Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Патогенетические механизмы кашля 8
1.2 Современные лекарственные препараты, использующиеся для лечения кашля 19
1.3 Биологическая активность веществ в сверхмалых дозах 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 56
3.1 Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к морфину 56
3.1.1 Исследование противокашлевой активности потенцированных антител к морфину на модели кашля, индуцированного лимонной кислотой 56
3.1.2 Исследование противокашлевой активности потенцированных антител к морфину на модели кашля, индуцированного капсаицином ... 61
3.2 Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к брадикинину 68
3.2.1 Исследование влияния препарата АТБ на кашлевой рефлекс морских свинок на модели кашля, индуцированного лимонной кислотой 68
3.2.2 Исследование влияния препарата АТБ на кашлевую реакцию морских свинок на модели капсаицин-индуцированного кашля
3.3 Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к брадикинину на модели кашля, вызванного капсаицином у сенсибилизированных овальбумином морских свинок 77
3.4 Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к гистамину
3.4.1 Исследование влияния препарата АТГ на кашель у морских свинок, индуцированный лимонной кислотой 81
3.4.2 Исследование влияния препарата АТГ на кашель у морских свинок на модели кашля, индуцированного капсаицином 85
3.5 Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к серотонину 90
3.5.1 Исследование влияния препарата АТС на кашель у морских свинок на модели кашля, индуцированного лимонной кислотой 91
3.5.2 Исследование влияния препарата АТС на кашель у морских свинок на модели кашля, индуцированного капсаицином 96
3.6 Изучение бронхолитической активности сверхмалых концентраций антител к серотонину и гистамину на моделях серотонин- и гистамин индуцированной контрактуры изолированной трахеи морских свинок... 101
Заключение 108
Выводы 109
Список литературы
- Биологическая активность веществ в сверхмалых дозах
- Исследование противокашлевой активности потенцированных антител к морфину на модели кашля, индуцированного капсаицином
- Исследование влияния препарата АТБ на кашлевую реакцию морских свинок на модели капсаицин-индуцированного кашля
- Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к серотонину
Биологическая активность веществ в сверхмалых дозах
Рефлекторное раздражение воспринимается кашлевыми (туссогенными) рецепторами (КР). Как показали гистологические исследования, КР располагаются среди эпителиальных клеток практически по всем воздухоносным путям млекопитающих и человека (Das RM et al., 1978; Elftman AG. 1943; Honjin R. 1956; Gaylor JB. 1934). В обеспечении кашлевого рефлекса принимают участия рецепторы, относящиеся к различным группам. Среди основных групп кашлевых рецепторов выделяют: рецепторы быстрой адаптации или ирритантные (англ.: rapidly-adapting stretch receptors — RAR), рецепторы медленной адаптации (англ.: slowly adapting stretch receptors — SAR) и рецепторы С-волокон (Irwin RS. et al., 1998; Hadjikoutis S. et al., 1999; Chang AB. 1999). RAR- и SAR-рецепторы ассоциированы с нервными окончаниями тонких миелинизированных А5-волокон (Chang АВ. 1999) и являются, по сути, механорецепторами (Clerf LJ. 1947). Механорецепторы расположены в эпителии дыхательных путей (Chang АВ. 1999) и отвечают возбуждением на прикосновение и смещение (Irwin RS et al., 1998; Sant Ambrogio G. 1987). При этом RAR-рецепторы оцениваются как основное рецепторное звено в кашлевом рефлексе (Widdicombe JG. 19966). В максимальном количестве они выявляются п задней стенке трахеи, в областях бифуркации трахеи и местах деления крупных бронхов, и менее представлены в отделах, расположенных дистальнее (Irwin RS et al., 1998; Sant Ambrogio G. 1987). Считается, что на уровне респираторных бронхиол и дистальнее механорецепторы вообще не определяются (Tatar М et al., 1994). Гортань и трахеобронхиальная область чувствительны и к механической и к химической стимуляции, в то время как большинство туссогенных зон внелегочной