Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1. Методы стимуляции неоангиогенеза при сосудистой патологии 11
1.2. Роль аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в неоангиогенезе 15
1.3. Биологические эффекты препарата «Миелопид» 19
1.4. Методы исследования магистрального кровотока и микроциркуляторного русла при ХИНК 22
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 27
2.1. Материалы и методы экспериментальных исследований 27
2.1.1. Характеристика контрольной серии животных 28
2.1.2 Характеристика опытной серии животных 29
2.1.3 Методика лазерной допплеровской флоуметрии 31
2.1.4 Моделирование ишемии тканей задней конечности крысы 34
2.1.5 Методы морфологического исследования 37
2.2. Общая характеристика обследованных больных 37
2.3. Методы клинического исследования 40
2.4. Статистическая обработка результатов исследований 48
ГЛАВА III. Результаты экспериментальных исследований...49
3.1. Динамика симптоматических проявлений, флоуметрических и морфологических изменений на разных сроках при моделировании ишемии конечности у крыс контрольной серии. 49
3.2. Динамика симптоматических проявлений, флоуметрических и морфологических изменений в мышцах ишемизированнои конечности на разных сроках у крыс, получавших плазму, обогащенную тромбоцитами 59
3.3. Динамика симптоматических проявлений, флоуметрических и морфологических изменений в мышцах ишемизированнои конечности на разных сроках у крыс, получавших "Миелопид" 65
3.4. Динамика симптоматических проявлений, флоуметрических и морфологических изменений в мышцах ишемизированной конечности на разных сроках у крыс, получавших комбинированное лечение 69
ГЛАВА IV. Результаты клинических исследований 73
4.1 . Результаты исследования периферического кровообращения и микроциркуляции у больных с хронической ишемией нижних конечностей 73
4.2.Технология лечения пациентов исследуемой группы аутоплазмои, обогащенной тромбоцитами 79
4.3. Результаты лечения в исследуемой группе 85
Заключение 90
Выводы 104
Практические рекомендации 105
Список литературы 106
- Методы исследования магистрального кровотока и микроциркуляторного русла при ХИНК
- Моделирование ишемии тканей задней конечности крысы
- Динамика симптоматических проявлений, флоуметрических и морфологических изменений в мышцах ишемизированнои конечности на разных сроках у крыс, получавших плазму, обогащенную тромбоцитами
- Результаты исследования периферического кровообращения и микроциркуляции у больных с хронической ишемией нижних конечностей
Введение к работе
ХОЗАНК составляют более 20% от всех видов сердечно-сосудистой патологии, что соответствует 2-3%) от общей численности населения и 35-50% от численности лиц старше 60 лет [25, 84, 40, 101]. Особенностью этих заболеваний является тенденция к неуклонному прогрессированию процесса, высокой степени инвалидизации, ампутациям и летальности. Несмотря на широкое распространение различных видов реконструктивных оперативных вмешательств и прогресс в разработке и создании многочисленных моделей имплантатов, не всегда удается добиться адекватной перфузии ишемизированных тканей. Проблема раннего послеоперационного тромбоза шунтов и протезов связана с отсутствием у больных воспринимающего дистального русла, что в условиях увеличивающегося притока крови после операции приводит к осложнениям [104].
По данным М.И. Лыткина и И.Г. Перегудова [56], при естественном течении атеросклеротического поражения, в частности в аорто-подвздошном сегменте, более 1/3 больных умирает в первые 5-8 лет от начала болезни, а в 25 -50% случаев за этот же срок проводится ампутация пораженной конечности. Даже при лечении пациентов в условиях специализированного стационара количество ампутаций достигает 10 - 20% , а летальность - 15% [11, 39, 77, 103]. Через 5 лет после ампутации умирает, по данным Э.А. Каримова, 6% больных [43].
