Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Болезнь Альцгеймера 15
1.1.1. Определение БА 15
1.1.2. Этиология и патогенез БА 15
1.1.2.1 Амилоидная гипотеза 16
1.1.2.2. Холинергическая гипотеза .17
1.1.3. Фармакотерапия БА 18
1.1.3.1. Стратегии лечения БА 18
1.1.3.2. Нейропротективное действие никотина .21
1.1.3.3. Alpha7nAChR как мишень фармакотерапии БА..22
1.2. Никотиновый ацетилхолиновыи рецептор типа альфа7 26
1.2.1. Семейство никотиновых ацетилхолиновых рецепторов26
1.2.2. Характеристика alpha7nAChR 27
1.2.2.1. Ген и варианты альтернативного сплайсинга alpha7nAChR 28
1.2.2.2. Локализация и функция alpha7nAChR в головном мозге 29
1.2.2.3. Локализация и функция alpha7nAChR в периферических органах 31
1.2.3. Биогенез никотиновых ацетилхолиновых рецепторов 34
1.2.3.1. Клеточный аппарат, регулирующий биогенез nAChR 35
1.2.3.2. Влияние типа клеток на экспрессию функционально активного alpha7nAChR 37
1.3. RIC-3-LijanepoHalpha7nACriR 42
1.3.1. Структура RIC-3 42
1.3.2. Локализация RIC-3 43
1.3.3. Функция RIC-3 44
1.4. BDNF как мишень фармакотерапии болезни Альцгеймера 47
2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Выделение РНК 50
2.2. Синтез кДНК 50
2.3. Стандартные методы молекулярной биологии 50
2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 51
2.5. Конструирование плазмидных векторов 53
2.6. Количественная риал-тайм ПЦР 56
2.7. Культивирование клеток 57
2.8. Первичная культура нейронов 57
2.9. Транзиентные трансфекции 58
2.10. Создание рекомбинантных клеточных линий 58
2.11. Окрашивание флюоресцентным a-Bgt 59
2.12. Иммуноцитохимия 59
2.13. FLIPR анализ 60
2.13.1. Реагенты для FLIPR теста 62
2.13.2. Анализ данных FLIPR теста 62
2.13.3. Оценка качества FLIPR теста 63
3. Результаты 64
3.1. Клонирование и характеристика RIC-3 65
3.1.1 Клонирование RIC-3 человека 65
3.1.2. Идентификация нового варианта RIC-3 человека 66
3.1.3. Экспрессия вариантов RIC-3 в тканях человека 69
3.1.4. Предсказание in silico и клонирование RIC-3 крысы 70
3.1.4.1. Идентификация in silico и характеристика RIC-3 крысы 70
3.1.4.2. Клонирование RIC-3 крысы 72
3.1.5. Идентификация и анализ структуры вариантов альтернативного сплайсинга RIC-3 76
3.1.6. Анализ экспрессии вариантов RIC-3 S+/S- в тканях и органах 78
3.1.7. Количественный анализ экспрессии RIC-3 и alpha7nAChR в тканях и органах человека и крысы 80
3.1.8. Субклеточная локализация и транспорт RIC-3 крысы 91
3.1.9. Влияние RIC-3 на поверхностную экспрессию alpha7nAChR 94
3.2. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функциональный alpha7nAChR человека 96
3.2.1. Создание клеточной линии, экспрессирующей alpha7nAChR человека и RIC-3 человека 96
3.2.2. Фармакологическая характеристика клеток СНО-К1, экспрессирующих рекомбинантный человеческий alpha7nAChR 98
3.3. Изучение влияния препарата семакс на уровень BDNF в мозге крысы 107
4. Обсуждение 110
4.1. Клонирование и характеристика RIC-3 112
4.2. Экспрессия транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в разных органах 114
4.3. Субклеточная локализация и функция RIC-3 116
4.4. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR 118
4.5. Влияние семакса на уровень BDNF в мозге крысы 122
Выводы 125
- Никотиновый ацетилхолиновыи рецептор типа альфа7
- BDNF как мишень фармакотерапии болезни Альцгеймера
- Оценка качества FLIPR теста
- Экспрессия транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в разных органах
Введение к работе
Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что болезнь Альцгеймера (БА) является частой формой сенильной деменции, распространение которой в развитых странах составляет до 5% среди населения старше 65 лет (Lobo et а/., 2000). С увеличением продолжительности жизни неиродегенеративные заболевания, обусловленные старением, становятся одной из наиболее актуальных медицинских проблем.
На современном этапе средства фармакотерапии БА ограничены двумя типами препаратов - это ингибиторы ацетилхолинэстеразы (донепезил, галантамин, ривастигмин) (Mayeux and Sano, 1999) и недавно апробированный антагонист NMDA рецепторов, мемантин (Zajaczkowski et ai, 2000; Jain, 2000). Эти препараты временно улучшают симптоматику, но не у всех пациентов. Их использование не позволяет существенно замедлить развитие болезни. Поэтому очевидна необходимость разработки новых подходов к фармакотерапии БА, что в свою очередь требует выявления патогенетически обоснованных молекулярных мишеней, экзогенная регуляция которых позволит обеспечить желаемый эффект.