локализации характеризуются восприимчивостью только к механической стимуляции (Widdicombe JG. 1964). Возможно, что исключение составляет кашель, ассоциированный с наличием гастро-эзофагеального рефлюкса (Irwin RS et al., 2000). Рецепторы С-волокон, преимущественно являясь хеморецепторами, локализуются в толще стенки альвеол и дистальных отделов воздухоносных путей (легочные и бронхиальные, соответственно, Chang АВ. 1999) и стимулируются газовыми примесями во вдыхаемом воздухе и изменением рН, но помимо этого, медиаторы воспаления также могут приводить их в состояние возбуждения (Widdicombe JG. 1995). Хеморецепторы концентрируются в основном в области гортани и бронхах, и заметно менее - в трахее (Chang АВ. 1999). Однако, по данным некоторых авторов (Tatai М. et al., 1994), трахеобронхиальная область более чувствительна и к механической, и к химической стимуляции, чем область гортани. Следует подчеркнуть, что хотя RAR и оцениваются как ведущие кашлевые рецепторы, во всех случаях кашлевой стимуляции (и механической и химической) происходит взаимодействие между всеми видами рецепторов, при этом, SAR-рецепторы опосредуют бронходилатацию, a RAR- и рецепторы С-волокон — бронхоконстрикцию (Canning BJ. 2002). Несмотря на то, что применение веществ, известных как специфических стимуляторов С-волокон, и вызывает кашель, по мнению Карлссон, выделяющиеся из нервных окончаний С-волокон медиаторы воспаления вторично могут возбуждать и RAR-рецепторы, а также могут наблюдаться и другие реакции взаимодействия (Karlsson JA et al., 1988). Например, как показали исследования, обладая чрезвычайно выраженной пластичностью, RAR-рецепторы способны начать синтезировать тахикинины под влиянием вирусной инфекции, в то время, как в «здоровом» состоянии они к этому не способны (Undem В J, et al., 2002). В этом случае, реагируя на механическую стимуляцию, RAR-рецепторы высвобождают тахикинины, что приводит к стимуляции «хемочуствительных» рецепторов С-волокон. Это, в свою очередь, запускает помимо кашля дополнительное высвобождение тахикининов, развитие бронхообструкции и отека, и, в конченом счете, дополнительную механическую стимуляцию RAR-рецепторов.
Далее импульс по афферентным нервам (ветви блуждающего, тройничного, возвратного и диафрагмального нервов) проводится в кашлевой центр. При этом импульсы от кашлевых рецепторов трахеобронхиального дерева и гортани проводит блуждающий нерв, а тройничный и возвратный нервы передают импульсы от глотки, полости носа и придаточных пазух. Центральные пути прохождения и механизмы развития кашля также до сих пор не полностью выяснены (Chang А.В. 1999; Widdicombe JG. 1995). Считается, что кашлевой центр локализован в продолговатом мозге в области ядра одиночного пути - nucleus tractus solitarius, NTS (Widdicombe JG., 1995, Widdicombe JG., 1986; Korpas, J. et al., 1979), при этом есть данные, что так называемый «кашлевой центр» не является единым анатомическим образованием (Fuller RW, Jackson DM. 1990; Fuller RW, 1991), он расположен диффузно, в частности, в области моста (Scarpelli ЕМ, 1989) и имеет тесные связи с дыхательными центрами и ретикулярной формацией.
Высказывают предположение, что легочные механорецепторы играют важную роль в реализации кашля, вероятно, через центральное облегчение экспираторной фазы (Sant Ambrogio G. 1993, Widdicombe JG., 1995). Каудально расположенное ядро одиночного тракта (NTS) является первым пунктом в центральном звене, куда попадает афферентная импульсация с легочных кашлевых рецепторов (Kubin L., Davies R. О., 1995). Нейроны второго порядка, продолжающие афферентные пути кашлевого рефлекса, проецируются в область продолговатого мозга, где, как известно, располагаются группы нейронов, участвующие в контроле интактного дыхания (Ezure, К. et al., 1991; Otake К et al., 1992). Таким образом, возможно, что NTS нейроны (второго порядка) влияют на нейрональную сеть, располагающуюся в вентролатеральных отделах продолговатого мозга и обеспечивающую процесс дыхания (Shannon R. et al., 1996, Shannon R., 1997, Shannon R. et al., 1998).