В последнее время возрос интерес к возможностям ангиогенеза в лечении облитерирующих заболеваний, основным патогенетическим звеном которых является ишемия тканей [133, 179, 129]. Повышение компенсаторных возможностей микроциркуляторного русла может быть достигнуто за счет увеличения плотности и общей площади капиллярной сети, что достигается путем стимуляции неоангиогенеза в ишемизированной конечности [104, ПО, 139]. Для улучшения кровообращения активно разрабатываются методы стимуляции неоангиогенеза путем введения в организм ангиогенных факторов
роста (Т. Asahara et al., 1999): сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР), фактора роста фибробластов (ФРФ), тромбоцитозависимого фактора роста (ТФР). Также используется генная инженерия для введения трансформированных генов с целью стимуляции развития сосудов в области ишемии (I. Baumgartner et al., 1998; А.А. Бокерия, 2000; В.В. Давыденко и др., 2000; Б.А. Константинов и др., 2003). Однако все эти факторы роста в организме быстро разрушаются и появляется необходимость повторных введений, что вызывает ряд побочных эффектов: выраженную вазодилатацию с развитием гипотензии, возникновение сосудистых новообразований в виде гемангиом. Генная инженерия пока находится только на экспериментальном уровне и ее методы недоступны практическому здравоохранению. В связи с этим продолжается поиск новых факторов неоангиогенеза, ангиогенные свойства которых максимальны, а побочные эффекты сведены к минимуму.
Более 30 лет назад была показана возможность усиления неоваскулогене-за путем введения в ишемизированные ткани конечностей цельной аутокрови [16,17,119].
Известно, что в тромбоцитах в большом количестве содержатся факторы роста, стимулирующие образование новых сосудов: VEGF-сосудистый эндоте-лиальный фактор роста, FGF-фактор роста фибробластов, PDGF-тромбоцитарный фактор роста, TGF-трансформирующий фактор роста, VPF-сосудистый фактор проницаемости, EDGF-эпидермальный фактор роста (Sand-berg et all., 2001). Введение ангиогенных ростовых факторов в зону ишемии приводит к развитию коллатерального кровообращения и улучшению микроциркуляции в пораженном органе [28, 150].
В Российской Федерации в настоящее время не зарегистрировано ни одного лекарственного препарата с очевидными доказательствами клинической эффективности применения у пациентов с перемежающейся хромотой [85]. Несмотря на устоявшиеся программы консервативного лечения больных ХО-ЗАНК, целостное представление о фармакологической стимуляции неоан-
гиогенеза в полной мере не сформировано. Стимуляция неоангиогенеза в пораженной конечности и активация коллатерального кровообращения -одно из перспективных направлений лечения [28].
В связи с вышеизложенным интересным является изучение эффективности аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами (аутоБоТП), для лечения хронической ишемии конечности как в эксперименте, так и в клинике, и иммуностимулирующего препарата «Миелопид» пептидной природы, полученного из культуры клеток костного мозга млекопитающих (свиней или телят) в условиях экспериментальной ишемии конечности.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучить эффективность стимуляции неоваскулогенеза при экспериментальной ишемии конечности посредством интрамускулярного введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и применения иммуномодулятора «Миелопид», а также использование аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в пилотном исследовании у больных облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучить влияние интрамускулярного введения обогащенной тромбоцитами плазмы и препарата «Миелопид» на состояние микроциркуляции при экспериментальной ишемии конечности.
Изучить влияние интрамускулярного введения обогащенной тромбоцитами плазмы и препарата «Миелопид» на динамику морфологических изменений при экспериментальной ишемии конечности.
Оценить уровень гемодинамики в магистральных сосудах и сосудах мик-роциркуляторного русла в ишемизированной конечности у больных на фоне создания аутоплазмоинфильтратов под ультразвуковым контролем по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий.
Изучить клинический статус пациентов по шкале Rutherford et. al. и «качество жизни» с помощью опросника MOS SF-Зб, нормированного для сосудистых больных, до и через 6 месяцев после лечения аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами.
Разработать новый способ лечения ХОЗАНК - аутоплазмоинфильтрацию нижних конечностей под ультразвуковым контролем.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Определена положительная динамика уровня микроциркуляции и морфологической картины в ишемизированной конечности крыс на фоне введения плазмы, обогащенной тромбоцитами.
Установлено положительное влияние препарата «Миелопид» на состояние микроциркуляции и морфологическую картину в ишемизированной конечности крыс.