БА обусловлена комплексом нейрохимических нарушений, подробный анализ которых приведен в работах (Selkoe, 2001; Walsh and Selkoe, 2004). Большинство авторов приходят к заключению, что поддержанию когнитивных функций способствует активация нейрональных н-холинорецепторов. Другим важным эндогенным фактором является мозговой нейротрофический фактор (BDNF), участвующий в формировании, регуляции функциональной активности и регенерации нейронов (Murer et ai, 2001).
Настоящее исследование, выполненное в соответствии с планом международного научно-технического сотрудничества между ГУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН и компанией SienaBiotech (Италия), посвящено изучению никотинового ацетилхол и нового рецептора альфа 7 типа (alpha7nAChR) и выяснению возможности регуляции содержания BDNF новым оригинальным препаратом семакс.
Alpha7nAChR представляет собой ионный канал с высокой проницаемостью для ионов кальция. Наиболее высокие уровни экспрессии этого рецептора найдены в коре, гиппокампе, гипоталамусе и в миндалине (Seguela ef ai, 1993). Активация alpha7nAChR опосредует нейропротекцию, что показано в опытах in vitro с применением ряда токсических воздействий, включая (3-амилоид (Shimohama and Kihara, 2001; Prendergast ef ai, 2001). В опытах in vivo установлено, что стимуляция этого канала ведет к улучшению когнитивных функций (Arendash et ai, 1995; Levin et ai, 1999). Поэтому перспективным представляется создание клеточной модели alpha7nAChR для скрининга и фармакологической характеристики возможных регуляторов рецептора. Однако в достижении цели возникает ряд проблем. В клеточных линиях не нейронального происхождения не удается получить функционально активный рецептор при гетерологической экспрессии alpha7nAChR (Cooper and Miliar, 1997). Сборка и транспорт этого ионного канала являются недостаточно изученным процессом. Однако, как и другие ионные каналы (Green, 1999), он находится под контролем шаперонов эноплазматического ретикулума (ЭР). Недавно был обнаружен новый белок, RIC-3 (resistant to inhibitors of chol in esterase), который оказался необходимым для экспрессии функционирующего alpha7nAChR (Halevi et ai, 2002). Поэтому для
создания рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR, в настоящей работе был использован RIC-3.
Цель и задачи исследования
Основными целями исследования, направленного на изучение новых фармакологических мишеней средств лечения БА, явилось создание клеточной модели функционально активного alpha7nAChR и выяснение влияния нового ноотропного препарата семакс на содержание BDNF в мозге крыс.
Для их достижения необходимо решить следующие задачи:
Клонировать полную кодирующую последовательность RIC-3 человека и крысы для изучения консервативных участков и видовой специфики их структуры и функции.
Идентифицировать и охарактеризовать варианты RIC-3 человека и крысы.
Изучить экспрессию транскриптов RIC-3 в сравнении с экспрессией alpha7nAChR в тканях и органах человека и крысы.
Исследовать субклеточную локализацию RIC-3 в разных типах клеток.
Изучить функцию RIC-3 в процессе созревания alpha7nAChR.
На основании полученных результатов создать и охарактеризовать с использованием фармакологических анализаторов рекомбинантную клеточную линию, экспрессирующую человеческий alpha7nAChR в присутствии человеческого RIC-3.
Фармакологически изучить влияние семакса на динамику содержания BDNF в структурах головного мозга крысы.
Научная новизна работы
Создана рекомбинантная клеточная линия СНО-К1, экспрессирующая функционально активный человеческий alpha7nAChR в присутствии человеческого RIC-3. Впервые клонирована полная кодирующая последовательность ДНК RIC-3 крысы и новый вариант сплайсинга RIC-3 человека, RIC-3-900. Полиморфизм Ser173+/Ser173-, уже описанный для RIC-3 человека, подтвержден для RIC-3 крысы. Впервые получены данные о распределении транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в отделах мозга и в периферических тканях и органах человека и крысы. Описана субклеточная локализация RIC-3 в первичной культуре нейронов коры крысы. Установленные данные показали, что полиморфизм RIC-3 S+/S- не важен для транзиентной экспрессии alpha7nAChR в клетках СНО-К1. Доказана способность человеческого RIC-3 обеспечивать стабильную гетерологическую экспрессию функционально активного человеческого alpha7nAChR в клетках СНО-К1.
Установлено, что препарат семакс в дозах 50 и 250 мкг/кг увеличивает уровень белка BDNF в гиппокампе и в базальных ядрах крысы через 3 часа после интраназального введения.
Научно-практическая значимость работы
Созданная рекомбинантная клеточная линия СНО-К1, экспрессирующая функционально активный человеческий alpha7nAChR в присутствии RIC-3, является новой экспериментальной моделью, дающей возможность проведения фундаментальных исследований сборки, транспорта и регуляции рецептора. Одновременно модель позволяет проводить фармакологический скрининг соединений, новых селективных
агонистов, аллостерических модуляторов alpha7nAChR, на основе которых могут быть созданы оригинальные лекарственные средства лечения нейродегенеративных заболеваний, включая БА. Разработаны молекулярные инструменты для дальнейшего изучения функций RIC-3 и его взаимодействия с alpha7nAChR.
Установленная способность семакса увеличивать уровень BDNF дополняет сведения о механизме действия препарата и обосновывает его применение в качестве ней роп роте кто ра при различных заболеваниях, в патогенезе которых отмечено нарушение регуляторной функции и продукции BDNF.
