бактерицидным действием, которое связано с нарушением синтеза белка рибосомами [16, 65]. Выделяют четыре подгруппы антибиотиков в соответствии с тем, на какую стадию синтеза белка они действуют: 1) Ингибиторы активации аминокислот и реакций переноса. 2) Ингибиторы функций малых субъединиц рибосом (30S). 3) Ингибиторы функций больших субъединиц рибосом (5OS). 4) Ингибиторы внерибосомальных факторов. Все аминогликозиды относятся к ингибиторам малых субъединиц рибосом. Аминогликозиды нарушают считывание информации в бесклеточной системе синтеза белка, т.е. индуцируют включение ошибочных аминокислот в растущую полипептидную цепь. Бактерицидное действие антибиотика является следствием высокого сродства его к соответствующему участку рибосомы, что приводит к необратимому связыванию антибиотика с рибосомами и к необратимой их инактивации [16]. Проявление активности аминогликозидов чрезвычайно зависит от механизма их проникновения в бактериальные клетки-мишени. Будучи заряженными и гидрофильными, антибиотики не могут проходить через мембраны путём диффузии. Поэтому для проникновения внутрь бактериальной клетки используется система электронного транспорта полиаминов, обеспечивающая нормальное функционирование грам (-) бактерий [16, 25].
В настоящее время показано, что проникновение аминогликозидов в микробную клетку представляет собой трёхфазный процесс [58]. Первая фаза - электростатическое связывание с анионными компонентами клеточной стенки - не требующий затрат энергии процесс. Доказано, что при контакте с внешней мембраной наблюдается явление самопромотирования проникновения аминогликозидов. Комплексонообразование с магнием ведёт к извлечению его ионов, находящихся на наружной поверхности и кодирующих взаиморасположение липополисахаридов [25]. Молекулярная организация внешней мембраны нарушается, что облегчает проникновение аминогликозидов в периплазматическое пространство. Наличие защитных ферментов не влияет на первую фазу.
Дальнейший путь аминогликозидов к их внутренней мишени (рибосоме) связан с проникновением через цитоплазматическую мембрану и энергозависим - вторая фаза (энергозависимая фаза I). Во время этой фазы через мембрану проникает незначительное количество антибиотика, не приводящее к гибели клетки. Это небольшое количество аминогликозидов, реагируя с частью рибосом, индуцирует «массивное» поглощение антибиотика, вероятно, за счёт активации системы транспорта полиаминов. На эту фазу влияет ряд факторов, из которых наиболее важным является анаэробиоз. Аминогли-козиды не эффективны в отношении облигатных анаэробов, а так же факультативных аэробов при отсутствии кислорода в среде [25].
Характеристика пациентов группы превентивной антибиотикотерапии
Пациентам назначался нетилмицин в дозировке 7,5 мг/кг однократно в сутки в/м или в/в в виде монотерапии. У пациентов с избыточной массой тела препарат назначался исходя из «идеальной» массы (Behnke, Willmore, 1975): -для мужчин: идеальный вес = l,lxW-128x(W /Н ) -для женщин: идеальный вес = l,07xW-148x(W2/H2), где W - фактическая масса тела (кг); Н - рост (см). Поскольку аминогликозиды относятся к группе потенциально нефро-токсичных препаратов и элиминируются путём клубочковой фильтрации, то их дозировку коррелировали с уровнем клубочковой фильтрации, рассчитываемой по формуле Кокрофта и Голта: -для мужчин: КК(мл/мин) = масса тела (кг) х (140-возраст) / клиренс креатинина (цмоль/л) х 0,8 -для женщин: КК(мл/мин) = [масса тела (кг) х (140-возраст) / клиренс креатинина (цмоль/л) х 0,8] х 0,85 где W - фактическая масса тела (кг); Н - рост (см). Продолжительность терапии нетилмицином составляла 7-Ю дней в зависимости от состояния пациента. На фоне лечения на 3, 5 сутки и по окончании терапии выполнялись контрольные анализы крови, мочи, оценивался уровень клубочковой фильтрации, и проводилась необходимая корректировка дозы препарата.