Определено позитивное влияние аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, на макро- и микрогемодинамику в ищемизированной конечности у больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей, а также на их клинический статус и «качество жизни».
Разработан новый способ лечения ХОЗАНК -аутоплазмоинфильтрация нижних конечностей под ультразвуковым контролем, отличающийся от имеющихся тем, что полученную аутоБоТП, вводят по ходу сосудистых сегментов (глубокой бедренной и подколенной артерий) с сохраненным кровотоком.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
1. Доказательство эффективности фармакологической стимуляции неоан-гиогенеза при экспериментальной ишемии конечности с помощью препарата «Миелопид» открывает его новые свойства и позволяет проводить его клиническую апробацию, что расширит спектр консервативных мероприятий в лечении хронической ишемии.
2. Предложенный метод непрямой реваскуляризации посредством интраму-скулярного введения аутоБоТП для стимуляции неоангиогенеза позволяет улучшить результаты лечения больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Возможности применения плазмы, обогащенной тромбоцитами, для улучшения микроциркуляции в ишемизированных тканях при экспериментальной ишемии конечности.
Применение препарата «Миелопид» в условиях экспериментальной ишемии конечности улучшает микроциркуляцию и уменьшает площадь некротизированных тканей.
Технология лечения аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, путем создания аутоплазмоинфильтратов по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий ишемизированной конечности у больных с ХОЗАНК под ультразвуковым контролем.
Комплексная оценка результатов лечения пациентов с облитерирующим атеросклерозом аутоБоТП, основанная на изучении гемодинамики, микроциркуляции, клинического статуса и «качества жизни» больных.
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Результаты выполненных исследований внедрены в работу отделения сосудистой хирургии больницы скорой медицинской помощи МУЗ ГКБ СМП г. Курска. Материалы диссертации используются при проведении занятий со студентами, интернами и ординаторами в Курском государственном медицинском университете.
Основные положения диссертационной работы доложены на III Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной медицинской академией им. Н.Н. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом (г. Воронеж, 2009), заседании научно-
практического общества хирургов Курской области (2008 г), на итоговых научных сессиях Курского государственного медицинского университета (2008, 2009 гг.). По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 - в журналах, рецензируемых ВАК. Получен патент на изобретение: «Способ комбинированного лечения хронической ишемии конечности», № 2353977 от 27.04.2009 г., Курским государственным медицинским университетом приняты 2 заявки на изобретения. Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр хирургических болезней № 1, № 2, ФПО, общей хирургии, фармакологии, клинической фармакологии, оперативной хирургии и топографической анатомии Курского государственного медицинского университета.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация изложена на 126 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Представленный материал иллюстрирован 24 таблицами и 43 рисунками. Библиографический указатель содержит 107 отечественных и 87 иностранных источника.
Методы исследования магистрального кровотока и микроциркуляторного русла при ХИНК
Современные методы диагностики расстройств периферического артериального кровообращения отличаются широтой диапазона: одни используются для уточнения клинического диагноза, характера и степени поражения сосудов, другие для оценки эффективности проводимого лечения либо динамического наблюдения за больными.
Реовазография. Метод, основанный на регистрации изменения электропроводности тканей, связанных с колебаниями степени их кровенаполнения -отражает объемное изменение сосудов при прохождении пульсовой волны [18, 23]. Реовазограмма отражает суммарный (магистральный и коллатеральный) прирост объема артериальной крови в исследуемом органе или сегменте организма по отношению к венозному оттоку за это время. Метод может быть использован для оценки эффективности и выбора оптимального способа лечения ишемии конечности, при этом важны не столько абсолютные показатели реографических индексов, сколько их динамика [88, 102].
Сфигмогршрия позволяет исследовать форму и величину пульса, скорость распространения пульсовой волны, находящейся в зависимости от ряда факторов: сердечного выброса, вазомоторных реакций, эластичности сосудистой стенки и др. У больных с окклюзионными заболеваниями артерий нижних конечностей уменьшается амплитудный градиент пульса, удлиняется время анакроты объемной сфигмографии вследствие замедления кровотока в сосудах. Данный метод дает информацию о качественной характеристике кровотока, но не позволяет количественно оценить нарушения гемодинамики [15].