Основные сведения об апробации работы
Материалы диссертации доложены на 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003), региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Москва, 2005), конгрессе SINS, Искья (сентябрь 2005) и на конгрессе FENS, Вена (июль 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезиса в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включаюещего 214 источников. Работа иллюстрирована 5-ю таблицами и 26-ю рисунками.
Никотиновый ацетилхолиновыи рецептор типа альфа7
Семейство никотиновых рецепторов появилось более миллиарда лет назад через серию генных дупликаций из единственной общей субединицы (Le Novere and Changeux, 1995). Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChRs), вместе с 5- НТ3 рецепторами, GABAA и GABAC рецепторами составляют суперсемейство лиганд-зависимых или активируемых агонистом ионных каналов (LGIC). nAChRs и серотониновые 5-НТ3 рецепторы являются ионными каналами, открытие которых приводит к деполяризации за счет входа в основном ионов Na2+ и Са2+. Другие члены этого суперсемейства, включая рецепторы для глицина и ГАМКд, проницаемы для анионов. Для всех членов семейства характерна пентамерная структура. у ионный канал У позвоночных идентифицировано и клонировано семнадцать разных субъединиц nAChR: сИ, (31, у, б и , составляющие никотиновый рецептор нервно-мышечного синапса, и а2- аЮ, (32 -(34, формирующие нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Le Novere et al., 2002; Millar, 2003), В каждой субъединице имеются четыре трансмембранных домена. Второй трансмембранный домен каждой из пяти субъединиц рецептора выстилает водный канал, тогда как остальные трансмембранные участки отделяют канал от двойного слоя липидов мембраны. Ионный канал представлен внеклеточным заряженным кольцом, ответственным за проводимость ионов, и внутриклеточным заряженным кольцом, которое служит фильтром для ионов определенного заряда. Сужение канала внутри мембраны формирует гидрофобные ворота, которые открываются в момент связывания агониста, что позволяет прохождение ионов через канал (Mazurov et al., 2006). Амино- и карбокситерминальные домены находятся вне клетки. Большая N-терминальная петля несет сайт связывания ацетилхолина. Внутриклеточная петля между доменами III и IV участвует в процессах сборки и направленного транспорта nAChR, а также содержит места для фосфорилирования рецептора (Valor ef al., 2002) (рис. 2). В процессе эволюции первой отделившейся ветвью никотиновых рецепторов были каналы, состоящие соответственно из субъединиц альфа7, альфа8 или альфаЭ и альфаЮ, связывающие альфа-бунгаротоксин с высокой аффинностью. Особенность этих субъединиц состоит в способности формировать функционально активные гомопентамерные каналы.
Впервые это было продемонстрировано при экспрессии a!pha7nAChR цыпленка в ооцитах Xenopus (Couturier et al., 1990). Однако, отдельные работы указывают на возможность формирования функционально активных гетеромерных структур при ко-экспресии этих рецепторов в различных системах (Yu and Role, 1998; Girod et al., 1999; Palma et ai, 1999; Khiroug et ai, 2002; Plazas et ai, 2005). Например, гетеропентамеры, состоящие из альфа7 и альфа8 субъединиц, найдены в тканях птиц (Couturier et al., 1990; Gorti et al., 1994; Orteils and Lunt, 1995), а субъединица альфаЮ встраивается в функционирующий рецептор только в присутствии альфаЭ (Elgoyhen etal., 2001). alpha7nAChR обладает более высокой проницаемостью для ионов кальция, чем рецептор мышечного типа и другие нейрональные никотиновые рецепторы. С точки зрения фармакологии этот рецептор характеризует умеренная чувствительность к ацетилхолину, причем сродство к агонистам нарастает в следующем порядке: ацетилхолин ОМРР цитизин никотин. Alpha7nAChR десенситизируется быстрее Других никотиновых рецепторов и полностью восстанавливает активность в короткий промежуток времени в присутствии недесентизирующих концентраций агонистов. Alpha7nAChR обладает высокой чувствительностью к а-Bgt и почти необратимо блокируется этим токсином в наномолярных концентрациях (Seguela et al., 1993). Каналы альфа7 также специфически блокируются MLA. 1.2.2.1. Ген и варианты альтернативного сплайсинга alpha7nAChR Ген, кодирующий alpha7nAChR человека, занимает как минимум 75 кб на хромосоме 15q14 и включает 10 экзонов. В головном мозге человека обнаружено несколько вариантов альтернативного сплайсинга этого гена (Gault et al., 1998). В хромаффинных клетках быка был обнаружен вариант alpha7nAChR, несущий делецию экзона, кодирующего второй трансмембранный домен (Garcia-Guzman et al., 1995). В тканях мыши был найден транскрипт, являющийся результатом альтернативного сплайсинга интрона 9 (Saragoza et а!., 2003). Severance и соавт. обнаружили в нейронах коры крысы вариант сплайсинга alpha7-2, несущий вставку из 87 пн между экзонами 4 и 5, представляющую новый экзон (4а). Биофизические и фармакологические свойства гомопентамерного канала, образованного субъединицами alpha7-2, отличаются от свойств классического alpha7nAChR (Severance et al, 2004). Из всех рецепторов, связывающих a-Bgt, только каналы, состоящие из альфа7 субъединиц, найдены в нервной ткани млекопитающих. Субъединицы альфа8 найдены в мозге птиц (Lukas et al., 1999), а альфаЭ и альфаЮ экспрессируются в механосенсорных волосках вестибулярных органов (Elgoyhen et al., 1994). Alpha7nAChR является самым распространенным подтипом никотиновых рецепторов в головном мозге после альфа4бета2 содержащих ионных каналов (Gotti et al., 1994; Berg and Conroy, 2002).
