Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы И
1.1. Аналитические методы определения фармакологически активных пептидов в биологическом материале 11
1.1.1. Хроматографические методы анализа пептидных соединений 12
1.1.1.1. Обращенно-фазный вариант метода ВЭЖХ в пептидном анализе 12
1.1.1.2. Эксклюзионная хроматография в пептидном анализе 19
1.1.2. Электрофоретические методы анализа пептидов 20
1.1.3. Методы хромато-масс-спектрометрии в пептидном анализе 22
1.2.2.5.2. Метаболические барьеры желудочно-кишечного тракта 52
2. Материалы и методы исследования 54
3. Результаты исследования 77
3.1. УФ-спектроскопия 77
3.2. Изучение биотрансформации и фармакокинетики ноопепта nи его основных метаболитов 79
3.2.1. Предполагаемый метаболизм ноопепта 79
3.2.2. Изучение экскреции ноопепта и его основных метаболитов с мочой у крыс 81
3.2.3. Фармакокинетика ноопепта и его метаболитов в плазме крови крыс после внутривенного введения ноопепта 82
3.2.4.Фармакокинетика ноопепта у крыс после орального введения субстанции ноопепта 89
Заключение
Выводы 117
Список литературы 118
- Хроматографические методы анализа пептидных соединений
- Методы хромато-масс-спектрометрии в пептидном анализе
- Изучение биотрансформации и фармакокинетики ноопепта nи его основных метаболитов
- Фармакокинетика ноопепта и его метаболитов в плазме крови крыс после внутривенного введения ноопепта
Введение к работе
Актуальность проблемы. Разнообразие и часто уникальность фармакологических эффектов эндогенных пептидов и их синтетических аналогов в сочетании с высокой активностью делают эти соединения перспективными в качестве потенциальных фармакологических средств (Ашмарин И.П., 1996; Мясоедов Н.Ф., 2001; Каменский А.А., 1999; Чипенс Г.И., 1988; Dutta A.S., 1993). Современные достижения в создании лекарственных форм пептидов, позволившие в значительной степени преодолеть такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и низкую проницаемость через различные барьеры организма, в соединении с улучшенными методами производства способствуют быстрому росту количества пептидных препаратов (Verlander М., 2001). Лекарственные средства пептидной природы интересны в качестве потенциальных ноотропов, поскольку в регуляции когнитивных функций основную роль играют нейропептиды.
В связи с большим количеством заболеваний, сопровождающихся нарушениями когнитивных функций таких как травма мозга, инсульты, хроническая церебро-васкулярная недостаточность и т.п., представляется необходимым разработка и внедрение в клиническую практику новых ноотропных препаратов пептидной структуры, поскольку в большинстве случаев пептидные препараты более эффективны, чем препараты из других химических групп (Loffet А., 2001). Несмотря на значительный прогресс в создании лекарственных форм пептидных соединений, поиск пептидов, сохраняющих активность после приема внутрь, остается актуальным, поскольку именно этот путь введения предпочтителен при коррекции многих когнитивных нарушений, требующих проведения длительной терапии.
В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН в результате
целенаправленного создания лекарственных сре^с**<ЦШяециввК«Й>Н}МИ|оДЫ на
ЇКА і
С Петербург.,/ I
2 основе структуры известных непептидных препаратов (Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А., Середенин СБ. (1985-2001)) был создан оригинальный дипептид - ноопепт, который имеет ноотропную активность, качественно и количественно превышающую активность классического ноотропа пирацетама, и при этом сохраняющий активность после приема внутрь (патент РФ № 2119496, US Patent № 5439930). К настоящему моменту, ноопепт прошел вторую фазу клинических испытаний на 60-болышх в двух клиниках, подтвердивших высокую эффективность и безопасность препарата.