Ультразвуковая допплерография и ангшсканирование. Для исследования артериальной системы конечностей применяются методы ультразвукового дуплексного сканирования с цветовым допплеровским картированием кровотока и непрерывноволновой допплерографии. Используются следующие режимы сканирования: двухмерный В-режим с высоким разрешением (визуализация кровеносного сосуда и периваскулярных тканей); цветовое допплеровское картирование - цветной допплер (позволяет на основании цветовой картограммы судить о распределении потока в сосуде в режиме реального времени и дать ему качественную оценку); импульсная допплерография - PW-допплер (количественные характеристики кровотока - линейная скорость и объемный кровоток); режим цветового отображения энергии допплеровского спектра - энергетический допплер (оценка состояния кровотока в мелких сосудах и при резком снижении его скорости, не зависящая от скорости, угла и направленности кровотока. Сегодня в комплекс ультразвукового исследования входят прослушивание сигналов кровотока магистральных артерий, их графическая регистрация, подсчет линейной скорости кровотока, измерение регионарного систолического давления (РСД) и определение его индекса, а сегментарное измерение артериального давления на различных уровнях дает информацию о наличии артериальных окклюзии в различных частях конечности. Для количественной характеристики нарушений регионарной макрогемодинамики используется максимальное значение лодыжечного индекса регионарного систолического давления, объемные и скоростные характеристики кровотока[5, 67, 177].
С помощью ультразвукового ангиосканирования (дуплексное, трип-лексное) возможно получение графической характеристики атеросклеротиче-ской бляшки, возможна ее пространственная реконструкция. Ряд авторов отмечает высокую диагностическую информативность ультразвукового дуплексного сканирования при исследовании артерий нижних конечностей малого и среднего калибра. По данным А.Г. Соколовича, чувствительность цветного ультразвукового сканирования для различных сегментов бедренно-подколенной зоны составила 75-96%, специфичность - 94-100%, абсолютное совпадение диагнозов составляло 92-98%, а индекс каппа - 0,82-0,89. По данным П.Э. Айриян, чувствительность цветового дуплексного сканирования составила 99,3%, точность -97,5%, положительное предсказываемое значение - 96,7%, отрицательное пред сказываемое значение - 98,6%. Таким образом, ультразвуковая допплерография и ангиосканирование в ряде случаев превосходят по точности рентгеноконтрастную ангиографию. Методика исследования высокоинформативна, неинвазив-на, проста, не требует больших затрат времени, безвредна для пациентов, следовательно, может применяться многократно для динамического контроля [29, 93, 100, 168].
Ангиография является «золотым» стандартом сосудистой хирургии [87]. Этот метод основан на прямом введении контрастного вещества в сосудистое русло с последующим серийным фотографированием, что позволяет визуализировать препятствия кровотоку, их морфологическую структуру, локализацию и протяженность [2, 113]. К недостаткам ангиографии относится то, что она является малым оперативным вмешательством, чревата возникновением осложнений и, следовательно, сопряжена с риском для больного и не может выполняться многократно [117, 116]. Перспективным методом является спиральная компьютерная ангиография, позволяющая получить пространственное изображение сосудистого русла. Подробное описание данного метода мы не приводим, так как не использовали его в своем исследовании.
Лазерная допплеровская флоуметрия используется для оценки состояния кровотока в микрососудах и позволяет оценить состояние кровотока на капиллярном уровне [91]. Суть метода заключается в том, что монохроматический пучок света малой интенсивности, излучаемый лазерным диодом, проходит по гибкому световоду и через наконечник датчика освещает исследуемую ткань. В ткани свет рассеивается отражающими частичками. Часть света отражается обратно и по приемному световоду попадает на внутренний фотоприемник аппарата. В соответствии с эффектом Доп-плера, только движущиеся частицы (главным образом эритроциты) приводят к частотному сдвигу. Спектр принятого сигнала обрабатывается в аппарате в соответствии с алгоритмом, полученном Боннером для такого типа отражения, и рассчитывается объем потока (мл/мин/100 г ткани).