Транскрипты, кодирующие субъединицы alpha7, найдены в ряде популяций нейронов взрослого мозга. Высокие уровни экспрессии обнаружены в обонятельных областях, в некоторых зонах коры, в гиппокампе, миндалине, гипоталамусе, среднем мозге и в слое клеток Пуркинье в мозжечке (Seguela ef al., 1993). Умеренная экспрессия обнаружена также в спинном мозге (Seguela et ai, 1993). Исследования с использованием иммуногистохимии также выявили экспрессию alpha7nAChR в большинстве отделов мозга (Dominguez et at., 1994). Анализ первичных культур (14 DIV) продемонстрировал, что нейроны гиппокампа связывали в пять раз больше [125l]a-Bgt, чем нейроны коры, тогда как в глиальных клетках обнаружить связывание [125I]a-Bgt не удалось (Barrantes et ai, 1995). Однако, имеются работы, сообщающие об экспрессии функционально активного alpha7nAChR в клетках микроглии (Shytle et ai, 2004; De Simone et ai, 2005). На субклеточном уровне с помощью иммуноцитохимии показана экспрессия alpha7nAChR в теле нейронов и на дендритах, тогда как аксонального и терминального окрашивания выявить не удалось (Dominguez et ai, 1994). Однако, функциональные исследования свидетельствуют о пре-, пост- и перисинаптической локализации этого рецептора (Alkondon et ai, 1998; Marchi et ai, 2002). Следовательно, большинство структур, в которых обнаружены высокие уровни alpha7nAChR, относятся к лимбической системе, что свидетельствует о его важности в процессах, связанных с памятью (Seguela et ai, 1993). Наличие рецептора на пост- синаптической мембране подтверждает возможность участия alpha7nAChR в быстрой синаптической передаче (Alkondon et ai, 1998), тогда как пресинаптическую локализацию связывают со способностью alpha7nAChR регулировать выброс нейротрансмиттеров. Так, например, показано, что этот рецептор модулирует выброс глютамата, ацетилхолина, ГАМК и допамина (McGehee et ai, 1995; Alkondon et ai, 1997; Maggi et ai, 2001; Mameli-Engvall et ai, 2006). Более того, новые данные позволяют предположить, что alpha7nAChR участвует в регуляции взаимодействия нервной и иммунной систем, поскольку выявлено его ингибирующее влияние на фактор некроза опухоли альфа (TNF-а) и стимуляция синтеза ЦОГ-2 и PGE2 (Shytle et al., 2004; De Simoneefa/., 2005). Кроме того, установленное изменение уровня экспрессии alpha7nAChR в отделах мозга в динамике роста можно трактовать как участие этого рецептора в процессах развития (Broide et al., 1995; Zhang ef а/, 1998).
BDNF как мишень фармакотерапии болезни Альцгеймера
BDNF является членом семейства нейротрофических факторов роста. Он способствует выживанию, дифференцировке и поддержанию нейронов центральной и периферической нервных систем. Этот пептид влияет на рост аксонов, формирование синапсов и участвует в локальном ответе на различные типы нейронального стресса. Биологическое действие BDNF опосредовано двумя классами мембранных рецепторов: p75NTR, который связывает нейротрофины с низкой аффинностью, и trk В, который селективно связывает BDNF и другой нейротрофин NT-4/5 (Murer et а/., 2001). Исследования in vitro показали, что BDNF обспечивает выживание и дифференцировку холинергических нейронов гиппокампа и базальных ядер переднего мозга (Alderson et а!., 1990; Friedman et а/., 1995; Lindholm et at, 1996). Передача сигнала через BDNF/Trk В чрезвычайно важна для процессов обучения и памяти (Yamada et а/., 2002). Показано, что нокауты по trk В характеризуются значительными нарушениями обучаемости (Minichielloefa/., 1999). Имеется ряд свидетельств о патологических изменениях функции BDNF в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА. У пациентов с БА снижено содержание мРНК и белка BDNF в гиппокампе, чего не наблюдается для мРНК других нейротрофинов, NGF или NT-3, в височной коре и, возможно, в других зонах коры (Phillips et ais 1991; Murray et a/., 1994). Скопление белка BDNF обнаружено в соответствии с амилоидными бляшками (Ferrer et а/., 1999). Интересно заметить, что мемантин, препарат, который уже используется для терапии БА, увеличивает уровни мРНК для BDNF, а также усиливает экспрессию рецептора trk В в разных отделах мозга крысы (Marvanova et а/., 2001). Эти экспериментальные данные позволяют предположить, что BDNF является потенциальной мишенью для лечения нейродегенеративных заболеваний. Однако, для применения экзогенного BDNF имеются значительные ограничения. Как для любого пептидного препарата, для BDNF характерны короткое время полужизни и недостаточная проницаемость через гематоэнцефалический барьер. Более того, учитывая широкий спектр эффектов BDNF, важно локально увеличивать его уровни только в областях, где имеется его дефицит.