Клиническая эффективность антибактериальной терапии оценивалась на основании общего состояния, динамики базисных симптомов заболевания, результатов дополнительных методов исследования и лабораторных показателей, пользуясь следующей шкалой (ESMID, 1993):
Эффективен - исчезновение основных объективных и субъективных симптомов заболевания к концу лечения. Неэффективен - отсутствие положительной динамики основных симптомов заболевания или ухудшение состояния больного. Невозмоэюно оценить - прекращение терапии в связи с ухудшением состояния больного или при выявлении любых других обстоятельств, оправдывающих исключение больного из исследования.
Бактериологическая эффективность антибактериальной терапии оценивалась по ее действию на возбудитель инфекции по следующей шкале (ESMID,1993). Полная элиминация - основной патогенный микроорганизм полностью исчезает. Персистенция - патогенные организмы сохраняются. Суперинфекция - основной возбудитель исчезает, но заменяется новым патогенным организмом. Рецидив - повторный случай заболевания с выделением того же вида и типа возбудителя. Невозможно оценить - возбудитель неизвестен или неизвестна его судьба.
Для проведения сравнительной оценки резистентности к нетилмицину возбудителей амбулаторных ИМП в исследование так же были включены 170 пациентов (средний возраст 54,3 ± 19,2 лет), находившихся на амбулаторном лечении в МЛПУ «Поликлиника № 3» г.Смоленска. Критерии включения в исследование:
Материалом для исследования являлись анамнестические сведения, жалобы пациентов, сведения, полученные из амбулаторных карт и историй болезни, а также образцы мочи, для бактериологического исследования. При обследовании образцов мочи использовали среднюю порцию утренней свободно выпущенной мочи, полученной после туалета наружных половых органов.
При выявлении резистентности выделенных уропатогенов к нетилмицину проводилось изучение механизмов резистентности.
В исследование было включено 63 штамма аэробных грам (-) микроорганизмов, выделенных у пациентов с ИМП: P.aeruginosa (4/6,9%), P.mirabilis (16/26,5%), E.coli (35/53,9%), K.pneumoniae (5/7,9%), A.baumanii (1/1,6%), M.morganii (1/1,6%), P.rettgery (1/1,6%).
Для определения типов аминогликозидмодифицирующих ферментов использовали фенотипический метод, основанный на соответствии профиля резистентности исследуемого микроорганизма субстратной специфичности вырабатываемого фермента. Для этого из суточных культур микроорганизмов готовили гомогенную бактериальную взвесь, соответствующую стандарту мутности 0,5 McFarland, используя для этого физиологический раствор. Бактериальную взвесь наносили тампоном Falcon (BBL, США) на поверхность агара Mueller-Hinton (BBL, США) в трех различных направлениях. Чашки с нанесенным инокулюмом оставляли на 10 минут для абсорбции. Далее, на инокулированную поверхность агара наносили диски со следующими антибиотиками (по 4 диска на чашку диаметром 100 мм): фортимици-ном (Fm, 100 мкг/диск), б -этилнетилмицином (6Nt, 100 мкг), 2 -этилнетилмицином (2Nt, 100 мкг), 5-0Н-эписизомицином (5Ss, 10 мкг), ап-рамицином (Am, 100 мкг), исепамицином (Im, 30 мкг), амикацином (30 мкг), гентамицином (10 мкг), тобрамицин (10 мкг), неомицином (30 мкг), нетил-мицином (Nt, 30 мкг) и канамицином (30 мкг). Диски с фортимицином, б -этилнетилмицином, 2 -этилнетилмицином, 5-ОН-эписизомицином, апрами-цином были любезно предоставлены профессором G.Miller (Schering Corp., Bloomfield, N.J., США). Диски с исепамицином, амикацином, гентамицином, тобрамицин, неомицином, нетилмицином и канамицином были коммерческого изготовления (BBL, США). После инкубирования в течение 18 часов
при 37С проводили измерение зон ингибиции роста с помощью линейки. Диаметры зон подавления роста вокруг дисков с антибиотиками интерпретировались как уровни чувствительности исследуемых штаммов.