Моделирование ишемии тканей задней конечности крысы
Прежде чем приступить к описанию модели экспериментальной ишемии, следует отметить, что, несмотря на схожесть в строении артериального русла, у крыс имеются некоторые отличия в сравнении с таковыми у человека. Наружная подвздошная артерия разделяется на срамно -тазовый ствол и бедренную артерию. Бедренная артерия является непосредственным продолжением наружной подвздошной артерии и проходит по медиальной поверхности бедра, переходя дистально в подколенную артерию. Кроме мелких ветвей, от бедренной артерии отходит довольно крупная артерия сафена (a. saphena), которая является аналогом глубокой бедренной артерии человека. Эта артерия кровоснабжает большую приводящую, полуперепончатую, полусухожильную и стройную мышцы и образует коленное сплетение. Около полусухожильной мышцы от артерии сафена отходят две дистальные ветви, участвующие в кровоснабжении голени и стопы. Подколенная артерия, являющаяся продолжением бедренной артерии, дистально разделяется на переднюю и заднюю большеберцовые артерии, снабжающие кровью голень и стопу [26]. Анализ анатомического строения задней конечности крысы показал, что ввиду особенностей ветвления артерий нижних конечностей для создания модели ишемии тканей целесообразно выполнять перевязку бедренной артерии непосредственно перед отхождением от нее a. saphena.
В литературе описаны способы моделирования хронической ишемии, которые включают в себя перевязку бедренной артерии у места отхождения, у места деления, а также перевязку всех ее ветвей на бедре. Нами в дополнение к указанному способу предпринято удаление участка магистрального сосуда конечности для предотвращения образования прямых анастомозов по «vasa vasorum». Данная модификация модели приводит к развитию ишемии более тяжелой степени. Методика моделирования описана в работах S. Takeshita et al. (1998), М Sugano et al. (2004) [181, 183].
Моделирование хронической ишемии задней конечности осуществляли следующим образом. Под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг животных фиксировали на спине, затем после соответствующей подготовки операционного поля (сбривание шерсти и обработка 70% раствором спирта) выполняли разрез кожи по внутренней поверхности бедра на всю длину об- ласти. Выделяли элементы сосудисто-нервного пучка бедра. Артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали (пересекали отходящие от нее ветви первого порядка). Накладывали лигатуры на артерию у места ее начала (под паховой связкой) и пересекали. Перевязывали и пересекали a. saphena,. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (бифуркация подколенной артерии), которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Значимого ретроградного кровотечения из артерий голени не наблюдалось, поэтому лигатуры не накладывались. Рану на бедре ушивали непрерывным швом.
После выведения животных на разных сроках эксперимента удаленные ишемизированные мышцы голени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации из каждой мышцы вырезали по 2 кусочка и после дегидратации в спиртах восходящей крепости заливали в парафин по общепринятой методике [59]. Парафиновые срезы толщиной 7-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для количественной оценки зоны поражения, воспаления и грануляционной ткани проводили планиметрию срезов с помощью сетки Г. Г. Автандилова [4]. Изготовленные препараты смотрели в 20 полях зрения. Морфологические исследования проведены на кафедре общей патологии (заведующий, профессор В. С. Барсуков) медицинского института Орловского государственного университета. Общая характеристика обследованных больных За период с 2008 по 2009 годы в отделении сосудистой хирургии МУЗ ГКБ СМП г. Курска в соответствии с поставленной целью и задачами проведено пилотное исследование и последующее лечение аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, 12 больных с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей при их информированном согласии, на основании приказов Минздрава РФ от 25.11.2002 г. № 363 «Об утверждении «Инструкции по применению компонентов крови» и от 23.09.2002 г. № 295 «Об утверждении «Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафереза». Все пациенты были мужского пола. Хроническая ишемия нижних конечностей ИБ степени обнаружена в 100% случаев. В табл. 3 больные распределены по возрасту.