Поэтому, препарат, селективно увеличивающий уровни BDNF в гиппокампе и базальных ядрах переднего мозга, может быть перспективным для фармакотерапии Б А. 2.1. Выделение РНК. Образцы полиаденилированной РНК, полученные из отделов ЦНС (головной мозг взрослого человека; фетальный мозг; кора больших полушарий; лобная доля; гиппокамп; хвостатое ядро; таламус; мозолистое тело; миндалина; гипофиз; мозжечок; спинной мозг) и из периферических органов и тканей (надпочечники; поджелудочная железа; щитовидная железа; костный мозг; лимфатический узел; сердце; легкое; желудок; печень; селезенка; почка; скелетная мышца; яичко; матка; плацента) приобретены в Clontech (Palo Alto, СА). Тотальную РНК крысы выделяли из неразделенного головного мозга, из нескольких его отделов (кора больших полушарий, гиппокамп, средний мозг, гипоталамус, мозжечок) и из периферических органов (сердце, легкое, печень, селезенка, скелетная мышца, плацента) взрослых самок крыс CD при помощи преципитации в растворе 3 М LiCI / 6 М мочевина и фенол-хлороформной экстракции (Auffray and Rougeon, 1980). Тотальную РНК из яичек крысы получали от взрослых самцов Wistar. 2.2. Синтез иДНК. кДНК синтезировали из 2 мкг тотальной РНК крысы или из 1 мкг полиаденилированной РНК человека для каждого органа с помощью обратной транскриптазы, Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) и праймера oligo(dT) (Proligo France SAS) (500 нг) в объеме реакции 20 мкл, следуя протоколу производителя. После синтеза кДНК добавляли 80 мкл стерильной бидистиллированной воды, и 1 мкл этого раствора использовали в ПЦР. 10 нг кДНК крысы и 5 нг кДНК человека использовалось во всех экспериментах по клонированию и изучению экспрессии из расчета 50% эффективности обратной транскриптазы. Продукты ПЦР и фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1% - 2,5% агарозном геле (в зависимости от ожидаемого размера ДНК), содержащем бромистый этидий и приготовленном в буфере ТАЕ. Для экстракции продуктов из геля использовали набор QIAquick Gel extraction Kit (QIAGEN). Очистку продуктов ПЦР проводили при помощи набора QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN). Трансформация химически компетентных coli (ТОРЮ Invitrogen) выполнялась по протоколу One Shot ТОРЮ Chemical Transformation Protocol (Invitrogen). Плазмидная ДНК выделялась из бактериальных культур с помощью наборов QIAGEN Plasmid Purification kits (Mini-, Midi-, Maxiprep) по протоколу производителя. Эта процедура основана на модифицированном щелочном лизисе и дальнейшем связывании плазмидной ДНК с анион-обменной смолой (QIAGEN) в условиях низкой концентрации соли. РНК, белки, красители и низкомолекулярные соединения удаляются с помощью промыва буфером со средней концентрацией соли. Плазмидная ДНК элюируется буфером с высокой концентрацией соли и затем концентрируется и обессаливается с помощью преципитации изопропанолом.
Для отбора положительных клонов проводилась диагностическая рестрикция с использованием подходящих ферментов и следуя протоколу производителя. Все эндонуклеазы рестрикции были приобретены в Invitrogen. Плазмидная ДНК подвергалась автоматическому секвенированию (MWG Biotech). Для приготовления образцов для секвенирования плазмидная ДНК осаждалась с помощью ацетата натрия и промывалась 100% этанолом. 2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР для анализа экспрессии генов проводились с использованием рекомбинантной ДНК полимеразы Taq DNA Polymerase (Invitrogen) по протоколу производителя в объеме 30 мкл. В ПЦР использовали следующие условия амплификации (далее «стандартные условия»): 3 мин при 94С, 30 циклов х (30 с при 94С, 30 с при 55С, 30 с при 72С); 10 мин при 72С. Для клонирования RIC-3 человека использовалась система Gateway (Invitrogen), Gateway - это новая универсальная система клонирования, использующая механизм сайт-специфической рекомбинации бактериофага лямбда (Landy, 1989). Коротко, ПЦР продукт вставляется в так называемый входной (entry) вектор. Правильная ориентация вставки достигается за счет включения последовательности САСС в 5]-конец прямого праймера, используемого в ПЦР. При вставке продукта ПЦР в вектор эта последовательность взаимодействует с GTGG, присутствующей в векторе. В последовательность entry вектора включены сайты специфической рекомбинации. Эти сайты затем используются в реакции рекомбинации, служащей для переноса вставки в интересующий вектор экспрессии, называемый "destination". Преимущество этой системы состоит в возможности использования множественных векторов экспрессии, подходящих для разных экспериментальных схем. Таким образом, кДНК RIC-3 человека была сначала клонирована в вектор pENTR/DOPO с помощью набора pENTR Directional ТОРО Cloning Kit, по протоколу производителя. Затем при помощи реакции сайт-специфической рекомбинации RIC-3 человека был перенесен в вектор pcDNA-DEST40 Gateway, кодирующий устойчивость к G-418, и в вектор pcDNA 6.2/cl_umio-DEST, кодирующий устойчивость к бластицидину. кДНК RIC-3-900 человека и RIC-3 крысы были клонированы в вектор pCR-Blunt П-ТОРО по протоколу для набора Zero Blunt ТОРО PCR Cloning Kit (Invitrogen). Основой системы клонирования «ТОРО Cloning» является фермент ДНК топоизомераза I (DNA topoisomerase I), обладающая одновременно рестриктирующими и лигирующими свойствами. Это позволяет осуществлять быструю вставку в вектор продуктов ПЦР с тупыми концами. RIC-3 крысы был субклонирован в векторы экспрессии.
