Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Морфофункциональное состояние иммунной системы организма, причины и механизмы вторичной иммунной недостаточности 10
1.1. 1. Характеристика и этиология приобретенных иммунодефицитов ... 11
1.1.2. Иммунодепрессивные эффекты, вызываемые лекарственными препаратами 16
1.2. Коррекция иммунодефицитных состояний с использованием лекарственных средств 27
1.3. Эффективность коррекции вторичных иммунодефицитов средствами растительного происхождения 33
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Препараты 43
2.3. Методы оценки функционального состояния иммунной системы организма 45
2.4. Гистоморфологические методы анализа 52
2.5. Статистическая обработка результатов 53
Глава 3. Оценка функционального состояния системы иммунитета в условиях экспериментального иммунодефицита и коррекции растительным средством 54
Глава 4. Изменения микроанатомии тимуса в условиях вторичного иммунодефицита и коррекции растительным средством 67
Глава 5. Оценка структурного состояния лимфоиднои ткани двенадцатиперстной кишки в условиях азатиоприновой иммуносупрессии и коррекции растительным средством 84
Глава 6. Определение иммуномодулирующеи эффективности растительного средства при комплексной терапии больных с гнойно- воспалительными заболеваниями кожи 96
Глава 7. Обсуждение результатов 102
Заключение 118
Выводы 120
Практические рекомендации 121
Список литературы 122
- Характеристика и этиология приобретенных иммунодефицитов
- Эффективность коррекции вторичных иммунодефицитов средствами растительного происхождения
- Методы оценки функционального состояния иммунной системы организма
- Оценка функционального состояния системы иммунитета в условиях экспериментального иммунодефицита и коррекции растительным средством
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема возникновения, развития и коррекции состояний, сопровождающихся нарушением функционирования иммунной системы организма, является одной из важнейших проблем современности. Интенсивные исследования в области теоретической и клинической иммунологии способствовали выявлению широкого круга заболеваний, обусловленных дисфункцией различных звеньев иммунитета и требующих иммунокорригирующей терапии.
Термином «иммунодефициты» или «иммунодефицитные состояния» (ИДС) обозначают нарушения нормального иммунного статуса, которые обусловлены дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа (Ройт А. и др., 2000; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000; Чиркин В.В. и др., 1999). Принято различать врожденные (первичные) и приобретенные (вторичные) иммунодефициты. Под первичными иммунодефицитами следует понимать врожденную неспособность организма осуществлять ту или иную защитную функцию в общем иммунном процессе. В отличие от первичных иммунодефицитов вторичная иммунная недостаточность не связана с генетическим блоком какого-либо звена иммунитета, а развивается под воздействием самых разнообразных повреждающих факторов. Среди факторов, ведущих к развитию ВИД, обоснованную тревогу вызывают факторы химической природы, к которым можно отнести применение медикаментозных средств, а также средств защиты растений - пестицидов (Ройт А. и др., 2000; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1999; Чиркин В.В. и др., 1999).
Литературные данные свидетельствуют о том, что в клинической практике часто наблюдаются иммунодефициты, связанные с длительным приемом кортикостероидов, эстрогенов, цитостатиков, некоторых антибактериальных препаратов и др. (Ройт А. и др., 2000; Чиркин В.В. и др., 1999; Bach J.F., 1985; Miller К., 1985; Gatell J.M., Torres А., 1987).
Как показали многочисленные научные исследования, проведенные в нашей стране и за рубежом, восстановление функциональной активности иммунной системы является непременным условием успеха комплексной терапии самых различных патологических состояний (Гусев Е.И. и др., 1984; Иванова Л.А., Павлова М.Н., 1986; Караулов А.В., 1988, 1999; Короткий Н.Т. и др., 1985; Лапин Б.А. и др., 1985; Майчук Ю.Ф. и др., 1985; Скрипкин Ю.К. и др., 1986; Jwata Т. et al., 1981). В обзорах Хаитова P.M. и Пинегина Б.В. (1996, 2000) отмечено, что наибольшую эффективность иммунотерапии можно ожидать именно при вторичных или приобретенных иммунодефицитах. С целью коррекции иммунодефицитных состояний создан довольно большой набор лекарственных средств как синтетического, так и природного происхождения, действующих на основные компоненты иммунной системы. При этом следует отметить, что особенно перспективным является использование средств природного происхождения.