Общеизвестно, что экспериментальное изучение фармакокинетики позволяет выявить закономерности концентрационных изменений лекарственного вещества в организме. Знание этих закономерностей способствует пониманию процессов всасывания, распределения и элиминации лекарственных средств, выяснению фармакокинетической составляющей биологической активности, идентификации и оценки основных метаболитов, выбору оптимальной лекарственной формы и пути введения (Фирсов А.А. 2000; Жердев В.П., 1991). В конечном счете, изучение экспериментальной фармакокинетики направлено на решение главной задачи доклинических испытаний, заключающейся в обеспечении безопасного и эффективного использования лекарственных препаратов в клинике (Горьков В.А., 1987).
Актуальность исследования определяется тем, что доклиническое изучение фармакокинетики и путей биотрансформации ноопепта является необходимым этапом на пути внедрения этого оригинального препарата в клиническую практику.
Целью настоящего исследования являлось изучение фармакокинетики и биотрансформации ноопепта в эксперименте на двух видах животных.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать методики качественного и количественного анализа ноопепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале.
-
Изучить фармакокинетику ноопепта после внутривенного и орального фзедчнияуярыс Я %*ЯЩКОВ.
. ,
-
Установить пути биотрансформации ноопепта после его внутривенного введения у крыс.
-
Оценить способность ноопепта проникать через гематоэнцефалический барьер.
-
Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы ноопепта ' у кроликов.
Научная новизна. Впервые проведено изучение фармакокинетики и
биотрансформации ноопепта у крыс и кроликов при разных путях введения
субстанции и после введения таблеток ноопепта у кроликов. Показано, что при
внутривенном пути введения неизмененный ноопепт регистрируется в плазме
крови крыс в течение 25 мин, и за это время происходит его биотрансформация
с образованием трех метаболитов - N-фенилацетилпролина, фенилуксусной
кислоты и циклопролилглицина. Выявлено, что процесс элиминации ноопепта
у кроликов протекает менее интенсивно, что обуславливает его более
длительную циркуляцию в плазме крови у этого вида животных. Показано, что
ноопепт способен проникать через гематоэнцефалический барьер, и его
концентрация в мозге выше, чем в плазме крови. Кроме ноопепта в мозге были
обнаружены два его метаболита - фенилуксусная кислота и
циклопролилглицин, идентичные соответствующим эндогенным соединениям. Идентификация циклопролилглицина в качестве эндогенного соединения проведена впервые. Показано на двух видах животных, что оральное введение ноопепта характеризуется выраженным "эффектом первого прохождения" через желудочно-кишечный тракт и печень. Впервые проведена оценка относительной биологической доступности таблеток ноопепта по 10 мг у кроликов.
Научно-практическое значение. Данные исследования вошли в Материалы по доклиническому изучению ГВС-111 (ноопепт), представленные в Фармакологический Комитет Минздрава РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток ноопепта.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Российском национальном конгрессе "Человек и Лекарство" (Москва 2000 г), на 3-й Международной Конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Суздаль 2001 г) и на межлабораторной конференции лабораторий фармакокинетики и гетероатомных структур ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва 2002 г).
Связь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ ГУ НИИ фармакологии РАМН. Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР НИИ фармакологии РАМН "Изучение молекулярных и клеточных механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС, создание нейрохимических основ для разработки новых оригинальных нейротропных средств" и с подпрограммой "Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза" ФЦНТП "Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники".
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 136 страницах и иллюстрированы 20 таблицами и 14 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследования, заключения и выводов. Библиография представлена 23 отечественными и 132 зарубежными работами.
Публикации. Основные положения диссертационной работы нашли отражение в восьми опубликованных в печати научных работах.
