Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
1.1. Данные о действии протеолитических ферментов в эксперименте ...... 12
1.2. Энзимотерашш - патогенетически и физиологически обоснованный метод
лечения гнойно-некротических процессов 27
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 35
3. ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АСПЕРАЗЫ
3.1. Влияние асперазы на лизис ожогового струпа и гнойно-фибринозных отложе- ний ожоговых ран 44
3.2. Влияние асперазы на лизис гнойно-воспалительного секрета гайморовой
полости 49
3.3. Влияние асперазы на лизис тромбови сгустков крови .52
3.4. Влияние асперазы на протеолитическую активность крови, мочи, желчи
и ряда органов 54
3.5. Влияние асперазы на антипротеазную активность крови 58
3.6. Обсуждение результатов , 62
4. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛШОГО ДЕЙСТВИЯ АСПЕРАЗЫ 68
4.1. Влияние асперазы на экссудативную фазу воспаления 68
4.2. Влияние асперазы на пролиферативную фазу воспаления 74
4.3. Изучение роли ферментативной активности асперазы в механизме противовоспалительного действия 75
4.4. Изучение роли комплекса асперазы с сывороткой крови в механизме противовоспалительного действия ... 76
4.5. Обсуждение результатов 78
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АСПЕРАЗЫ НА НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ФИЕРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, СВЕРТЫВАЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КРОВИ И АРТЕРИАЛЬНОЕ ДАВ ЛЕНИЕ 83
5.1. Фябринолитическое действие асперазы in vitro и in vivo 83
5.2. Влияние асперазы на некоторые показатели свертывающей системы крови 86
5.3. Влияние асперазы на уровень системного артериального давления .... 89
5.4. К механизму гипотензивного действия асперазы ..... 91
5.5. Обсуждение результатов ...... 96
ИЗУЧЕНИЕ АСПЕРАЗЫ В ЛЕКАРСТВЕННОЙ Ф0ШЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ 100
6.1. Влияние мази асперазы на состояние ожоговых ран 100
6.2. Изучение протеолитической и анти-протеазной активности крови в процессе лечения мазью асперазы . . . 117
6.3. Изучение белкового спектра сыворотки крови в процессе лечения мазью асперазы окоговых ран 122
6.4. Влияние мази асперазы на состояние гнойно-некротических тканей конш и подкожной клетчатки ... 125
6.5. Изучение фибринолитического действия мази асперазы 126
6.6. Влияние мази асперазы на процесс регенерации заживающей раны ..... 128
6.7. Изучение резорбции мази асперазы на
модели трафаретных ран . 129
6.8. Обсуждение результатов 132
7. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ АСПЕРАЗЫ 135
7.1. Изучение острой токсичности асперазы 135
7.2. Изучение острой токсичности мази асперазы 139
7.3. Изучение некоторых показателей хронической токсичности мази асперазы 140
7.4. Обсуждение результатов 156
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 158
ВЫВОДЫ 169
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..... 171
ЛИТЕРАТУРА 172
ПРИЛОЖЕНИЕ 200
- Данные о действии протеолитических ферментов в эксперименте
- Влияние асперазы на лизис ожогового струпа и гнойно-фибринозных отложе- ний ожоговых ран
- Влияние асперазы на экссудативную фазу воспаления
- Фябринолитическое действие асперазы in vitro и in vivo
- Влияние мази асперазы на состояние ожоговых ран
Данные о действии протеолитических ферментов в эксперименте
Основным действием протеолитических ферментов, обусловливающим их местное применение, является гидролитическое расщепление различных видов нежизнеспособных биосубстратов: ожоговый струп, гнойные экссудаты, сгустки крови, фибринозные образования, тромбы и другие. Указанные некротические ткани часто встречаются в хирургической, оториноларингологи-ческой практике, гинекологии. Они осложняют течение заболевания и удлиняют сроки его лечения. Денатурированные белки омертвевших масс, экссудаты, подобно нативным белковым субстратам, чувствительны к гидролизу протеазами.
В Советском Союзе для местного лечения гнойно-некротических процессов применяется 5 ферментных препаратов протео-литического действия: трипсин, химотрипсин, химопсин, колла-геназа (животного происхождения) и один препарат микробного происхождения - террилитин (разрешены к применению на I января 1982 г., Государственный реестр, 1982). Другие изучаемые протеолитические ферменты по ряду причин еще не выпускаются отечественной промышленностью. Однако в работе представлены экспериментальные и клинические результаты их исследования.