Иммуноактивные продукты высших растений изучены в наименьшей степени. Иммуномодуляторы растительного происхождения в отличие от синтетических имеют ряд преимуществ: мягкое иммуномодулирующее действие, низкая токсичность, активация функций не только иммунной, но и нервной и эндокринной систем благодаря наличию комплекса биологически активных веществ, оказывающих воздействие на организм в целом (Никитина Т.И. и др., 1998).
Имеющиеся в литературе сведения о влиянии лекарственных растений на иммунную систему носят скрининговый характер или являются фрагментарными. Практически не изучено протекторное действие иммуномодуляторов растительного происхождения в условиях иммуносупрессии, не ясными остаются многие аспекты механизма иммуномодулироующего действия большинства растительных препаратов.
Изложенное выше обосновывает необходимость продолжения поиска средств, обладающих иммунопротекторным действием, безвредных для организма и эффективных в условиях вторичных иммунодефицитных состояний. Данным требованиям соответствуют многие средства из лекарственных растений, полученные из отечественного растительного сырья.
В Отделе биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН и Центре восточной медицины Министерства Здравоохранения РБ разработана биологически активная добавка к пище, представляющая собой комплексное (семикомпонентное) растительное средство, и зарегистрированная в Российской Федерации как «Фиточай «Байкальский-11» (регистрационное удостоверение № 005465.Р.643.06. 2003). Данный фиточай рекомендован в качестве добавки, улучшающей липидный обмен и дополнительного источника флавоноидов.
Цель исследования. Целью исследований явилась оценка иммуномодулирующей эффективности комплексного растительного средства «Байкальский-11» в эксперименте и при гнойно-воспалительных заболеваниях кожи человека.
Задачи исследования:
1. Изучить иммуномодулирующую эффективность комплексного растительного средства в условиях экспериментального азатиопринового иммунодефицита.
2. Установить изменения микроанатомии тимуса в условиях вторичного иммунодефицита и коррекции растительным средством.
3. Оценить структурное состояние лимфоидной ткани двенадцатиперстной кишки в условиях иммуносупрессии и коррекции комплексным растительным средством.
4. Определить иммуномодулирующую эффективность растительного средства при комплексной терапии больных с гнойно-воспалительными заболеваниями кожи.
Научная новизна. Проведена комплексная оценка иммуномодулирующей активности нового растительного средства. Получены новые данные о влиянии исследуемого средства на различные звенья иммунной системы при воздействии классического иммунодепрессанта азатиоприна.
Показано, что тимус, как один из центральных органов иммуногенеза, является чувствительной мишенью, и его структурно-функциональное состояние адекватно отражает как наличие иммунологической недостаточности, вызванной азатиоприном, так и эффективность коррекции комплексным растительным средством.
Установлено, что структурное состояние лимфоидной ткани в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки является чувствительным показателем, отражающим наличие иммуносупрессии и эффективность перорального способа коррекции растительным средством в условиях вторичного иммунодефицита.
Показана иммуностимулирующая эффективность растительного средства при комплексной терапии больных с гнойно-воспалительными заболеваниями кожи.
По эффективности иммуномодулирующего действия новое комплексное растительное средство сопоставимо с таковым препарата сравнения - экстракта элеутерококка колючего.
Практическая значимость. Полученные результаты исследований аргументируют целесообразность расширения области применения комплексного растительного средства - не только как биологически активной добавки, улучшающей липидный обмен и являющейся дополнительным источником флавоноидов, но и средства для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией системы иммунитета.
Материалы используются в учебном процессе на профильных кафедрах медицинского факультета БГУ.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции преподавателей ВСГТУ (Улан-Удэ, 2002); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); V научно практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006); 15th anniversary of School of Technology in Darkhan-Uul aimag. «Scientific transactions of an international conference on topic «Healthy food» (Darkhan, 2006); научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения д.м.н. Базарона Э.Г. (Улан-Удэ, 2006), заочной общероссийской электронной научной конференции «Диагностика и лечение наиболее распространенных заболеваний человека» (2006). Основные положения, выносимые на защиту:
1. Комплексное растительное средство обладает иммуномоду- лирующим эффектом, восстанавливая показатели иммунной системы организма на фоне вторичного иммунодефицита, вызванного цитостатиком азатиоприном.
2. Изучаемое растительное средство восстанавливает микроанатомию тимуса и структурное состояние лимфоидной ткани двенадцатиперстной кишки в условиях иммуносупрессии.