Динамика симптоматических проявлений, флоуметрических и морфологических изменений в мышцах ишемизированнои конечности на разных сроках у крыс, получавших плазму, обогащенную тромбоцитами
Лечение окклюзионных поражений артерий нижних конечностей является в настоящее время наиболее актуальной задачей медицины. Это связано, прежде всего, с широкой распространенностью данных заболеваний, что в значительной степени определяется «постарением» населения, недостаточной эффективностью лечебных мероприятий [114, 184, 140]. Облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей характеризуется неуклонно прогрессирующим течением, составляя 2-3% от общей численности населения и около 10% - у лиц пожилого возраста. В действительности число таких больных, благодаря субклиническим формам ( когда ЛПИ 0,9 и перемежающаяся хромота проявляется только при большой физической нагрузке 1км), в 3-4 раза больше [32, 46, 86].
По данным J. Dormandy, в США и Западной Европе клинически проявляющаяся перемежающаяся хромота выявлена у 6,3 млн лиц (9,5% всего населения страны старше 55 лет). Эти данные подтверждены Роттердамским исследованием (обследовано около 8 тыс. пациентов старше 55 лет), из которого следует, что клинические проявления артериальной недостаточности нижних конечностей верифицированы у 6,3% пациентов, а субклинические формы обнаружены у 19,1%, т.е. в 3 раза чаще. Результаты Фрамингеймского исследования показали, что до 65 лет атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей в 3 раза чаще заболевают мужчины. Такое же число заболевших женщин встречается лишь в 75-летнем и более старшем возрасте [86, 124, 141, 175, 186].
Клинические исследования, проведенные за последние годы в ведущих сосудистых центрах, не показали какого-либо уменьшения числа больших ампутаций конечностей. Так, в США ежегодно госпитализируется более 400 тысяч пациентов с заболеваниями периферических артерий. Лечение включает 50 тысяч ангиопластик, 110 тысяч шунтирующих операций, но при этом выполняется ежегодно 69 тысяч ампутаций стоп и конечностей [111, 130, 147, 163, 170]. Арсенал реконструктивно-восстановительных операций и использование новых методов лечения хронической ишемии нижних конечностей пополняется с каждым десятилетием. Однако, у 70-80% пациентов имеется диффузное поражение артериального русла ниже пупартовой связки, в связи с этим хирургическое вмешательство, направленное на прямое восстановление магистрального кровотока, возможно лишь у 17-23% больных [41, 79, 98]. Кроме того, существует большая группа больных пожилого и старческого возраста с наличием тяжелых соматических заболеваний и высоким операционно-анестезиологическим риском [55]. В таких случаях целесообразно проводить непрямую реваскуляризацию артериального русла нижних конечностей. Эти операции направлены на стимуляцию коллатерального кровотока: артериализа-ция вен голени и стопы; аутотрансплантация сальника; реваскуляризирующая остеотрепанация по Ф.Н. Зусмановичу; компактотомия по Г.А. Илизарову, поясничная симпатэктомия [2, 3, 6, 33-35, 46, 54, 74, 78, 79]. Оценка эффективности приведенных нереконструктивных вмешательств во многом противоречива и остается дискутабельной.