Первые работы по изучению влияния протеолитическях ферментов на некротические субстраты относятся к 40-ым годам нашего столетия. Вначале исследовался трипсин, а затем и другие протеази животного, растительного и бактериального происхождения.
Сравнительное изучение трипсина, панкреатина, коллагена-зы и эластазы показало, что все они обладают действием, лизирующим ожоговый струп, но наибольшую эффективность проявляет эластаза. Действие остальных ферментов примерно одинаковое (Т.Я.Заец, С.К.Завьялов, 1962; С.К.Завьялов, 1966). Увеличение лизиса ожогового струпа отмечено при совместном применении указанных ферментов с активаторами (солянокислый ци-стеин, салициловый натрий и другие), либо с мочевиной. Последняя дезагрегирует белок струпа путем разрыва его водородных связей, после чего эффект трипсина по отношению к белкам струпа возрастает (Т.Я.Заец, С.К.Завьялов, 1961).
А.А.Ммшенецкий и соавт. (1974) установили, что действием, расщепляющим некротический ожоговый струп, обладают про-теолитические ферменты бактериального происхождения: гигро-литин и террилитин. Последний вызывает также лизис некротической ткани легкого и не расщепляет здоровую ткань, что свидетельствует о преимущественном его действии на нежизнеспособную ткань как наиболее чувствительный белковый субстрат. Террилитин лизирует нежизнеспособную мышечную ткань, превышая эффект трипсина и химотрипсина (Г.Е.Гринберг и соавт., 1980). В основе механизма протеолитячеекого действия протеаз на нежизнеспособные биосубстраты лежит способность их катализировать гидролиз белков и пептидов (Г.Е.Гринберг и соавт., 1976).
Влияние асперазы на лизис ожогового струпа и гнойно-фибринозных отложе- ний ожоговых ран
Изучение влияния асперазы на лизис ожогового струпа и гнойно-фибринозных отложений проводили in vitro,используя принцип метода Т.Я.Заец, С.К.Завьялова (1961). Указанные субстраты извлекали с поверхности ожоговых ран крыс (ожоги ЗБ степени), высушивали до постоянной массы. Измельченные навески субстратов по 80 мг помещали в растворы ферментов различной концентрации, объемом 4 мл. В контрольных пробах субстраты вносили после добавления трихлоруксусной кислоты к растворам ферментов. Продукты гидролитической реакции (крупные пептиды и низкомолекулярные продукты гидролиза, не осаждаемые трихлоруксусной кислотой) определяли в трихлоруксусном фильтрате с раствором Фолина. Асперазу испытывали в концентрациях от 0,04 до 3 ПЕ/мл. Длительность действия (при температуре 37 С) фермента на субстрат составляла 0,5, 2, 5 и 24 часа. О лизирующем действии протеолитических ферментов судили по приросту тирозина в опытной пробе по сравнению с контрольной. Для расчета была применена следующая формула:
где А - количество мкмоль тирозина в реакционной среде;
а - объем реакционной среды в мл;
Е - оптическая плотность раствора; 1,51 - оптическая плотность I мкмоль тирозина.
Прирост продуктов гидролитической реакции выражали в мкмоль тирозина и в процентах по отношению к содержанию расщепленного (щелочью) белка в навеске, принятого за 100$. Навеску струпа и гнойно-фибринозных отложений растворяли (подогревая) в 2 мл I н. НаОн и количество расщепленного белка определяли при помощи раствора Фолина, используя в качестве стандарта тирозин.
В опытах с ожоговым струпом проведено сравнительное изучение асперазы с трипсином и террилитином в соответствующих концентрациях, выраженных в ПЕ/мл.
Как видно из представленных результатов на рис 3.1. и в таблице I "Приложение"аспераза при 30-минутном воздействии на субстрате оказывает выраженное лизирующее действие, зависящее от ее концентрации. Наименьшая концентрация, вызывающая максимальный прирост тирозина, составляет 1,6 ПЕ/мл. Дальнейшее увеличение концентрации до 3 ПЕ/мл не приводит к статистически значимому повышению прироста продуктов распада белка ожогового струпа. Следовательно, оптимальной явля47 ется концентрация 1,6 ПЕ/мл.