3. Фиточай «Байкальский-11» оказывает иммуномодулирующее действие при включении в комплексную терапию больных с гнойно- воспалительными заболеваниями кожи.
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных результатов, их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 4 рисунками, 17 таблицами и 19 микрофотографиями. Список литературы включает 229 источников отечественной и иностранной литературы.
Характеристика и этиология приобретенных иммунодефицитов
В настоящее время большое внимание уделяется изучению иммунодефицитных состояний, при наличии которых организм оказывается не в состоянии адекватно реагировать на чужеродные антигены и реализовывать то или иное звено иммунного ответа. Термином «иммунодефициты» обозначают нарушения нормального иммунного статуса организма, которые обусловлены дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа (Чиркин В.В. и др. 1999; Сапин М.Р., Никитюк Д.Б., 2000; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000).
Понятием иммунный статус в настоящее время принято называть совокупность лабораторных показателей, характеризующих количественную и функциональную активность клеток иммунной системы. При этом под нормальным состоянием иммунного статуса подразумеваются показатели иммунной системы, определяемые у практически здоровых лиц (или особей) различных возрастных групп. Определение параметров иммунной системы при различных патологических состояниях дает возможность разделить последние на 3 главные группы: 1) без существенных изменений в иммунном статусе; 2) с недостаточностью иммунной системы (иммунодефициты); 3) с гиперактивацией иммунокомпетентных клеток (аутоиммунитет, аллергия) (Петров Р.В. и др., 1994; Столяров И.Д., 1999; Федосеева В.Н. и др., 1993). Традиционным считается, что снижение показателей иммунного статуса указывает на наличие иммунодефицитного состояния. Поскольку иммунные реакции условно делятся на клеточные (Т- клеточное звено) и гуморальные (В- клеточное звено), то определение отклонений только в Т- клеточном звене позволяет говорить об иммунодефицитах клеточного иммунитета, а только в В - клеточном звене — об иммунодефицитах гуморального иммунитета. Если же наблюдается снижение показателей в обоих звеньях иммунной системы, то выводом из такого обследования является наличие комбинированного иммунодефицита. Окончательное заключение о состоянии иммунной системы может быть сделано на основании результатов комплексного анализа показателей разных звеньев иммунитета: эффекторного, регуляторного, макрофагального, системы медиаторов (цитокинов). Особое внимание при интерпретации иммунологических показателей необходимо уделять на гиперактивационное состояние иммунной системы, поскольку оно не всегда связано с аутоиммунными процессами.
Первичные иммунодефициты называют врожденными, поскольку они проявляются вскоре после рождения, имеют четко выраженный наследственный характер (Шальнев Б.И., 1989). Врожденные иммунодефицитные синдромы и заболевания представляют собой довольно редкое явление. Первичные иммунодефициты возникают в результате нарушений в развитии и созревании клеток иммунной системы. Причинами этого могут явиться удвоение хромосом, точечные мутации, дефект ферментов обмена нуклеиновых кислот, генетически обусловленные нарушения мембран, повреждение генома в эмбриональном периоде и др.
Вторичные иммунодефициты (ВИД) встречаются довольно часто в клинической практике. В отличие от первичных иммунодефицитов вторичная иммунная недостаточность не связана с генетическим блоком какого-либо звена иммунитета, а развивается под воздействием самых разнообразных повреждающих факторов. ВИД проявляются при воздействии различных иммунодепрессантов (химических, физических и биологических). Наряду с радиоактивным излучением, гербицидами, нитратами и нитритами иммунодефицит вызывается нерациональным применением антибиотиков, кокцидиостатиков. Заслуживают внимания биологические иммуно 13 депрессанты. Иммунодефицит может возникать в качестве сопутствующего явления при таких патологиях, как заболевания желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, нефротические нарушения, злокачественные образования и другие (Апатенко В.М., 1995; Ашмарин И.П., 1988; Гайдамака А.В., Апатенко В.А., 1990; Корнева Г.В., 1990; Королев A.M., Тыщенко И.П., 1991; Коромыслов Г.Ф., Игнатов П.Е., 1983; Немченко М.И., 1989; Петров A.M., Серых М.М., 1998; Чернушко Е.Ф. и др., 1981). Известно немало случаев появления вторичных иммунодефицитов из-за неполноценного белкового, витаминного и минерального питания (Петров A.M., Серых М.М., 1998; Плященко СИ., 1991). С возрастанием загрязнения окружающей среды данная проблема становится еще более актуальной.