Типы аминогликозидмодифицирующих ферментов определяли по методике G.Miller [91]. Принцип определения изложен в таблицах 8, 9. Для определения типов аминогликозидмодифицирующих ферментов использовался набор из 12 антибиотиков этой группы. Дополнительно для изучения типов продуцируемых штаммами аминогликозидфосфотрансфераз с помощью метода разведения в агаре определяли МПК ливидомицина (Lm) и бутирозина (Вт.) для тестируемых возбудителей. Для контроля качества проводимого исследования использовали контрольные штаммы Е.соН АТСС 25218 и P.aeruginosa АТСС 27853.
Исследование фармакокинетики нетилмицина в ткани предстательной железы
По литературным данным [12] уровень резистентности Е.соИ, P.mirabilis, K.pneumoniae, P.aeruginosa к нетилмицину составляет: E.coli -13,3-46,8%; резистентность К. pneumoniae - 66.7%; резистентность P.aeruginosa - 59,5-72,5%. Уровень резистентности P.mirabilis составляет - 61,2-72,2%, что, в целом, совпадает с полученными нами данными.
Таким образом, на основании проведенных исследований установлено, что наиболее часто встречающимися микроорганизмами -возбудителями ИМП в урологическом стационаре СОКБ — являются E.coli, P.mirabilis, а так же P.aeruginosa и K.pneumoniae.
По результатам бактериологического исследования выявлено, что уровень резистентности у Е.соИ наименьший и составил 11%. Уровень резистентности P.mirabilis составил 63%. P.aeruginosa была резистентна к нетилмицину в 50%; К. pneumoniae - в 66% случаев. Учитывая важное место антибиотиков-аминогликозидов в лечении ИМП, вызываемых аэробными грам (-) бактериями, а так же принимая во внимание достаточно высокий уровень резистентности уропатогенов к данному классу антибиотиков, безусловно, важным является изучение и оценка механизмов резистентности.
При исследовании механизма резистентности показано, что основным механизмом является продукция уропатогенами модифицирующих ферментов. Наиболее распространёнными ферментами явились AAC(3)V и АРН(3 )1, которые были выделены у 27% и 21% штаммов соответственно. Далее по частоте встречаемости следовали такие ферменты, как: ANT(2") - 6%; APH(3 )VI - 6%; AAC(6 )I - 3%; AAC(3)IV - 1,5%; AAC(2 )I - 1,5% (рис.11). % зсь 21 AAC(3)V APH(3 )I ANT(2") APH(3 )VI AAC(6 )I AAC(3)IV ACC(2 )I Рис.11. Распространённость различных типов АГМФ у выделенных уропатогенов В результате продукции ацетилтрансферазы AAC(3)V штаммы обладали перекрёстной резистентностью к гентамицину, не-тилмицину и тобрамицину.
Фосфотрансфераза АРН(З ) I обусловливала резистентность лишь к пердставителям 1 поколения - канамицину и неомицину. Фермент ANT(2") обеспечивал бактериям устойчивость против гентамицина и тобрамицина, при сохранении чувствительности к нетимицину и амикацину.
Ацетилтрансфераза AAC(3)IV - в клинической практике аналогичен ферменту ААС(3)1: он обеспечивал бактериям резистентность в отношении гентамицина. К тобрамицину, нетилмицину и амикацину такие микроорганизмы сохраняют чувствительность.
Фософотрансфераза APH(3 )VI обеспечивала бактериям, их продуцирующим, устойчивость к канамицину, амикацину и изепа-мицину.