Кроме того, общеизвестно, что реализация кашлевого рефлекса находится под контролем коры головного мозга. Интересно, что опиаты, реализующие свои противокашлевые свойства через влияние на центральные механизмы кашля, тем не менее, не влияют на произвольно осуществляемое подавление кашля здоровыми испытуемыми (Hutchings НА, Eccles R., 1994).
В кашлевом центре при участии ретикулярной формации организуется сложнокоординированная реакция дыхательных мышц и мышц дыхательных путей. К органам-эффекторам (основные и вспомогательные экспираторные и инспираторные мышцы, мышцы верхних и нижних дыхательных путей) импульс передается по эфферентным нервам (двигательные волокна тройничного, лицевого, подглоточного, блуждающего, диафрагмального, межреберных и поясничных нервов).
Исследование противокашлевой активности потенцированных антител к морфину на модели кашля, индуцированного капсаицином
Существующие попытки объяснить механизмы этого явления, в основном, сводятся к указаниям на особые свойства растворителя, которые он приобретает в процессе растворения в нем какого-либо вещества.
Так, согласно работ В.Н.Сорокина (1997), при растворении вещества в водно-спиртовом растворе во время механической обработки (встряхивание, ультразвук) происходит диссоциация молекул воды с образованием иона гидроксония. Автор выдвигает гипотезу, что во время диссоциации отделяющийся в присутствии растворяемого вещества протон несет на себе частотные характеристики именно этого вещества (так, называемый «информационный» протон). В дальнейшем, по мере последовательного разведения и механической обработки в каждом последующем растворе накапливаются не только ионы гидроксония (Н+инф + Н20=НзО+ИНф), но и более сложные структуры, вплоть до структуры, имеющей форму тетраэдра и состоящей из 4 молекул воды и одного протона (Н+И„ф + 4хН20=Н904+инф)-Данная структура является наиболее устойчивой и долгоживущей. По сути, она выступает качестве ячейки хранения колебательных состояний электронной подсистемы, полученных от молекул растворяемого вещества в ходе протонного переноса на молекулы воды. Именно из таких структур, с точки зрения автора, состоит сверхразбавленный потенцированный раствор. Таким образом, можно сказать, что по мере увеличения степени «разбавленности» раствор (при потенцировании) приобретает все большее возрастает когерентность колебаний отдельных. Новая структура спиртового раствора является специфической средой, в которой протон и водородная связь, получившие заданные свойства от растворяемого вещества в ходе механохимических реакций, становятся стандартным транслятором этой информации. С точки зрения других авторов сами молекулы воды, обладая полярностью, в процессе растворения выстраиваются вокруг молекул растворяемого вещества и, определенным образом структурируясь, «запоминают» характеристики этого вещества. Подобным образом объясняют наличие в потенцированном растворе фармакологической активности, специфичной для когда-то растворенного в нем вещества Реш Г. (1994)иЗенинС.В. (1997).
Исследования последних лет, посвященные явлению фармакологической активности СМД веществ, находящихся в потенцированных растворах, характеризуются достаточно высоким методологическим уровнем. По своей направленности можно выделить работы, описывающие физико-химические характеристики сверхразбавленных растворов, а также большую группу собственно фармакологических исследований. Эти исследования либо подтверждают способность сверхмалых доз вещества влиять на ту или иную функцию организма, либо на токсикологических моделях демонстрируют возможность с помощью вещества в СМД уменьшить токсическое влияние того же вещества в значимых дозах.