Оценка качества FLIPR теста
. Данные, полученные на приборе FLIPR, экспортировались для обсчета в виде разности Max-Min интенсивности флюоресцентного сигнала на двух интервалах, соответсвующих первому и второму добавлению соединений. Первый интервал: изображения 10 - 80; второй интервал: изображения 100 - 200 (рис. 5). Значения ЕС5о и IC5o определялись с помощью программы Xlfit 4.1: Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+(EC50/X)AHillSlope) (модель 205), где X - концентрация, Y - ответ. Bottom - значение нижнего плато кривой, Тор - значение верхнего плато кривой, Hill Slope -коэффициент Хилла. Т фактор отражает расстояние между отклонением отрицательного контроля и отклонением положительного контроля (Zhang et al., 1999). Таким образом, Z фактор является подходящим параметром для оценки качества и надежности полученных данных. Для тестов на клетках рекомендуемое значение Т фактора больше 0,4. 71 факторы, вычисленные для опытов на клетках СНО-А7-129, были в основном больше 0,6. «ДНК, кодирующая человеческий белок RIC-3, была клонирована из полиаденилированной мРНК гипокампа (Clontech), методом, описанным с разделе 2.5. Праймеры, включающие ATG и стоп кодоны, были синтезированы, основывась на известной последовательности RIC-3 человека (RefSeq NM_024557). В результате ОТ-ПЦР были получены четыре продукта определенного размера (рис. 6). Продукт размером са. 1100 пн соответсвует известной полной последовательности RIC-3 человека. Более короткие варианты, идентифицированные в этой реакции, возможно являются уже известными или новыми вариантами альтернативного сплайсинга RIC-3 (см. ниже). Оказалось, что большинство исследованных тканей экспрессируют несколько вариантов RIC-3. К тканям, экспрессирующим все четыре варианта, можно отнести: кору головного мозга, миндалину, хвостатое ядро, мозжечок, мозолистое тело, гиппокамп, печень, лимфатический узел, поджелудочную железу, гипофиз, скелетные мышцы и спинной мозг. Ряд органов, а именно, надпочечники, сердце, легкое, желудок, яичко, щитовидная железа и матка, экспрессируют три варианта: полную последовательность RIC-3 NM_024557 (RefSeq), новый вариант RIC-3-900 и короткий вариант са. 550 пн, возможно соответсвующий AL832601 (RefSeq). Таламус и лобная доля экспрессируют только два коротких варианта. В селезенке найдены полный и самый короткий варианты. Только полный вариант обнаружен в кДНК плаценты.
Важно отметить, что фетальный мозг экспрессирует только наиболее короткий вариант RIC-3. Уровни RIC-3 в костном мозге и почке оказались ниже чуствительности метода при используемых условиях ПЦР. 3.1.4. Предсказание in silico и клонирование RIC-3 крысы 3.1.4.1. Идентификация in silico и характеристика RIC-3 крысы Из литературы известны полная последовательность RIC-3 С. elegans (Halevi et al., 2002) и человека (Halevi et a/., 2003). Для ортолога крысы в базе данных EnsembI (Ensemble Transcript ID ENSRNOT00000020137) была найдена только неполная предсказанная последовательность ДНК. Информация о полной последовательности RIC-3 крысы отсутствует. Полная кодирующая последовательность RIC-3 крысы была предсказана, используя сравнение последовательности кДНК RIC-3 человека (RefSeq NM_024557) с геномной последовательностью крысы, с помощью программы "BLAST rat sequences", NCBI (рис. 11). В геномной последовательности крысы, в области, где лежит З -последовательность RIC-3, имеется значительный пробел. Таким образом, для предсказания полной кодирующей последовательности RIC-3 крысы, не было достаточно только сравнения кДНК RIC-3 человека с геномной последовательностью крысы. Для завершения предсказания полной кодирующей последовательности ДНК RIC-3 крысы были использованы EST. Информация о последовательности EST крысы была получена с помощью BLAST полной последовательности кДНК RIC-3 человека против EST крысы, доступных в базе данных Rat Genome Resources, NCBL Следующие EST были идентифицированы как кодирующие R1C-3 крысы: СВ807150, СВ706666, СВ740094, СВ712401. Эти последовательности были объединены с геномной последовательностью крысы, полученной из BLAST анализа геномной ДНК крысы с кДНК RIC-З человека. В результате была получена полная кодирующая последовательность RIC-3 крысы. Для поиска интрон-экзонных границ в гене RIC-3 крысы использовалось попарное сравнение кДНК человека с геномной последовательностью крысы и программа для предсказания донорных/акцепторных сайтов сплайсинга Neural Network Splice Site Prediction tool (wvvw.bdpp.org) (рис. 12). Для предсказания последовательности промотора использовалась программа Neural Network Promoter Prediction tool (рис. 12, С). Локус RIC-3 крысы занимает примерно 54 кб на хромосоме 1. По аналогии с RIC-3 человека он состоит из 6 экзонов. Однако, нельзя исключить существование дополнительных экзонов в связи, например, с отсутствием информации о геномной последовательности в 3 области гена (см. рис. 11). Основываясь на предсказанной последовательности, была синтезирована пара ПЦР праймеров, включающих ATG и стоп кодоны предсказанного полного кодирующего варианта RIC-3 крысы. Эти праймеры были задействованы в ОТ-ПЦР, с использованием высоко точной ДНК полимеразы и РНК из гиппокампа крысы в качестве матрицы (см. раздел 2.5.). Гиппокамп был выбран в связи тем, что белок, кодирующий alpha7nAChR, найден в большом количестве в данном отделе мозга (Barrantes et a/., 1995), a RIC-3, возможно, участвует в процессе созревания этого рецептора (Halevi et a\.s 2003).