Многие микроорганизмы продуцировали не один, а два и более ферментов. Наиболее распространённой была комбинация: AAC(3)V + АРН(3 )Т, которая детерминировала резистентность к представителям 1 и 2 поколений аминогликозидов. Чувствительность к аминогликозидам 3 поколения сохраняется.
Комбинация AAC(6 )I + AAC(3)V - обеспечивала штаммам-продуцентам устойчивость против аминогликозидов 2 и 3 поколений, хотя данные штаммы и сохраняли чувствительность к канамицину и неомицину.
Комбинации ААС(6 )1 + АРН(3 )1 и AAC(3)V + APH(3 )VI -обеспечивали резистентность штаммов ко всем аминогликозидам, применяемым в клинике.
Комбинация ферментов AAC(3)IV + АРН(3 )Т - вызывала резистентность к представителям первого поколения и к гентамици-ну; при этом сохранялась чувствительность к тобрамицину, нетилмицину и к аминогликозидам 3 поколения.
Достаточно редкой была комбинация из 3 ферментов: AAC(3)V + APH(3 )VI + АРН(З )!, которая встречалась у трёх штаммов и обеспечивала им устойчивость в отношении всех применяемых в клинике аминогликозидов.
В дальнейшем был проведен анализ субстратного профиля выделенных ферментов. Учитывая, что различия между микроорганизмами в типах продуцируемых ферментов были незначительными, фенотипы резистентности представлены безотносительно к конкретному возбудителю.
В результате анализа выявлены следующие фенотипы резистентности (рис.12): уропатогены, резистентные ко всем применяемым в клинике аминогликозидам выявлялись в 8%. По литературным данным этот уровень составляет 9,8% - 25,9% [23]. Уропатогены, резистентные только к аминогликозидам III поколения выявлялись в 1,6%. По литературным данным - до 11,1% [23].
Возбудители ИМП, устойчивые одновременно к гентамицину, тобрамицину и нетилмицину составили 30%. По литературным данным - 24,1% - 44,1% [23].
Уропатогены, резистентные к гентамицину и тобрамицину выделялись в 36,5%о. По литературным данным этот уровень составляет 20,4% - 42,4%) [23].
Микрофлора, резистентная к гентамицину, выявлена в 3 8% случаев. По данным различных авторов уровень резистентности грам (-) бактерий к гентамицину колеблется от 36,1% у Е.со/і до 91,8% у P.aeruginosa, составляя в среднем 44,7% [9]. Учитывая тот факт, что на сегодняшний день аминогликози-ды I поколения ввиду их высокой токсичности не применяются для терапии ИМП, в исследование они не включались.
Анализ эффективности нетилмицина при лечении инфекций мочевыводящих путей в урологическом стационаре
Если дооперационная госпитализация составляла не более 1-2 суток и пациенту не проводились инвазивные урологические обследования и манипуляции, то при планировании превентивной антибиотикотерапии целесообразно ориентироваться на уровень резистентности к нетилмицину, выявляемый у возбудителей ИМП амбулаторных пациентов.
В нашем исследовании более чем в 94% случаев возбудителем ИМП в амбулаторных условиях являлась E.coli. Анализ резистентности данного уропатогена к нетилмицину, а так же величина Стах нетилмицина в ткани предстательной железы при ОРД, полученная в нашем исследовании, позволяет сделать вывод о допустимости использования нетилмицина у подобной группы пациентов для превентивной антибиотикотерапии перед операциями на предстательной железе.
В дальнейшем был проведен анализ бактериологической эффективности нетилмицина. В нашем исследовании E.coli, P.mirabilis P.aeruginosa, К.pneumoniae в совокупности составили более 80%. Удельный вес P.aeruginosa составил 18%. E.coli и P.mirabilis в проведенном нами исследовании высевались чаще других, и их удельный вес составил 25% соответственно. К.pneumoniae выделяется в — 12%.
Среди возбудителей ИМП так же встречались такие микроорганизмы, как: E.faecalis (8%), S.aureus (5%), Providencia spp. (5%), A.baumanii (2%).