Так, в ходе исследований фармакологических свойств сверхразбавленных растворов оксида трехвалентного мышьяка (AS2O3), содержащих действующее вещество в условной концентрации 10 и 10 массовых долей, было показано, что сверхмалые дозы AS2O3 уменьшают цитотоксичность, генотоксичность и общую токсичность, воспроизводимые на лабораторных животных с помощью значимых доз (1 мг/кг) оксида трехвалентного мышьяка (Mitra К., et al., 1998; Mitra K.et al., 1999; Datta. S. et al., 1999a; Datta S. et al., 1999b). Аналогичные наблюдения были получены Cazin J.C. et al., (1987). С помощью радиоактивной метки было показано, что скорость элиминации мышьяковистого ангидрида возрастала на фоне введения сверхмалых доз данного вещества (10 ,4М). По данным Datta S. et al., (2002), сверхмалые дозы сульфата кадмия (CdSC 4, 10 60 и ю-400 М) обладали способностью предотвращать генотоксическое влияние на мышей хлорида кадмия, вводимого в дозировке 0,8 мг/кг внутрибрюшинно. Другие авторы сообщают о способности глутамата в сверхмалых дозах предотвращать токсические эффекты больших доз глутамата (Jonas W et al., 2001). Профессор С. Doutremepuich с соавт. сообщают о способности ацетилсалициловой кислоты в СМД (Ю-60 М) нейтрализовать действие значимых (100 мг/кг) доз этого препарата и снижать риск кровоточивости при условии введения СМД ацетилсалициловой кислоты спустя 2 и 3 часа, но не через 1 час после приема значимой дозы препарата (Aguejouf О et al., 2000). Вместе с тем, рЪнее те же авторы показали развитие мощного антигеморрагического эффекта при одновременном введения ацетилсалициловой кислоты в СМД (Ю-60 М) и в дозе 100 мг/кг (Belougne-Malfatti Е. et al., 1998). Jonas WB. (1999) продемонстрировал возможность оказывать протективное действие (отсрочивание смерти, снижение процента погибших особей) у мышей, подвергнувшихся заражению туляремией с помощью раствора, содержащего сверхмалые концентрации возбудителя туляремии, однако данный эффект выражен слабее, чем при проведении стандартной вакцинации.
Исследование влияния препарата АТБ на кашлевую реакцию морских свинок на модели капсаицин-индуцированного кашля
После воздействия ATM в дозе 40 мкл количество кашлевых толчков снижалось с 11,3±0,93 в контроле до 6,3±0,63 в опыте. Увеличение дозы ATM в 2 раза не вызвало изменения эффекта: среднее количество кашлевых толчков !1,63±1,0 и 6,13±0,81, для контроля и опыта, соответственно. Данные различия были статистически значимы (р 0,001). Торможение кашля под влиянием ATM составило 42,96±4,77% и 46,78±5,11% для доз 40 мкл и 80 мкл, соответственно.
Важно подчеркнуть, морфина гидрохлорид, вводимый перорально в дозе 10 мкг/кг, практически не оказал влияния на кашлевую реакцию, индуцированную капсаицином (табл. 8).
Влияние ATM в дозах 40 мкл и 80 мкл и морфина гидрохлорида (МГ) в дозе 10 мкг/кг (перорально) на показатели кашлевой реакции морских свинок, индуцированной капсаицином Группы животных Среднее количество кашлевых толчков (М±т) Торможениекашлевой реакции(%) М±т до лечения после лечения ATM 40 мкл 11,3±0,93 6,3±0,63 42,96±4,77 ATM 80 мкл 11,63±1,0 6,13±0,81 46,78±5,11 МГ 12,0±0,97 11,5+0,91 4,36±4,77 —р 0,00] по отношению к исходному уровню 0 %о лечения) Среднее (М±т) 76,10±2,81 42,96±4,77 р 0,001 по отношению к исходному уровню (до лечения) Возможно, отсутствие эффекта от морфина в условиях данной модели обусловлено низкой дозой. Так, Bolser D.C. (1999) сообщает о способности морфина и кодеина при введении в вертебральную артерию подавлять кашель в дозах 1-Ю мкг/кг. Другие авторы сообщают об использовании более высоких доз: 8,1 мг/кг при пероральном введении (Foss J.F., et al., 1996), 1-1,22 мг/кг внутривенно (Kamei J., et al., 1987), 0,7-2,4 мг/кг под кожу и 1,2-1,9 мг/кг внутривенно (Adcock J.J., et al.,1988). Мы в наших исследованиях опирались на работу Xiang А. и др., (1998), в которой в качестве эталонного препарата использовался также опиоидное производное, близкое по противокашлевой активности к морфину, — кодеин. В данном исследовании кодеин применяли перорально в дозе 5мкМ/кг, то есть 1,5 мг/кг.