Таким образом, любые нарушения функции иммунной системы приводят к иммунодефицитам, которые могут проявляться по-разному, но всегда связаны со снижением устойчивости организма к инфекционным агентам или опухолям, а в ряде случаев - с развитием аутоиммунных расстройств (Richard Y., 1987).
К настоящему времени патогенез вторичных иммунодефицитов у человека и животных изучен в недостаточной степени. Возможно, это частично связано с трудностями выявления ранних этапов их развития. Уже сегодня изучение при разных клинических состояниях Т-хелперов 1-, 2- и 3-го типов, их цитокинов, подклассов иммуноглобулинов, механизмов естественной гибели клеток - апоптоза - дает важную диагностическую информацию. Несомненный интерес для понимания патогенеза ВИД представляют исследования компенсаторных и адаптационных реакций на принципах системы «мобилей» (Р.В.Петров), но не только внутри иммунной системы, а с учетом всех ее непосредственных межсистемных связей и отношений. Для понимания механизмов развития иммунодефицитных состояний определяющее значение имеет изучение клеточных основ и генетического контроля разных иммунологических функций. Данные по взаимодействию иммунокомпетентных клеток, фагоцитов и комплемента являются ключом к пониманию различающейся клинической картины при разнообразных ИДС (Чиркин В.В. и др., 1999; Шальнев Б.И., 1989). Кроме того, изменения иммунного статуса должны рассматриваться и анализироваться в единой взаимосвязанной реакции нервной, эндокринной систем, метаболического статуса, а не как изолированный дисбаланс только одной иммунной системы (Чиркин В.В. и др., 1999). Вторичные иммунодефициты можно разделить на следующие группы: 1) физиологические (новорожденности; пубертатного периода; беременности и лактации; старения; биоритмические); 2) экологические (сезонные; токсические; радиационные и др.); 3) патологические (инфекционно паразитарные; вакцинальные; дисбактериозные; неинфекционные (хроническая патология); дистрессовые; онкологические; метаболические дефекты при трофической недостаточности, ожирении, диабете, атеросклерозе; медикаментозные (гормоны, цитостатики и др.) (Г.И. Кирпичникова и др., 1999; Столяров И.Д., 1999).
Классификация ВОЗ основывается на природе воздействия, приводящего к изменениям иммунореактивности, или по нозологическому признаку: 1) ВИН при инфекционных заболеваниях, вызванных вирусами, цитомегаловирусами, бактериями, грибами, лейшманиями, гельминтами и т.д.; 2) ВИН при лечении различными препаратами и процедурами; 3) ВИН при хирургических вмешательствах, травмах, ожогах; 4) ВИН при стрессе; 5) ВИН при опухолевом росте (есть всегда, хотя само заболевание развивается на фоне нарушений иммунореактивности); 6) ВИН при удалении или поражении органов иммунной системы; 7) нарушения обмена, питания, недостаток витаминов, эндокринные заболевания, приводящие к дисбалансу обменных процессов (белкового, минерального обменов, микроэлементного состава и сахара); 8) возрастные изменения иммунной защиты (Шабашова Н.В., 1998).
Чиркин В.В. и соавт. (1999), рассматривая этиологию и патогенез вторичных иммунодефицитов, особую роль отводят экзогенным воздействиям, куда относят: 1) неблагоприятные экологические факторы (загрязнение воздуха, вредные вещества в питьевой воде, отрицательные климатические влияния); 2) производственные вредности; 3) пищевые факторы (токсигены и мутагены в пище, недостаточное и избыточное питание, гиповитаминозы, дефициты микроэлементов); 4) вредные бытовые воздействия (канцерогены табачного дыма, действие алкоголя, самолечение, ятрогения); 5) стрессы; 6) патофизиологические эндогенные влияния (возрастные изменения, гормональные изменения, ферментопатии пищеварительного тракта); 7) хронические заболевания (патология дыхательной системы, сердечно-сосудистые заболевания, болезни мочеполовых органов, аллергические и аутоиммунные заболевания, хирургическая патология).