Хроматографические методы анализа пептидных соединений
Необходимым условием для проведения анализа пептидов в биологическом материале является возможность эффективного отделения анализируемого пептида от сопутствующих эндогенных соединений. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) характеризуется высокой селективностью и высокой разрешающей способностью и может использоваться для разделения пептидов, в том числе и пептидов с близкой структурой. В качестве примера можно привести типичное хроматографическое разделение с одновременной идентификацией 17 тестируемых пептидов, включающих синтетические энкефалины, динорфины и Р-эндорфины, выполненное Partilla J.S. с коллегами [11]. Этот анализ проводили методом ВЭЖХ в режиме линейного градиента с использованием водного раствора ацетонитрила в концентрациях от 22.5 до 56.2 % в присутствии 0.1 % раствора трифторуксусной кислоты с детекцией при 215 нм.
Различия пептидов по молекулярной массе и полярности определяют использование в подавляющем числе биофармацевтических и фармакокинетических исследований метода ВЭЖХ в обращенно-фазном и экслюзионном вариантах.
Пептиды, как правило, наряду с гидрофильными содержат гидрофобные остатки аминокислот. Поэтому для их разделения возможно использование распределительной хроматографии. Метод ВЭЖХ в обращенно-фазном варианте (ОФ-ВЭЖХ) является частным случаем такой хроматографии. Этот вариант ВЭЖХ предполагает использование гидрофобной неподвижной фазы, состоящей из мелкодисперсных (3-10 мкм) сорбентов, обычно представляющих собой пористые кремнеземы, модифицированные силанами с 1-22 атомами углерода, и полярной подвижной фазы, поток которой, проходит по хроматографической системе при повышенном давлении.
Следует отметить, что разделение пептидов возможно провести и с использованием ВЭЖХ в нормально-фазном варианте [12, 13]. Однако удельный вес метода ВЭЖХ в нормально-фазном варианте в анализе пептидов в биологическом материале незначителен.
Начиная с 70 г г метод ОФ-ВЭЖХ нашел широкое применение в области анализа пептидов в биологическом материале. С применением этого метода проводились классические работы по изучению структуры и метаболизма большого числа биологически активных пептидов [12].
В современном анализе ОФ-ВЭЖХ вытесняется более информативными методами при проведении идентификации пептидов, однако до настоящего времени это предпочтительный метод разделения пептидных смесей и выделения индивидуальных пептидов [9, 14,15].
Наибольшее использование в разделении пептидов получили аналитические колонки с октил- и октадецилсилановыми сорбентами, имеющими средний эффективный диаметр пор от 50 до 100 А. Эффективность таких колонок при анализе белков и пептидов составляет 2000-20000 N/m [16].
Режимы и условия проведения хроматографического процесса влияют как на селективность, так и на эффективность разделения в ВЭЖХ. Правильно подобранная подвижная фаза должна соответствовать следующим условиям: применяющиеся растворители и модификаторы должны быть прозрачны в ультрафиолетовой области (УФ-области) поглощения; значение рН системы растворителей должно быть оптимально для разделения пептидов; компоненты подвижной фазы должны уменьшать полярность пептидов, подавлять взаимодействия между силанольными группами и свободными ионными группами анализируемых пептидов. В этой области анализа наибольшее распространение нашли подвижные фазы, в состав которых в качестве растворителя входит водный раствор ацетонитрила [17], и для подавления ионизации силанольных групп - трифторуксусная, фосфорная и уксусная кислоты, а также триэтиламмония фосфат [18, 19]. Добавление этих реагентов в систему растворителей приводит к улучшению профиля хроматографических пиков пептидов имеющих свободные ионные группы [18].
Значительное влияние на хроматографическое поведение пептидов оказывает величина и постоянство рН элюента. Если молярность буферной системы может повлиять только на такой параметр хроматографии, как дисперсия [17], то даже незначительное варьирование рН раствора может приводить к изменению характера хроматографического процесса в целом [17]. Необходимым условием проведения хроматографии является величина рН элюента менее 8, поскольку при высоких значениях рН в колонке образуются пустоты в результате растворения кремнезема [18]. Неоднократно сообщалось [12, 17, 19], что оптимальное разделение пептидов достигается при значениях рН элюента в интервале 2.5-3.5. Проведение анализа в этом интервала рН необходимо для уменьшения полярности пептидов содержащих свободные карбоксильные группы и реализации гидрофобного взаимодействия "сорбент-сорбат".