Приведенные данные свидетельствуют также, что в сравниваемых концентрациях аспераза вызывает такой же прирост тирозина, как и трипсин, за исключением концентрации 1,6 ПЕ/мл, в которой она превышает эффект трипсина в 1,7 раза. Протеоли-тнческое действие асперазы в концентрациях 0,04 и 0,5 ПЕ/мл не уступает террилитину, а в более высоких концентрациях (1,6 и 3 ПЕ/мл) она превышает его по действию в 2-1,8 раза. Причем, увеличение концентрации террилитина до 5 ПЕ/мл не приводит к достижению эффекта, получаемому от действия асперазы в концентрациях 1,6 и 3 ПЕ/мл.
В исследовании по изучению длительности действия (0,5, 5 и 24 часа) на ожоговый струп асперазу испытывали в оптимальной концентраций - 1,6 ПЕ/мл. Сравнительное изучение проводили с трипсином в соответствующей концентрации.
Полученные результаты, приведенные в табл. 3.1., свидетельствуют, что с увеличением времени воздействия ферментных препаратов на субстрат возрастает прирост тирозина, однако полного (100$) лизиса субстрата в обоих случаях не наблюдается.
Влияние асперазы на экссудативную фазу воспаления
Влияние на экссудативную фазу воспаления изучали на моделях с субплантарным введением различных флогогенных агентов: формалина (по методу Ю.А.Стрельникова, I960) и аэросила на мышах массой 20 г; цельного яичного белка (по методу G.j.Martin, 1957) на крысах массой 90 г. Величину отека регистрировали весовым методом через 24 часа (аэросильный и формалиновые отеки) или через 1,5 часа (белковый отек) после введения флогогеиного вещества. Асперазу испытывали на модели белкового отека в дозах от 0,005 до 0,2 ПЕ/кг при ПОДКОЕ-ном введении; на модели аэросильного отека при внутрибрюшин-ном введении в дозах от 0,02 до 0,4 ПЕ/кг; на модели формалинового отека в дозах от 0,01 до 0,12 ПЕ/кг при внутрибрю-шинном введении. Асперазу на модели белкового отека вводили до введения флогогенного вещества и спустя 30 минут, на модели аэросильного и формалинового отеков - до введения аэросила и формалина и через 5 часов. Эффект регистрировали на пике отечной реакции. Изучение проводили сравнительно с трипсином и химотрипсином.
При расчете эффективной дозы и ее доверительных границ пользовались графическим способом (методом регрессионного анализа - Я.И.Хаджай, 1965). Терапевтический индекс рассчитывали отношением дозы ДБ.50 к оптимально эффективной дозе (ЭД50).
Данные, представленные в табл. 4.1. и на рис. 4.1 свидетельствуют, что на модели белкового отека максимальное противоотечное действие асперазы, выраженное на 55,6$, отмечается в дозе 0,02 ПЕ/кг. Дальнейшее увеличение дозы не приводит к большему ингибированию отека. Из данных табл. и рис. также видно, что по, противовоспалительному действию аспераза не уступает трипсину (некоторая тенденция к более выраженному противовоспалительному действию асперазы в дозе 0,02 ПЕ/кг по сравнению с трипсином недостоверна). Доза, угнетающая воспаление на 50$, равна для асперазы 0,02+0,007ПЕ/кг, для трипсина - 0,02+0,008 ПЕ/кг Индекс широты фармакологического действия асперазы при подкожном введении составляет 8340.
Как видно из табл. 4.2. и рис. 4.1., максимальное инги-бирование аэросильного отека асперазой, выраженное на 48,8$, отмечается в дозе. 0,2 ПЕ/кг. Увеличение дозы в 2 раза не приводит к статистически достоверному уменьшению величины отека. Следовательно, оптимальной является доза 0,2 ПЕ/кг,
Химотрипсйн максимально ингибирует отек в дозе 0,1 ПЕ/кг. Причем, выраженность его противоотечного эффекта на 11,8$ меньшая по сравнению с асперазой в оптимальной дозе. Более того, химотрипсйн с увеличением дозы до 0,4 ПЕ/кг не только не уменьшает отек, но даже усиливает воспаление по сравнению с контролем.
Фябринолитическое действие асперазы in vitro и in vivo
Исследование проводили в опытах на фибриновых пластинах по методу QVAstrup, S.Mullertz (1952), а также определяли спонтанную фибринолитическую активность по методу Н.А.Жуковой, С.С.Хнычева (1975) на крысах массой 180-220 г.