Эффективность коррекции вторичных иммунодефицитов средствами растительного происхождения
Загрязнение окружающей среды, избыточное потребление синтетических лекарств, а также недостаток в питании растительных компонентов, содержащих природные антиоксиданты, антиаллергены, антиканцерогены, способствуют росту аллергических, онкологических и других заболеваний, в основе которых лежит иммунодефицит. Эти обстоятельства определяют активный поиск профилактических и лечебных средств природного происхождения среди лекарственных и пищевых растений.
Основными преимуществами лекарственного действия препаратов растительного происхождения являются многосторонность и , мягкость воздействия на организм и вследствие этого хорошая переносимость, отсутствие, как правило, побочного действия и осложнений даже при длительном их применении (В.С.Смирнов, И.С.Фрейдлин, 2000). Несмотря на это, широкое применение средств и методов фитотерапии является пока еще мало используемым методом коррекции иммунологических нарушений организма. Нужно отметить, что отличительной особенностью лекарственных средств растительного происхождения является их поливалентность, что обусловлено сложностью химического состава растительной клетки. Это обстоятельство позволяет объяснить широкое разнообразие фармакологических эффектов, наблюдающихся у большинства растительных средств. Разумеется, каждый вид растений имеет свой набор биологически активных веществ, однако большая часть из них принадлежит к ограниченному числу семейств химических соединений. Это: алкалоиды, гликозиды, флавоноиды, антрагликозиды, тиогликозиды, эфирные масла, жиры, высокомолекулярные полифенолы (танины),. витамины, микроэлементы и др. (Дуплищева А.П. и др., 1987; Николаевский ВВ. и др., 1987; Ремова Т.Н. и др., 1987; Конопля А.И. и др., 1988, 1991; Wagner Н. et al., 1985; Czarnetzki В.М.,1990; Burger R.A. et al., 1993; Wang N.L. et al., 1994).
Из обширного перечня лекарственных растений, применяемых для лечения вторичных иммунодефицитных состояний, наиболее известными являются представители уникального семейства аралиевых, которое насчитывает около 800 видов. В настоящее время широко изученными стимуляторами естественного происхождения являются рекомендованные официнальной медициной адаптогены: женьшень обыкновенный (Бардымов И.В. и др., 1976; Стрелкова М.А. и др., 1996), элеутерококк колючий (Брехман И.И., 1968; Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е., 1991; Смирнов B.C. и др., 1992) , заманиха (Шабашова Н.В., 1998), аралия маньчжурская (Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000), а также родиола розовая (золотой корень) (Кичигина Е.Л. и др., 1990; Бочарова О.А. и др., 1997; Саратиков А.С., 1974) и др. Мобилизируя адаптогенные реакции, препараты, получаемые из данных растений, повышают резистентность к разнообразным воздействиям химической и физической природы, а также к некоторым микроорганизмам. Установлено их антистрессорное действие. В эксперименте адаптогены препятствуют развитию лучевой болезни и снижают токсичность цитостатических препаратов. Кроме того, все адаптогены малотоксичны и поэтому могут применяться длительное время (Столяров И. Д., 1999).
Как показали исследования Takeda A. et al. (1981), внутрибрюшинное или внутривенное введение облученным в сублетальной дозе мышам термостабильной фракции корня женьшеня способствовало более быстрому восстановлению клеточности костного мозга, нормализации массы селезенки, а также увеличению выживаемости облученных животных. Действие препарата обусловлено содержанием сапониновых гликозидов -панаксазидов, витаминов, эфирных и жирных масел, стероидов, пектинов, дубящих веществ. Полисахариды и белковые вещества, выделенные из клеток женьшеня, стимулировали формирование АОК в селезенке мышей, выработку антител, усиливали киллерную активность спленоцитов (Стрелкова М.А. и др., 1996).
Применение элеутерококка на фоне сниженной реактивности повышает сопротивляемость организма к ряду факторов физической, химической и биологической природы. Показана способность препарата нормализовать показатели клеточного, гуморального иммунитета и системы неспецифической защиты, а также стимулировать продукцию эндогенного интерферона (Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000). Было установлено, что действующими веществами элеутерококка являются лигнановые гликозиды элеутерозиды А, В, С, Д, Е, пектиновые вещества, эфирные масла, флавоноиды, производные кумарина, смолы, камеди, фенолкарбоновые кислоты (Пастушенков Л.В., Лесиовсая Е.Е., 1991).