Таким образом, путем изменения хроматографического процесса возможно подобрать соответствующие параметры разделения и времена удержания. Последнее представляется важным в условиях анализа пептидов проводимого в биологическом материале, требующего разделения в образце многих компонентов, близких по хроматографическому поведению. В практике хроматографии пептидов для решения этой задачи зачастую используют и градиентное элюирование с изменением состава и /или природы неподвижной фазы [19]. Для достижения максимальной информативности и чувствительности метода необходим адекватный выбор детектора на основе структуры изучаемого соединения.
Основной хромофор в структуре пептидов - пептидная связь, имеющая в ультрафиолетовой области плечо полосы поглощения 187-230 нм [12]. Однако детекция на максимуме этого плеча при длине волны 187 нм неосуществима вследствие поглощения в этой области многих эндогенных компонентов, растворителей и буферных систем. Обычно анализ проводится при длине волн 210, 214, 220 нм, а при наличии в структуре анализируемого пептида триптофана или тирозина - по полосам поглощения этих аминокислот в области 280 нм. Было отмечено [20], что при прочих идентичных условиях хроматографического процесса изменение длины волны на 10 нм приводит к четырехкратному падению чувствительности.
При наличии в пептиде флуорогенных групп использование в анализе пептидов спектрофлуоресцентной детекции (СФ-детекция) предпочтительнее ультрафиолетовой (УФ-детекция) в силу большей информативности, чувствительности и возможности использования некоторых эффективных буферных систем, недоступных при анализе с другими типами детектирования.
Методы хромато-масс-спектрометрии в пептидном анализе
Значительно увеличить информативность исследований пептидных соединений в биологическом материале удалось благодаря использованию масс-спектрометрии. С конца 60 гт масс-спектрометрию начали применять для анализа аминокислотной последовательности пептидов [16]. Несмотря на многие ограничения, характерные для масс-спектрометрии того времени, была показана возможность использования данного метода в анализе пептидов и белков. Потенциал масс-спектрометрии был реализован в дальнейшем, после создания комбинированных методов, сочетающих информативность масс-спектрометрии (МС) с высокой разрешающей способностью хроматографических и электрофоретических методов. Например, сочетание МС с газовой хроматографией позволяет провести анализ 300 компонентов смеси с минимальным определяемым количеством — 10 -,2 г [41].
Современный арсенал вариантов хромато-масс-спектрометрии, используемых в анализе пептидов, включает: комбинацию газовой хроматографии с масс-спектрометрией (ГХ-МС) химической ионизацией отрицательными ионами, МС с ионизацией электронным ударом; комбинацию ВЭЖХ с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) с ионизацией электрораспылением, ионизацией термораспылением и химической ионизацией при атмосферном давлении.