Резистентность среди энтеробактерий распределилась в следующем порядке: К.pneumoniae- 66%; P. mirabilis — 63%; E.coli — 11%. Среди неферментирующих бактерий: P.aeruginosa - 50%; у A.baumanii 2 из 2 выделенных штаммов были резистентны к нетилмицину.
Резистентность среди кокков так же была значительной. У S.aureus - 2 штамма из 4, а у E.faecalis — все 7 выделенных штаммов были резистентны к нетилмицину. В целом, исследованные уропатогены по резистентности к нетилмицину расположились в следующем порядке: A.faecalis = A.baumanii = Providencia spp. К.pneumoniae P.mirabilis S.aureus = P.aeruginosa E.coli.
Принимая во внимание достаточно высокий уровень резистентности уропатогенов к аминогликозидам, было предпринято изучение механизмов резистентности. В исследование включено 63 штамма аэробных грам (-) бактерий, полученных у пациентов урологического стационара СОКБ. Для исследования механизмов резистентности отбирались штаммы, устойчивые к одному и/или более аминогликозидному антибиотику при рутинном определении чувствительности в лаборатории.
Механизмы устойчивости определялись фенотипическим методом. Было обнаружено, что преобладающим механизмом устойчивости грам (-) бактерий является ферментативная модификация.
В результате исследования показано, что наиболее распространёнными ферментами являлись AAC(3)V и АРН(3 )1, которые были выделены у 27% и 21% штаммов соответственно. Далее по частоте выделяемости следовали такие ферменты, как: ANT(2") — 6%; APH(3 )VI - 6%; AAC(6 )I - 3%; AAC(3)IV - 1,5%; AAC(2 )I -1,5%.
При изучении субстратной специфичности выявлены следующие фенотипы резистентности: резистентность к гентамицину фиксировалась у 38% протестированных штаммов; гентамицину и тобрамицину - у 36,5%; резистентность к гентамицину, тобрами-цину, нетилмицину - у 30%; к гентамицину, тобрамицину, нетил-мицину, амикацину и изепамицину - у 8% штаммов. Резистентность только к представителям III поколения аминогликозидов регистрировалась в 1,6%. Уровень перекрёстной резистентности уропатогенов к нетилмицину и гентамицину составил 79%.
Таким образом, учитывая данные о распространённости ами-ногликозидмодифицирующих ферментов и их субстратный профиль, применение нетилмицина для терапии ИМП в урологическом стационаре возможно после бактериологического обследования.
На следующем этапе исследования оценивалась эффективность нетилмицина при лечении различных форм ИМП у пациентов урологического стационара.
Всем пациентам, включённым в исследование, нетилмицин назначался в дозировке 7,5 мг/кг в сутки внутримышечно или внутривенно в виде монотерапии на протяжении 7-10 дней. До начала лечения и после его окончания состояние пациентов оценивалось на основе базовой симптоматики. Рассматривались такие симптомы как: лихорадка, озноб, боль в пояснице, боль в животе, тошнота/рвота, слабость, потеря веса, дизурия.
Выявлено, что на фоне терапии нетилмицином произошло достоверное уменьшение выраженности симптомов: лихорадки (р 0,0001); озноба (р 0,0001); боли в пояснице (р 0,0001); боли в животе (р 0,0001); тошноты (р 0,0001); слабости (р=0,0259); дизурии (р=0,0138). Уменьшение количества лейкоцитов крови так же было статистически достоверным и составило 20% (р=0,0138).
По окончании терапии нетилмицином клиническая эффективность была подтверждена у 73% пациентов. Бактериологически у них отмечалась эрадикация первично выявленных уропатогенов. У 15% пациентов бактериологически отмечалась эрадикация первично выявленного уропатогена с последующей суперинфекцией. У 12% пациентов клинически нетилмицин был неэффективен, и бактериологически отмечалась персистенция первично выявленного возбудителя.