Одним из перспективных направлений в лечении облитерирующих заболеваний является стимуляция неоангиогенеза в пораженной конечности путем введения ангиогенных факторов роста: сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР), фактора роста фибробластов (ФРФ), тромбоцитоза-висимого фактора роста (ТФР) [115]. Также применяются методы генной инженерии для введения трансформированных генов для стимуляции развития сосудов в области ишемии. Исследования R. S.Smith Jr et al. показали, что ген eNOS человека способствует ангиогенезу у крыс на модели ишемии задней конечности. Аденовирус, содержащий ген eNOS человека, был введен в приводящую мышцу задней конечности крысы сразу же после удаления бедренной артерии. При этом регистрировалось лазерным допплером повышение перфузии крови в течение от 2-х до 4-х недель после генной доставки по сравнению с контрольными животными. Поставка гена eNOS в ишемизированную заднюю конечность крысы, приводило к увеличению внутриклеточного уровня циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и капиллярной плотности, идентифицированной антителами к CD31 с помощью иммунного окрашивания [149]. В то же время рядом исследователей было доказано, что VEGF165 стимулирует экспрессию eNOS [69, 192]. Эксперименты проводились на культуре эндотелиальных клеток (ЭК) пупочной вены человека и изолированных кольцах аорты крыс. Экспрессия eNOS оценивалась с использованием Western blotting и RT-PCR-анализов. Результаты показали, что VEGF значительно повышает eNOS mRNA и уровень самого белка, как в культуре ЭК пупочной вены человека, так и изолированных кольцах аорты крыс, что очень важно для процесса ангиогенеза, вызываемого VEGF. Стимулирующий эффект VEGF 165 на экспрессию eNOS был связан по их мнению с повышением базальной продукции цГМФ в ЭК пупочной вены человека и сдвигом влево кривой концентрация-релаксация к ацетилхолину в аортальных кольцах крыс. Рецепторы к стимуляторам ангиогенеза располагаются на цитоплазматической мембране эндотелиальных клеток микрососудов. При взаимодействии рецепторов с факторами роста происходит стимуляция пролиферативной активности эндотелиоцитов, инициируется каскад процессов, связанных с образованием новых кровеносных сосудов.
Современная ангиохирургия предлагает обширный выбор методов лечения заболеваний, патогенез которых связан с развитием ишемии тканей. Однако, несмотря на специфические преимущества и теоретически неограниченные возможности каждого из этих методов, диапазон их практического применения имеет достаточно жесткие рамки. Это связано с тем, что новые методы создания клеточных препаратов, основанные на генной инженерии, часто включают длительное культивирование, селекцию, активацию и генетическую модификацию клеток. Изготовление подобных препаратов требует особых технологических условий. Следует подчеркнуть, что в России пока не существует единых требований к организации их производства. Все вышеизложенное является мощным стимулом к поиску принципиально новых подходов в лечении заболеваний, связанных с нарушением кровообращения, более приемлемых для практической медицины и по эффекту не уступающих методам генной инженерии.
Результаты исследования периферического кровообращения и микроциркуляции у больных с хронической ишемией нижних конечностей
В группе крыс, получавших комбинированное лечение (плазма, обогащенная тромбоцитами, + «Миелопид») нами получены отрицательные результаты их совместного применения. Уровень микроциркуляции достоверно ниже показателей контрольной группы на всех сроках эксперимента, что, видимо, связано с их фармакодинамическим антагонистичным взаимодействием. Гистологическое исследование мышц показало, что на 10 сутки площадь некроза по сравнению с контролем была больше и составила 35-42%, в артериальных и венозных сосудах обнаруживались обтурирующие и пристеночные тромбы, в нервных стволах отмечались тяжелые дегенеративные изменения в виде набухания нервных волокон с исчезновением аксональных цилиндров, только лишь к 28 суткам у некоторых крыс по периферии некроти-зированных участков обнаруживались немногочисленные регенерирующие ми-областы среди грануляционной ткани, в то время как в контрольной серии они к этому сроку уже густо покрывали площадь среза.
Полученные результаты эксперимента позволили нам провести пилотное клиническое исследование 12 пациентов с ХОЗАНК при их информированном согласии, находившихся на лечении в отделении сосудистой хирургии МУЗ ГКБ СМП в 2008 - 2009 годах. Все больные были мужского пола в возрасте от 48 до 72 лет. Хроническая ишемия нижних конечностей ИБ степени на фоне облитерирующего атеросклероза обнаружена в 100% случаев. Продолжительность заболевания колебалась от нескольких месяцев до 10 лет и составила в среднем 6,5+0,5 года.
У 100% пациентов выявлена различная соматическая патология. При этом у одного и того же больного, как правило, встречалось сочетание нескольких заболеваний. Гипертонической болезнью страдали - 7 (58,3%), ишемической болезнью сердца 6 (50%), из которых 4 (33,3%) перенесли инфаркт миокарда, хроническими неспецифическими заболеваниями легких -3 (25%), ишемической болезнью мозга - 2 (16,7%), язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки - 5 (41,7%), мочекаменной болезнью - 2 (16,7%) больных.