Для работы с фибриновыми пластинами использовали Ленинградские тромбин (содержащий плазминоген). В одной чашке Петри (диаметр 9,2 см) ставили 4 параллельных пробы. Асперазу испытывали в концентрациях от 0,1 до 3 мг/мл. Действие на фибриновых пластинах сравнивали с террилитином.
Метод определения спонтанной фибринолитической активности основан на измерении величины оптической плотности раствора гемоглобина, выделившегося при лизисе кровяного сгустка.Аспе-разу испытывали при внутривенном введении крысам в максимально переносшой дозе (3,2 ПЕ/кг), в 10 раз меньшей (0,32 ПЕ/кг) и в дозе, в которой наблюдалось противовоспалительное действие (0,02 ПЕ/кг). Фибрянолитическую активность крови оценивали в. динамике через 4, 60, 120, 180 минут, а также в некоторых случаях и 24 часа после введения фермента.
Как видно из табл. 5.1 , фибринолитическая активность ас-перазы и террилйтина на фибриновых шистинах зависит от концентрации. Максимальное действие, оцениваемое в виде 100$ лизиса фибриновых пластин, наблюдается под влиянием асперазы в концентрации 3 мг/мл, а под влиянием террилйтина - 2 мг/мл. ЕСзо» рассчитанная графическим методом, составляет для асперазы 2,24+1,76 мг/мл, для террилйтина - 1+0,78 мг/мл (различие недостоверно, Р 0,5). Эти данные свидетельствуют о прямом ли-зирующем действий асперазы и террилйтина на фибрин.
Влияние мази асперазы на состояние ожоговых ран
Экспериментальные стандартные ожоги вызывали у крыс обоего пола, массой 220-250 г. Животных фиксировали в станке и под эфирным наркозом на депилированную поверхность спины наносили спиртово-марлевый ожог минутной экспозиции. Площадь ожога составляла 3% поверхности тела животных, интенсивность ожога характеризовалась 3-А - 3-Б степенями. Применение мази асперазы и сравниваемых препаратов осуществляли закрытым способом ежедневно, начиная с 4-го дня после нанесения ожога, до полного очищения ран от некротических масс. Лизированные продукты удаляли ватным тампоном, смоченным раствором перекиси водорода. Асперазу испытывали в форме мази с содержанием протеолитичес-ких единиц фермента в I г мази, равным 0,5, 1,6 и 3. Сравнительное изучение проводили с мазью "Ируксол" и раствором трипсина в разведении 25-50 мг в 10-20 мл вероналового буфера (рН 8), рекомендуемом для очищения ран от некротических тканей.
Поставлено 7 серий опытов, в каждой по 30 животных. У животных I, 2, 3, 4, 5 серий ожоговые раны обрабатывались мазью асперазы соответственно с 0,5, 1,6, 3 ПЕ/г, раствором трипсина, мазью "Ируксол", 6 группа - контрольная (нелеченные животные); 7 группа - животные обрабатывались основой мази асперазы. Эффективность лечения оценивали по размягчению ожогового струпа, уменьшению его площади, времени отторжения и появлению грануляции, а также по результатам патоморфологического изучения ожоговых ран. Для гистологических исследований животных забивали декапитацией на 3, 7, 10, 14, 17 и 21 сутки. Из раны вырезали участки в виде полоски с захватом неповрежденных тканей. Фиксацию проводили в 10$ формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в целлоидин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Изучение микропрепаратов и мор-фометрию проводили с помощью окулярной сетки на микроскопе МБИ-3.
Проведенные исследования показали, что в контрольных опытах в течение 8 дней после нанесения ожога на фоне отечности и гиперемии происходит формирование ожогового струпа (его уплотнение и утолщение). Спустя 14 суток отмечается незначительное, примерно на 10$, отторжение струпа по краям раны. Основная же часть струпа остается плотно связанной с раневой поверхностью. Первичное отторжение струпа происходит спустя 21 сутки после нанесения ожога. Затем рана покрывается вторичным струпом, причем в части опытов отмечается наличие гнойного содержимого под ним; у некоторых животных раны покрываются гнойно-фибринозным налетом. Полное заживление ожоговых ран у одной трети животных наступает спустя 32-36 суток, в половине взятых в опыт живот-ных-спустя 47-52 суток, у остальных животных - спустя 60 и более суток раны продолжают оставаться покрытыми плотными сухими струпами. Примерно аналогичное состояние лизиса и заживления ожоговых ран отмечается в случае применения мазевой основы ас-перазы.