Следует отметить, что способность сверхмалых доз антител к морфину тормозить кашель, вызванный капсаицином была также менее выражена, чем торможение кашля, вызванного лимонной кислотой (табл. 9). Очевидно, необходимо учитывать тот факт, что при ингаляции капсаицина отмечается развитие каскада реакций с участием ряда провоспалительных нейропептидов, и прежде всего, субстанции Р, что в свою очередь способствует развитию нейрогенного воспаления и включению дополнительных механизмов реализации кашлевого рефлекса. По-видимому, в этом случае применение противокашлевых препаратов с центральным механизмом действия, подобных опиоидным веществам не оказывается эффективным, что подтверждается также и литературными данными (Schroeder К., 2002, Eccles R, et al., 1992).
Таким образом, сверхмалые дозы антител к морфину вызывали отчетливый противокашлевой эффект. Можно предположить, что их способность подавлять кашель обусловлена модифицирующим влиянием на центральные и периферические опиоидные рецепторы, при этом ATM в сверхмалых дозах действуют аналогично морфину (как анти-антитела), который как известно, является агонистом опиатных, в том числе и \1- и 5-рецепторов.
Согласно данным литературы брадикинин способен вызывать разнообразные эффекты в дыхательной системе (кашель, бронхоконстрикция, экстравазация плазмы, высвобождение нейропептидов). По мнению некоторых исследователей (Fox et al. 1993), брадикинин участвует в реализации кашлевого эффекта посредством стимуляции как С-волокон, так и А5-волокон дыхательных путей. По различным наблюдениям, брадикинин обладает как прямыми (Barnes PJ 1992), так и опосредованными через тахикинины эффектами (Lundberg, 1995). Чрезвычайно интересно, что по данным коллектива исследователей во главе с М.А. Мягковой, у всех больных эссенциальной гипертензией I—II степени, у которых был выявлен кашель при лечении эналаприлом (38,3%) и диротоном (13,3%) в сыворотке крови определялся повышенный уровень естественных антител к брадикинину (Aleksandrov OV, et al., 2002).
Это обстоятельство побудило нас исследовать, каким образом антитела к брадикинину могут влиять на интенсивность кашля, вызываемого у морских свинок лимонной кислотой и капсаицином.
В 2 группах морских свинок по семь животных в каждой в первый день исследования вызывали кашель ингаляцией лимонной кислоты, как описано выше. Предварительное тестирование морских свинок по реакции на лимонную кислоту показало, что животные проявили высокую чувствительность к воздействию ирританта. Среднее количество кашлевых толчков у нелеченных животных составило 20,86±2,69 для первой и 19,86±2,2 для второй групп (табл. 10 и 11). В группе животных, получавших лечение АТБ в дозе 40 мкл (табл. 10) среднее количество приступов кашля снижалось до 14,57±1,15 (р 0,05).
Изучение противокашлевой активности потенцированных антител к серотонину
Как видно из данных таблицы 36, введение антител к серотонину в дозе 80 мкл вызывало в целом уменьшение количества приступов кашля с 19,56±3,271 до 15,56±2,062 (однако, статистической достоверности данные различия не имеют — р=0,3173). Как и в предыдущем случае, кашлевая реакция морских свинок на лимонную кислоту после лечения была неоднозначной: у части животных было отмечено уменьшение кашля (№№1, 3, 7, 9, табл. 37), у другой части (животные №№ 2, 4, 5, 6, 8) — кашель практически не изменялся или незначительно усиливался по сравнению с исходными данными (табл. 38).