Препарат элтон, содержащий экстракт элеутерококка, цветочную пыльцу, витамины Е и С, также обладает стимулирующими свойствами. Как показали исследования А.И. Цыганковой и соавт. (1997), пероральное введение препарата крысам в дозе 1,5 мг/кг массы тела оказывало нормализующее действие на содержание эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов и лейкоцитарную формулу крови. Указанные эффекты отмечены как у контрольных животных, так и на фоне свинцовой и бензольной интоксикации.
Препараты заманихи и аралии маньчжурской обладают аналогичными адаптогенными и иммуномодулирующими свойствами, как элеутерококк и женьшень, хотя имеются определенные различия, как в химическом составе, так и по выраженности того или иного действия (Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000).
Методы оценки функционального состояния иммунной системы организма
Определение относительной массы и клеточности центральных и периферических органов иммунной системы, гематологические исследования проводили по общепринятой методике (Методические рекомендации, 1992). Мышей умерщвляли с помощью дислокации шейных позвонков, извлекали тимус, селезенку, лимфатические узлы, взвешивали на торсионных весах и рассчитывали отношение их массы к массе тела мыши в %. Для определения клеточности лимфоидные органы гомогенизировали в среде 199. Суспензию клеток отделяли от элементов стромы фильтрованием через капроновый фильтр и 3 раза отмывали от частиц жировой ткани центрифугированием при 200 g в течение 5 минут. При подсчете кариоцитов каплю клеточной суспензии для освобождения от сопутствующих эритроцитов помещали в 3%-ый раствор уксусной кислоты с генцианвиолетом (0,01%) и вносили в камеру Горяева. Функциональную активность В-системы иммунитета оценивали: - по числу антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза в полужидкой среде по A.J.Cunningham (1965); - по титру гемагглютининов (Э.Зигль, 1979).
Определение антителообразующих клеток (АОК). Метод определения количества АОК основан на способности антиэритроцитаных антител, секретируемых АОК иммунизированных животных, лизировать в присутствии комплемента ЭБ. Если в монослое эритроцитов содержатся клетки-антителопродуценты, в месте их расположения формируются прозрачные зоны локального гемолиза — бляшки. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно в дозе 2 х 108 клеток на мышь. Реакцию ставили на 5-е сутки после иммунизации. Готовили смесь равных объемов суспензии лимфоидных клеток (1 селезенка гомогенизирована в 5 мл среды), ЭБ (10%) и комплемента (1:5) непосредственно перед постановкой реакции. Полученную смесь разливали в стеклянные камеры, представляющие собой два предметных стекла, соединенных между собой по краям парафином, учитывая объем входящей суспензии. Камеры инкубировали в течение 1 часа при 37С и подсчитывали с помощью лупы зоны гемолиза по всей камере. Реакцию характеризовали количеством АОК на 1 селезенку и на 106 клеток с ядрами. Формула для определения абсолютного числа АОК на селезенку: Число АОК на селезенку = nxAxBxC , где V п - число зон земолиза, А - доля лимфоидных клеток в смеси лимфоциты: ЭБ: комплемент, В - объем суспензии, С - степень разведения лимфоцитов, V - объем камеры. Формула для опредедения числа АОК на 10б спленоцитов: Число АОК на = абсолютное число АОК на селезенку 10б спленоцитов количество клеток на селезенку Реакция гемагглютинации. Результаты реакции выражали титром антител — величиной, обратной последнему разведению сыворотки, которая еще агглютинирует эритроциты. Активность Т-системы иммунитета оценивали: - по выраженности локальной реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) по В.Тессенову (1979); - по реакции гиперчувствительности замедленного типа - ГЗТ (Методические рекомендации, 1992); - по активности Т- специфических супрессоров по R.Z.Whisler, J.D.Stobo (1978). Реакция «трансплантат против хозяина». Данный иммунологический феномен использовали для оценки реактивности лимфоидных клеток реципиента по отношению к трансплантационным антигенам клеток донора. Толерантность реципиента к введенным клеткам, иммунологическая компетентность трансплантируемых клеток и антигенные различия клеток донора и реципиента являются обязательным условием для индукции РТПХ. Указанное состояние возникает при введении гибридам F] лимфоидных клеток одной из родительских линий.