Метод газовой хроматографии, применявшийся на раннем этапе в пептидном анализе, не мог найти широкого применения из-за трудностей, возникающих при химической модификации пептидов для превращения их в летучие производные. Вместе с тем в 1970 гг Caprioli [42] был предложен приемлемый для анализа пептидов вариант газовой хроматографии, сочетавшийся с МС. В этом методе непосредственно перед анализом исследуемые полипептиды ферментативно гидролизовали до дипептидов дипептидиламинопептидазой с дальнейшей модификацией этих дипептидов ангидридом пентафторпропионовой кислоты. Существенным недостатком метода являлось необходимость использования большого объема анализируемых проб. При разработке методики определения фактора высвобождающего гормон роста в плазме Liberato [43] использовал метод ГХ-МС с химической ионизацией отрицательными ионами (NICI) после ферментного гидролиза и проведения реакций дериватизации с пентафторбензилбромидом и гептафторомасляным ангидридом. Однако анализ сопровождался высоким фоном, видимо, явившимся результатом полного гидролиза коэкстрагируемых эндогенных пептидов. Для ослабления влияния на анализ продуктов деградации сопутствующих пептидов и белков Cobb и Novotny [44] было предложено применение иммобилизированных ферментов, в частности, трипсина. Этот метод позволяет определить минимальное количество исследуемых пептидов (на уровне единиц пмоль). Также с применением ГХ-МС с иммобилизированными трипсином и химотрипсином, Marquez [45] выполнено изучение фармакокинетики производного метэнкефалина и синтетического пептида DSLET (Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leuhr) в плазме крови крыс. После твердофазной экстракции данных пептидов из плазмы и очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ был проведен селективный ферментный гидролиз определяемых пептидов до соответствующих ди-, трипептидных фрагментов. Следующий этап анализа заключался в химической модификации пептидных фрагментов и их количественного определения ГХ-МС с химической ионизацией.
Метод ВЭЖХ-МС сопряжен с трудностями переноса пептидов из раствора элюента в летучее ионизированное состояние из-за их термолабильности при температуре испарения в вакууме.
Инструментальное решение данной проблемы было осуществлено только в начале 1980 гт, с появлением МС с ионизацией путем бомбардировки быстрыми атомами. Вместе с тем, при анализе пептидных смесей этим вариантом МС возможны существенные ошибки, связанные с различиями в ионизации гидрофобных и гидрофильных пептидов [16]. К настоящему времени данный метод вытеснен МС с электрораспылительной ионизацией [46], вошедшей в практику биоаналитических исследований с 1990 гт. В этом методе поток сольвента с анализируемыми пептидами электрораспыляется на верхушке капилляра, имеющего высокое напряжение. Это приводит к частичному испарению раствора и движению заряженных капель к металлической пластине с более низким потенциалом. Присутствие потока сухого инертного газа и нагревания приводит, в конечном счете, к полному переходу анализируемых ионов в газовую фазу без деструкции. Интегрирование ВЭЖХ с этим вариантом МС позволило определять следовые количества пептидных препаратов в таком биологическом материале, как плазма, сыворотка и моча [47]. Такие недостатки метода, как возможность использования только ограниченного числа подвижных фаз и невысокая чувствительность, сопоставимая с чувствительностью ультрафиолетовой детекции устраняются внедрением хроматографических систем с низкой скоростью элюента. Недостатки данного метода компенсируются его информативностью и однозначностью в интерпретации результатов анализа.
Метод ВЭЖХ-МС с электрораспылительной ионизацией применяли [47] для определения анксиолитического пептидного препарата IRI-514(Ac-Arg 25 Pro-Asp-Pro-Phe-NH2) в плазме крови кроликов и человека. Минимальная концентрация определяемая в плазме составила 10 нг/мл у кроликов и 2 нг/мл у добровольцев. Использование в этом методе микроколоночного варианта ВЭЖХ является одним из возможных способов оптимизации анализа, направленного на увеличение чувствительности. Так, сообщалось [48] о применении микроколоночной ВЭЖХ — тандемной МС с электрораспылительной ионизацией в изучении стабильности опиоидного декапептида LW-геморфина-7 в плазме человека. Возможность проведения анализа с медленной скоростью потока элюента (нл/мин) обеспечило высокую чувствительность метода на уровне амоль/мкл.
Изучение биотрансформации и фармакокинетики ноопепта nи его основных метаболитов
Необходимость изучения биотрансформации ноопепта продиктована возможностью образования в результате этого процесса метаболитов, имеющих биологическую активность. Ноопепт является дипептидом, защищенным с С-конца эфирной группой, а с N-конца фенилацильной группой. Такая модификация предполагает устойчивость к воздействию карбоксипептидаз (атакуют С-конец пептидной цепи) и аминопептидаз (атакуют N-конец пептидной цепи), в том числе и к протеолитической системе, локализованной в эритроцитах [141]. Представляется затруднительной оценка всего спектра метаболизма ноопепта, включающая детекцию небольших фрагментов и промежуточных продуктов, в силу ограниченных возможностей инструментальных методов.