Один продукт ПЦР, размером са. 1100 пн был получен в результате амплификации и клонирован с помощью ТОРО клонирования. Для диагностического отбора положительных клонов плазмидная ДНК подвергалась рестрикции при помощи фермента Sst І. В зависимости от ориентации вставки ожидались два типа фрагментов: 855 и 333 пн. Три положительных клона были выбраны для секвенирования. Секвенирование ДНК подтвердило идентичность двух клонов, тогда как третий клон отличался отсутствием триплета AGC, кодирующего серии в положении 173 (Ser173). Таким образом, были получены два варианта RIC-3 крысы, S+/S-, отличающиеся по Ser173 (рис. 13). Этот полиморфизм уже описан для RIC-3 человека (Halevi et al., 2003). Предсказанная аминокислотная последовательность экспериментально полученного RIC-З крысы была сравнена с аминокислотной последовательностью RIC-З человека, а также с известной неполной последовательностью RIC-3 крысы и с in silico предсказанной последовательностью (рис. 14). Последовательность RIC-3 крысы, предсказанная in silico, в целом соответсвует экспериментально полученной последовательности кДНК RIC-3 крысы. Однако, выявлены и некоторые отличия. Центральная часть последовательности, предсказанной in silico, соответствующая экзону 3, отличалась от RIC-3 крысы, полученного в результате клонирования. Это можно объяснить неправильной in silico сборкой предсказанных экзонов, что привело к сдвигу рамки считывания, и, в результате, к модифицированной аминокислотной последовательности. Причиной же пробела в 3 области гена является отсутствие геномной последовательности и соответствующих EST для этой области (рис. 11). Однако, предсказание in silico дало возможность синтезировать специфические праймеры и клонировать полный вариант кДНК, кодирующей RIC-3 крысы. Сравнение аминокислотной последовательности экпери ментально полученного RIC-3 крысы с последовательностью RIC-3 человека выявило 86% сходства.
Экспрессия транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в разных органах
Экспрессия RIC-3 в разных тканях и органах изучена недостаточно. С помощью нозерн блоттинга транскрипты RIC-3 человека найдены в возбудимых тканях: в мышцах, мозге и сердце, хотя дополнительные транскрипты обнаружены и в невозбудимых тканях (Halevi et ai, 2003). При анализе головного мозга мыши при помощи гибридизации in situ выявлены низкие уровни РНК RIC-3 в большинстве отделов; самые высокие из них найдены в гиппокампе, мозжечке и в верних холмиках (Halevi et ai, 2003). Белок RIC-3 был обнаружен в нейрональных клетках и в мышцах С. elegans (Halevi et ai, 2002). Однако, данные о количественной экспрессии RIC-3 в разных органах в литературе отсутсвуют. Для характеристики профиля экспрессии RIC-3 в разных органах человека и крысы в настоящей работе была использована риал-тайм ПЦР. Такой же анализ был проведен для гена, кодирующего alpha7nAChR. По полученным результатам профиль распределения alpha7nAChR в целом соответствует распределению RIC-3 в разных органах. Оба гена экспрессируются в основном в головном мозге. RIC-3 более, чем alpha7nAChR, распространен на периферии. Важно отметить, что во всех органах, экспрессирующих alpha7nAChR, найдены также значительные уровни RIC-3, что косвенно свидетельствует о возможности взаимодействия этих двух белков. Более того, полученные данные подтверждают гипотезу, по которой RIC-3 является шапероном, участвующим в процессе биогенеза функционального alpha7nAChR (Halevi et ai, 2002). Тем не менее, высокие уровни экспрессии RIC-3 найдены в некоторых отделах головного мозга (хвостатое ядро, мозолистое тело, таламус, гипофиз, мозжечок), которые экспрессируют очень низкие уровни alpha7nAChR. Полученные результаты позволяют предположить, что функция RIC-3 не ограничивается только участием в процессе созревания alpha7nAChR. Новые количественные данные о профиле экспрессии alpha7nAChR в разных отделах головного мозга и на периферии, полученные в данной работе, в целом совпадают с описанным в литературе распределением этого гена (Seguela et зі, 1993). Наибольшие уровни экспрессии alpha7nAChR в головном мозге обнаружены в коре больших полушарий, гиппокампе и миндалине -отделах, непосредственно связанных с когнитивной функцией.