В группе высокореактивных на введение АТС животных показатели кашля уменьшились до 13,0±1,29 (по сравнению с исходным уровнем 25,75±4,85; р 0,05), в то время, как среди животных, относящихся к подгруппе малочувствительных животных среднее количество кашлевых толчков изменилось с 14,6±3,25 до 17,6±3,46. Соответственно этим данным торможение кашлевой реакции было небольшим для группы в целом, но значительным для 1-й подгруппы (табл. 39). Таблица 39. Торможение кашлевой реакции, индуцированной лимонной кислотой, под влиянием антител к серотонину (80 мкл) в группах морских свинок с различной чувствительностью к АТС.
На модели кашля, индуцированного лимонной кислотой выявлен неоднозначный эффект антител к серотонину, который зависел не столько от дозы АТС, сколько от индивидуальной реактивности животного (табл. 40). Так, АТС в дозах 40 мкл и 80 мкл способны подавлять кашель на 31% и 20%, соответственно в группах в целом и практически в два раза снижать кашель в подгруппах высокочувствительных животных. Таблица 40. Сводные данные торможения под влиянием АТС в дозах 40 и 80 мкл кашлевой реакции морских свинок на лимонную кислоту. Группы с различной реактивностью, данные в разные периоды наблюдения Дозы:
Результаты изучения влияния АТС в дозе 80 мкл на кашель, вызванный ингаляцией капсаицина, отражены в таблицах 41 и 42. В этом разделе работы кашлевая реакция была подвергнута более подробному анализу: регистрировали не только кашлевые толчки, сопровождающиеся громким звуком, но и, так называемое, подкашливание («фырканье»). Характер кашля, вызванного у морских свинок ингаляцией капсаицина, представлен в таблице 41. — р 0,05 по отношению к аналогичному показателю до лечения; — р 0,01 по отношению к аналогичному показателю до лечения; # — р 0,05 по отношению к аналогичному показателю за 10 минут в группе после лечения; " — р 0,005 по отношению к аналогичному показателю за 10 минут в группе после лечения Как видно из таблиц 41 и 42, антитела к серотонину в группе в целом не оказывали значительного противокашлевого действия: среднее количество кашлевых толчков практически не изменилось (12,8±1,93 и 11,2±1,99 — до и после лечения, соответственно). Однако наблюдаются различия в отдельных компонентах кашлевой реакции. Так, среднее количество кашлевых толчков, сопровождающихся громким звуком за период первых 10 минут уменьшилось (5,4±1,03 и 1,6±0,4, до и после лечения, соответственно, р 0,01). Также уменьшился аналогичный показатель «фырканья» за 20 минут наблюдения (3,4±0,6 и 0,6±0,6, до и после лечения, соответственно, р 0,05). При сравнении характера кашлевой реакции в первые 10 и последующие 20 минут после лечения АТС было отмечено, что «фырканье» был значимо меньше выражено во второй период наблюдения (6,4±1,33 и 0,6±0,6, за 10 и за 20 минут, соответственно, р 0,005).
Соответственно представленным данным торможение кашлевой реакции при суммарном учете всех видов кашлевых толчков практически отсутствует. Однако при сравнении показателей собственно кашля (кашлевые толчки с отчетливым звуком) выявляется подавление кашля на 43,24% (среднее количество кашлевых толчков у интактных животных 7,4±1,5, после лечения АТС — 4,2±0,92). Следует отметить, что максимальное торможение кашля развивалось в первые десять минут: оно составило 70,37% (количество кашлевых толчков уменьшилось с 5,4±1,03 до 1,6±0,4 в контроле и опыте, соответственно, р=0,0088). В последующий двадцатиминутный период наблюдения выраженность кашлевой реакции практически не претерпевала существенных изменений. Таким образом, влияние АТС в дозе 80 мкл на кашель, вызванный ингаляцией капсаицина, заключалось, прежде всего, в изменении характера кашля (уменьшения его за счет снижения кашля в первые 10 минут).
В таблице 43 отражены изменения выраженности кашля, вызванного капсаицином у каждого животного (собственно кашель и «подкашливание») в различные промежутки времени (первые 10 минут и последующие 20 минут наблюдения) до и после лечения АТС. Таблица 43. Динамика показателей кашля, индуцированного капсаицином, у отдельных животных.