Вместе с тем в рамках решаемой задачи представлялось необходимым количественная оценка основных метаболитов ноопепта, которые могут вносить существенный вклад в реализацию фармакологического эффекта данного фармакологического средства и/ или обладать собственной биологической активностью. Установление структуры метаболитов хроматографическим методом предполагает наличие стандартов-свидетелей, времена удержания которых сопоставляют со временами удержания пиков веществ в хроматограммах опытных образцов. С целью синтеза стандартов-свидетелей основных метаболитов ноопепта предварительно была предложена схема трех наиболее вероятных путей биотрансформации ноопепта, включающая: 1) образование К-фенилацетил-Ь-пролилглицина (М-1) в результате гидролиза сложноэфирной связи эстеразами и дальнейшей деградации этого продукта до L-пролилглицина (М-4); 2) пептидазы могут атаковать пептидную связь с образованием N-фенилацетил-Ь-пролина (М-2) и этилового эфира глицина (М-5); 3) дезацилирование ноопепта может привести к фенилуксусной кислоте (М-3) и этиловому эфиру L-пролилглицина, который может спонтанно превращаться в циклический дипептид - циклопролилглицин (М-6). Предполагаемая схема биотрансформации ноопепта, представленная на рис. 5, включает продукты первой фазы биотрансформации, образование которых возможно в результате действия гидролаз.
Для изучения возможного вклада в элиминацию ноопепта процесса экскреции, а также идентификации выводимых с мочой метаболитов был проведен хроматографический анализ образцов мочи. На хроматограммах опытных образцов не было выявлено пиков соответствовавших по времени удержания стандарту-свидетелю ноопепта. Вместе с тем, на хроматограммах и контрольных и опытных образцов мочи присутствовал пик, имевший время удержания 8 мин, который соответствовал синтетическому стандарту-свидетелю - фенилуксусной кислоте. Однако, в отличие от контрольных образцов, площадь пика в опытных образцах мочи была больше примерно в 2 раза. Содержание фенилуксусной кислоты в моче контрольных животных составило 2.44±0.52 мкг/мл суточной мочи крыс, после введения препарата ее содержание увеличивалось до 5.00Ю.85 мкг/мл суточной мочи. Таким образом, отсутствие неизмененного ноопепта в моче позволяет утверждать, что ноопепт подвергается интенсивной биотрансформации. На хроматограммах опытных образцов плазмы крови крыс, полученных в разных условиях п. 2.2.4., кроме хроматографического пика, соответствовавшего ноопепту, дополнительно наблюдались три пика, которые изменялись во времени и совпадали по временам удержания с синтетическими стандартами-свидетелями метаболитов М-2 (N фенилацетил-Ь-пролин), М-3 (фенилуксусная кислота) и М-6 (циклопролилглицин). Усредненные концентрационные кривые ноопепта и его идентифицированных метаболитов в плазме крови крыс после внутривенного введения в дозе 5 мг/кг представлены на рис. 6. Как видно из рисунка, при этом способе введения отмечается быстрое снижение концентрации ноопепта в плазме крови крыс, причем соответствующая концентрационная кривая имеет однофазный характер. Отсутствие на этой кривой фазы, отражающей участок распределения, может свидетельствовать о том, что, во-первых, процесс элиминации ноопепта начинается непосредственно после его введения, во-вторых, что количество ноопепта, "покинувшего" системный кровоток в результате элиминации, превышает снижение его концентрации в плазме крови из-за распределения по тканям. Это возможно в случае интенсивного метаболизма ноопепта в плазме крови. Данное утверждение не исключает вероятности выраженного проникновения ноопепта в ткани и протекания и в них элиминации данного лекарственного средства.