Критериями включения пациентов в группу больных, подвергшихся лечению аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, были: 1) хроническая ишемия нижних конечностей ИБ степени; 2) наличие магистрального кровотока по глубокой артерии бедра и коллатерального кровотока по подколенной или берцовой артериям; 3) невозможность выполнения реконструктивной операции из-за наличия тяжелой сочетанной сопутствующей патологии; 4) диффузное поражение дистального сосудистого русла и плохое состояние путей оттока. Критериями исключения явились: 1) распространенные ишемические расстройства на бедре и голени; 2) наличие сахарного диабета с синдромом диабетической стопы; 3) ампутация конечности на уровне бедра или верхней трети голени.
Всем больным проводилось стандартное исследование гемодинамики и микроциркуляции: реовазография, фотоплетизмография, ультразвуковая доп-плерография и дуплексное ангиосканирование. О состоянии макрогемодинамики судили по реографическому (РИ) и лодыжечно-плечевому (ЛПИ) индексам, а микроциркуляции -по фотоплетизмографическому индексу (ФИ). Пациентам на всем протяжении стационарного лечения проводился комплекс консервативной терапии, направленный на улучшение реологических свойств крови. Наряду с этим, больным в одну из нижних конечностей, более ишемизированную (исследуемую) под ультразвуковым контролем вводилась аутоплазма, обогащенная тромбоцитами (аутоБоТП) по ходу глубокой бедренной и подколенной артерий. Вторая нижняя конечность, менее ишемизирован-ная, в которую аутоплазма не вводилась, стала контрольной.
Сущность предложенной нами технологии лечения аутоБоТП следующая. У пациента из локтевой вены забираем 500,0 крови в специальные контейнеры «Гемокон», предназначенные для забора донорской крови. Затем полученную кровь центрифугируем при скорости 2,5 тысячи оборотов в минуту в течение 15 минут. В результате этого после плазмоэкстракции получаем аутоБоТП, содержащую большое количество полипептидных факторов роста, которую набираем в одноразовые шприцы по 50 мл. В асептических условиях под ультразвуковым контролем вводим по 100 мл изготовленной аутоплазмы из двух точек пораженной конечности: в паховой и подколенной областях, соответственно расположению глубокой бедренной и подколенной артерий, по ходу которых и создаем аутоплазмоинфильтраты.
Все больные перенесли малоинвазивное хирургическое вмешательство по предложенной технологии без осложнений. На следующий день пациенты отмечали лишь умеренную болезненность в местах инъекций, гиперемии кожи, повышения локальной температуры не наблюдалось.
При сопоставлении полученных результатов нами отмечено, что объемный кровоток (по данным РИ) в исследуемых конечностях увеличился на 0,12±0,01 и соответствовал по классификации нарушений кровообращения в нижних конечностях в зависимости от величины РИ стадии компенсации (0,41-0,6); магистральный кровоток (по данным ЛПИ)- на 0,15±0,01, уровень микроциркуляции (по данным ФИ)- на 7,2±2,2%. В контрольных конечностях эти же инструментальные показатели статистически достоверно не отличались по сравнению с периодом до терапии.
Следовательно, предложенное нами лечение аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами, достаточно эффективно и является перспективным, так как улучшает гемодинамику и микроциркуляцию.
Степень изменения клинического статуса по отношению к периоду до клеточной терапии оценивалась по шкале Rutherford et. al. В 83,3% случаев был достигнут результат с «умеренным» улучшением ив 16,7 %- с «минимальным» улучшением. В ближайшем послеоперационном периоде все больные отметили уменьшение боли и потепление кожных покровов стопы. Повышение температуры кожных покровов стопы сохранялось в течение всего периода наблюдения у всех больных. Дистанция безболевой ходьбы увеличилась в среднем со 100 до 500 метров у 58,3% пациентов только через 4-6 месяцев после лечения.
«Качество жизни» было оценено с помощью опросника MOS SF-36, нормированного для сосудистых больных [1]. Оценка результатов лечения проводилась на основании анкетного обследования пациентов до и через 6 месяцев после клеточной терапии.