У взрослых гибридов F](CBAxC57Bl/6) индуцировали локальную форму РТПХ путем переноса под кожу стопы задней лапки клеток лимфатических узлов мышей линии СВА. В качестве контроля мышам-реципиентам инокулировали сингенные лимфоциты под кожу контрлатеральной лапки. Количество вводимых сингеных и полуаллогенных клеток лимфоузлов составило 1x106 в 0,02 мл среды 199. Через 7 суток после переноса клеточных суспензий реципиентов умерщвляли методом цервикальной дислокации и извлекали подколенные лимфатические узлы. Критерием выраженности реакции служило увеличение клеточного содержания регионального лимфоузла. Интенсивность реакции выражали величиной индекса реакции (ИР), рассчитанного как частное от деления числа клеток регионального лимфоузла (выделенного из конечности, в которую вводили взвесь лимфоцитов) на число клеток контрлатерального лимфоузла. При индексе выше 1,2 отличие от контроля считалось достоверным.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Сенсибилизацию мышей корпускулярным тимусзависимым антигеном с последующим введением разрешающей дозы эритроцитов барана (ЭБ) для воспроизведения реакции ГЗТ проводили согласно стандартной методике локальной ГЗТ. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным велением 0,1%-ной взвеси ЭБ в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена 50 мкл 50%-ой взвеси ЭБ.
Популяцию клеток, богатую макрофагами, получали из перитонеальной полости мышей, которым за 3-е суток до опыта вводили внутрибрюшинно 3-5 мл 1-2%-го стерильного раствора крахмала. Брюшную полость мышей, забитых путем дислокации шейных позвонков, промывали 5 мл охлажденной среды 199, содержащей 5% инактивированной сыворотки КРС и 5 ед/мл гепарина. Смыв отсасывали из брюшной полости пастеровской пипеткой и фильтровали через капроновый фильтр в сосуд при температуре 4С.
Оценка функционального состояния системы иммунитета в условиях экспериментального иммунодефицита и коррекции растительным средством
Фитотерапия заболеваний, в основе которых лежит иммунодефицит, получила в последние годы широкое распространение в медицине и ветеринарии, так как препараты растительного происхождения обладают достаточно выраженным иммуномодулирующим действием, малой токсичностью и наличием комплекса биологически активных веществ, действующих на весь организм в целом (Минаева В.Т., 1991; Телятьєв В.В., 1991; Червяков Д.К., Рабинович М.И., 1981; Убашеев И.О., 1998).
Как известно, лечебное действие препаратов из лекарственных растений обусловлено наличием в них биологически активных веществ. В настоящее время известны основные классы или группы биологически активных веществ как алкалоиды, гликозиды, флавоноиды, эфирные масла, кумарины, сапонины, сесквитерпеновые лактоны, производные антрацена, дубильные вещества, макро- и микроэлементы, лечебные препараты из которых успешно применяются в клинической практике (Пименов М.Т., 1971; Запрометов М.Н., 1974; Барабой В.А., 1976; Токин Б.П., 1989; Тарнуев Ю.О. и др., 2000). Использование биологически активных веществ растений в их природной композиции обеспечивает широкий спектр фармакотерапевтического влияния, способствует нормализации обменных процессов, повышению и оптимизации адаптивных возможностей организма. Лекарственные растения Бурятии также являются перспективными источниками иммуномодуляторов. В работах Седуновой Е.Г. (2000),
Хобраковой В.Б. (1999) и Найдановой Э.Г. (1999) приведены данные по влиянию сухих экстрактов из черных (перезимовавших) листьев бадана толстолистного (ЭБТ), побегов курильского чая кустарникового (ЭКЧ) и растительного экстракта, состоящего из семи компонентов (РЭ), на некоторые показатели иммунной системы лабораторных животных в эксперименте; установлен дозозависимый эффект их иммуномодулирующего действия. Сухие экстракты получены путем экстракции 50%-ным и 60%-ным этанолом в Отделе биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН. Растительный экстракт, представленный семью компонентами, составлен по прописям тибетской медицины и обладает гиполипидемическим действием.
Функциональное состояние иммунной системы в условиях азатиоприновой супрессии и коррекции комплексным растительным средством оценивали в следующих тестах в системе in vivo: образование антителообразующих клеток в селезенке мышей при иммунизации эритроцитами барана, ГЗТ, РТПХ, активность антигенспецифических Т-супрессоров антителообразования, антигенпрезентирующая активность перитонеальных макрофагов. Функциональную активность перитонеальных макрофагов мышей в системе in vitro оценивали в тестах: Fc-розеткообразование, включение акридинового оранжевого в лизосомы, активность процесса фагоцитоза и реакции бласттрансформации лимфоцитов.