Через 5 минут после введения концентрация ноопепта составляет 0.92 мкг/мл, а уже на 10 минуте снижается примерно в 1.2 раза. Всего за интервал от 5 до 25 мин происходит 10-кратное снижение концентрации ноопепта, уровень которого через 25 мин после введения находится на границе предела обнаружения метода.
Быстрое снижение концентрации ноопепта сопровождается постепенным возрастанием в плазме крови уровня метаболитов, кривые которых значительно отличаются от фармакокинетической кривой исходного соединения, за счет более продолжительного снижения их концентраций, осуществляемого на протяжении от 4 до 6 ч. В случае метаболитов М-2 и М-3 максимальная концентрация, детектируемая соответственно через 30 мин и 1 ч, значительно превышает уровень ноопепта и составляет для М-2 — 3.9 мкг/мл и для М-3 — 1.9 мкг/мл. В последующие интервалы времени наблюдения уровень этих метаболитов снижается в плазме крови на протяжении 6 (М-2) и 4 часов (М-3). На более низком концентрационном уровне проходит в плазме крови крыс кривая метаболита М-6. Этот метаболит регистрируется на протяжении 4 ч после введения ноопепта. Время достижения максимальной концентрации М-6 (0.8 мкг/мл) составляет 30 мин.
Анализ данных таблицы показывает, что фармакокинетический профиль ноопепта характеризуется небольшими значениями величин параметров Ti# и MRT. Так, величина Т\а, составляющая для ноопепта 0.19 ч, означает, что в течение этого времени в плазме крови происходит снижение его концентрации вдвое. Поскольку этот параметр отражает геометрические характеристики фармакокинетической кривой, профиль которой зависит от элиминации и перераспределения лекарственного средства во всем организме, величина Tj/2 определяется не только клиренсом, но также и кажущимся объемом распределения (Vd).
Фармакокинетика ноопепта и его метаболитов в плазме крови крыс после внутривенного введения ноопепта
Значительные концентрационные потери ноопепта после орального введения являются результатом "эффекта первого прохождения", то есть пресистемной элиминации. Значение абсолютной биодоступности для ноопепта с учетом разницы в дозах составило 7.1 %. Из этого следует, что после орального введения раствора ноопепта более 90 % от его введенной дозы не достигает системного кровотока. Под пресистемной элиминацией подразумевают совокупность факторов, влияющих на полноту всасывания fa лекарственного средства из ЖКТ, и элиминацию, протекающую в ЖКТ (F и/ или в печени (FH). Взаимосвязь абсолютной биодоступности с факторами, составляющими понятие пресистемной элиминации, может быть представлена в виде: Fabs = fa Fi FH [144]. Для того чтобы понять, какой из вышеперечисленных факторов является ведущим в "эффекте первого прохождения" ноопепта, необходимо рассчитать максимально возможную биодоступность ( F) и оценить его степень всасывания. Отметим, что введение лекарственного вещества в растворе подразумевает под собой полное всасывание из ЖКТ [140], а, следовательно, для ноопепта вводимого орально в виде водного раствора fa можно принять за 1. Принимая во внимание скорость кровотока (QH) через печень крыс, равную 0.88 л/ч (14.7 мл/мин) [145], и полученное для орального введения значение клиренса С1(р0.), можно рассчитать максимально возможную биодоступность ноопепта по формуле: QH/QH+C1P(P,0.). Значение F составило для ноопепта 18 %, и, в случае отсутствия кишечной элиминации и при условии полного всасывания препарата, эта величина должна соответствовать величине FabS. Однако величина F, в 2.5 раза больше величины FabS, из чего следует, что причиной низкой биодоступности ноопепта, в первую очередь, является биотрансформация, протекающая в кишечнике.