Количественный анализ распределения транскриптов alpha7nAChR на периферии выявил высокий уровень экспрессии в яичке. Это коррелирует с недавно опубликованными данными, указывающими на участие alpha7nAChR в репродуктивной функции (Bray et al., 2005; Kumar and Meizel 2005). 4.3. Субклеточная локализация и функция RIC-3 Изучение субклеточной локализации RIC-3 важно для понимания его функции. По данным Castillo и соавт. RIC-3-GFP и RIC-3-RFP локализованы внутри клетки и ко-локализуются с маркерами ЭР и аппарта Гольджи в трансфицированных клетках COS (Castillo et al., 2005). Похожие результаты получены в другой лаборатории, где на клетках COS7 показано, что R1C-3 находится в ЭР, а на плазматической мембране выявить экспрессию RIC-3 не удается ни с помощью иммунофлюоресценции, ни с помощью биотинилирования клеточной поверхности (Cheng et al., 2005). Однако, в работе Williams и соавт. RIC-3 найден на плазматической мембране в клетках 2ЭЗНЕК, стабильно экспрессирующих alpha7nAChR при помощи биотинилирования поверхности клетки (Williams et al., 2005). Cheng et al., объясняют это несоответствие тем, что RIC-3 транспортируется на поверхность клетки вместе с alpha7nAChR. Однако, по результатам настоящей работы не удается выявить экспрессию RIC-3-YFP на поверхности клетки вне зависимости от присутствия alpha7nAChR во всех исследованных типах клеток. Это говорит о том, что RIC-3 скорее всего локализован в ЭР. Важно иметь в виду, что объемная метка, такая как YFP, может изменить субклеточную локализацию меченного белка по сравнению с нативным белком. Однако, в использованных экспериментальных условиях, наличие метки не влияло по-крайней мере на способность RIC-3 обеспечивать поверхностную экспрессию alpha7nAChR. Данная работа демонстрирует, что ко-экспрессия alpha7nAChR и RIC-3 в клетках СНО-К1 ведет к формированию на поверхности клетки каналов, способных связывать a-Bgt. Этот эффект не является видоспецифичным: разные комбинации ортологов alpha7nAChR и RIC-3 человека и крысы дали похожие результаты во всех исследованных типах клеток. Анализ последовательности демонстрирует, что некоторые области RIC-3 строго консервативны в процессе эволюции (Halevi et al., 2003). Полученные результаты подтверждают также эволюционную закрепленность функции этого белка. Вместе с тем механизм, по которому R!C-3 обеспечивает экспрессию никотиновых рецепторов, остается неясным. Эксперименты с использованием ко-иммунопреципитации указывают на возможность прямого взаимодействия между RIC-3 и alpha7nAChR (Williams et al., 2005; Lansdell et al., 2005). Эти данные, а также локализация RIC-3 в ЭР и отсутствие RIC-3 в клеточных линиях, не способных к формированию функционального alpha7nAChR, позволяют предположить, что RIC-3 выполняет роль шаперона в ЭР. Возможно, он контролирует правильный фолдинг и сборку субъединиц рецептора, стабилизируя определенные конформации и/или обеспечивает взаимодействие с другими факторами, необходимыми для созревания функционально активного рецептора. Для RIC-3 человека известны два полных варианта альтернативного сплайсинга, различающиеся только по одному триплету, кодирующему серии.
В данной работе похожие варианты были найдены в процессе клонирования RIC-3 крысы. Программа, предсказывающая наличие сайтов фосфорилирования в белках эукариот (http://www.cbs.diu.dk/services/NetPhos/), определяет последовательность, включающую Ser 173, как возможный сайт фосфорилирования с помощью GSK-33. Предполагалось, что этот сайт может быть важной точкой для регуляции функции белка. Выполненные эксперименты по ко-трансфекции RIC-3 S+ или RIC-3 S-с alpha7nAChR в клетках СНО-К1 дали похожие результаты - в обоих случаях на поверхности клетки формировался канал, способный связывать a-Bgt. Таким образом, можно заключить, что наличие Ser173 в RIC-3 крысы не влияет на экспрессию alpha7nAChR на поверхности клетки. Тем не менее, этот полиморфизм может быть важен для регуляции самого RIC-3 или для пока неизвестных функций этого белка. Выяснение этой возможности является предметом будущих экспериментов, направленных на изучение неизвестных функций RIC-3. 4.4. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR Ряд работ свидетельствует, что фармакологические и биофизические свойства рецепторов могут быть видоспецифичными (Stokes et al., 2004; Garcia-Gusman et al., 1997). Так как целью данной работы было изучение системы alpha7nAChR с возможным применением для поиска средств терапии неиродегенеративных заболеваний, для создания рекомбинантной клеточной линии был использован alpha7nAChR человека. Линия создавалась на основе клеток СНО-К1. Преимущество этих клеток состоит в том, что они либо не экспрессируют, либо экспрессируют очень низкие уровни эндогенных рецепторов для большинства нейротрансмиттеров. Более того, эти клетки неприхотливы, их время удвоения составляет примерно 24 часа, что представляет потенциально не ограниченный источник материала, подходящего для разных типов экспериментов, в том числе для скрининга.