Экспериментальные данные, характеризующие функциональное состояние системы иммунитета в условиях азатиоприновой супрессии и коррекции комплексным растительным средством представлены в таблицах 3-12. В результате исследований было установлено, что под воздействием азатиоприна на 14,6% в среднем уменьшалась масса тела животных. Так, в контрольной (интактной) группе животных она составляла 18,5±0,5 г, а в опытной (при воздействии цитостатика) - 15,8±0,5 г (р 0,05). Введение азатиоприна вызывало уменьшение массы тимуса и селезенки на 33% и 22% соответственно по сравнению с интактными животными; наблюдалось уменьшение клеточности тимуса и селезенки в среднем на 26% и 41% (табл. 3). Как показали проведенные эксперименты, введение комплексного растительного средства (PC) в оптимальной экспериментально-терапевтической дозе 300 мг/кг мышам, находящимся в состоянии азатиоприновой иммунодепрессии, нормализовало все вышеперечисленные показатели.
В работе были проведены гематологические исследования крови, которые показали, что введение азатиоприна экспериментальным животным вызывало лейкопению. Так, общее количество лейкоцитов в опыте снизилось по сравнению с интактной группой животных (контроль) в 2,1 раза (в контроле содержание лейкоцитов в 1 мм крови составляло 9,5±1,5 хЮ , а в группе с азатиоприном - 4,5±0,5 х 10 , р 0,02). Введение комплексного PC (в дозе 300 мг/кг) восстанавливало содержание лейкоцитов до 9,1±2,1х106 клеток в 1 мм крови. В таблице 4 приведены изменения лейкоцитарной формулы крови у интактных мышей, животных, находящихся в условиях иммуносупрессии и коррекции комплексным PC. Как видно из данных таблицы 4, азатиоприн вызывал перераспределение элементов крови: уменьшение содержания лимфоцитов (лимфопению) и увеличение содержания сегментоядерных нейтрофилов. Количества других форменных элементов крови достоверно не изменялись. Введение комплексного PC нормализовало лейкоцитарную формулу крови мышей.
Известно, что наиболее информативными показателями активности В -системы иммунитета являются определение титров антител в сыворотке крови и количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке. При исследовании влияния азатиоприна на гуморальный иммунный ответ было установлено, что он снижал как абсолютное число антителообразующих клеток (АОК), так и число АОК на 106 спленоцитов на 56% и 60% соответственно по отношению к контролю. Уровень гемагглютининов в сыворотке крови мышей снижался при этом на 56% . Введение комплексного PC в дозах 100, 300 и 500 мг/кг на фоне азатиоприновой иммунодепрессии достоверно восстанавливало нарушенные показатели гуморального иммунитета {табл. 5). Как следует из приведенных выше экспериментальных данных, оптимальной дозой использования комплексного PC является доза 300 мг/кг массы тела экспериментальных животных. Его иммуномодулирующее действие сравнимо с препаратом сравнения - экстрактом элеутерококка колючего (ЭЭК) в терапевтической дозе. Введение PC в дозе 300 мг/кг интактным мышам не изменяло показатели гуморального иммунитета животных. Влияние комплексного PC на клеточное звено иммунного ответа в условиях азатиоприновои иммуносупрессии определялось в реакциях «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Как известно, реакция РТПХ является одним из феноменов клеточного иммунитета, отражающим иммунореактивность лимфоидных клеток по отношению к трансплантационным антигенам в экспериментах in vivo. Влияние азатиоприна в исследуемой дозе на развитие локальной РТПХ, выражаемой индексом увеличения лимфатических узлов, вызывало снижение индекса реакции на 55,2% {табл. 6.). Использование для коррекции комплексного PC в дозах 100, 300 и 500 мг/кг вызывало восстановление данного показателя. Оптимальной дозой была 300 мг/кг. Ее корригирующее действие было сравнимо с препаратом сравнения - экстрактом элеутерококка колючего.
![Фармакологическая активность местных гемостатических средств в эксперименте и у пациентов с наружными посттравматическими кровотечениями на догоспитальном этапе [Электронный ресурс]](/i/i/4298/177943.png "Фармакологическая активность местных гемостатических средств в эксперименте и у пациентов с наружными посттравматическими кровотечениями на догоспитальном этапе [Электронный ресурс] Киреев Александр Николаевич")