Из сравнения величин С1р, рассчитанных после внутривенного и орального введений видно, что они фактически совпадают. Соответственность величин С1р свидетельствует о сопоставимой скорости системной элиминации ноопепта между этими путями введения. В случае орального введения величина Ті/2 несколько отличается от величины аналогичного параметра, полученного после внутривенного введения, и составляет 0.12 ч. Это, вероятно, связано с различием в значениях объема распределения. В случае орального введения величина Vd составляет 0.69 л, что несколько меньше величины этого параметра, полученного в условиях внутривенного введения.
Следует отметить, что при внутривенном и оральном способах введения наблюдались качественные отличия в путях биотрансформации. В случае орального введения регистрировался метаболит, который отличался по своей структуре от метаболитов, идентифицированных ранее после внутривенного введения. Исходя из химической структуры ноопепта можно предположить, что этот метаболит является продуктом биотрансформации гидроксилированным по фенильному кольцу.
Предполагается, что ноотропный эффект ноопепта может быть достигнут при условии его проникновения и распределения в мозге. Причем характер и длительность этого эффекта может в значительной степени зависеть и от скорости и степени проникновения ноопепта через гематоэнцефалический барьер, и от времени его нахождения в мозге. Для оценки способности ноопепта к проникновению через гематоэнцефалический барьер, расчета его тканевой доступности и характеристики распределения было проведено количественное определение данного лекарственного средства в мозге. Кроме того, представлялось важным проведение таких исследований и для активных метаболитов ноопепта, поскольку они могут вносить свой вклад в реализацию фармакологического эффекта исходного соединения.
При сравнении величин Тт и MRT (табл. 16), рассчитанных для фенилуксусной кислоты в плазме крови с соответствующими параметрами в мозге, обнаружено, что в мозге длительность циркуляции фенилуксусной кислоты менее продолжительна, чем в плазме крови. AUC фенилуксусной кислоты в плазме крови в 5 раз выше аналогичного параметра в мозге. Это подтверждается литературными данными о том, что для фенилуксусной кислоты существуют механизмы гибкой регуляции её содержания в мозге, реализуемые посредством транспорта из мозга и за счет образования конъюгатов [146].
Из рисунка видно, что концентрация циклопролилглицина в мозге быстро возрастает и достигает своего максимального значения спустя 60 мин после внутривенного введения ноопепта. Можно отметить, что, по сравнению с плазмой, концентрация циклопролилглицина в мозге достигает своего максимума через более продолжительное время, при этом её величина составляет 1.3 мкг/г, что примерно в 2 раза превышает величину Сщах ДЛЯ этого метаболита в плазме крови. Превышение концентрационного уровня регистрируемого в мозге, по сравнению с уровнем в плазме крови отмечается во все соответствующие временные интервалы. Сопоставление фармакокинетических параметров, полученных для циклопролилглицина в плазме крови и в мозге показывает, что в последнем случае значения каждого из параметров AUC, Tj/2 и MRT значительно превышает значения аналогичных параметров в плазме крови. Это свидетельствует, во-первых, о более длительном нахождении циклопролилглицина в мозге по сравнению с плазмой крови, во-вторых, о значительном накоплении этого метаболита в мозге после внутривенного введения ноопепта.
Таким образом, ноопепт и два его метаболита — фенилуксусная кислота и циклопролилглицин способны проникать через гематоэнцефалический барьер. Причем для ноопепта и циклопролилглицина характерно не только быстрое распределение из плазмы крови в мозг, но и более длительная циркуляция в этом органе. Интенсивность захвата ноопепта и циклогпролилглицина структурами мозга и способность к их накоплению свидетельствует о выраженной тропности этих соединений к тканям мозга.
![Изучение Р2-рецепторов в матке беременных женщин [Электронный ресурс]](/i/i/4397/186601.png "Изучение Р2-рецепторов в матке беременных женщин [Электронный ресурс] Зайцев Александр Петрович")
