Введение к работе
Актуальность темы. Прогресс в фундаментальных исследованиях программированной клеточной гибели (ПКГ) создает предпосылки для применения полученных результатов в экспериментальной и клинической медицине. ПКГ (апоптоз) — естественный физиологический многоэтапный процесс, в результате которого элиминируются "отработавшие" или поврежденные клетки и обеспечивается баланс между пролиферацией и гибелью клеточных популяций в многоклеточном организме.
Широкий спектр заболеваний сопряжен с нарушением регуляции апоптоза. Недостаточность апоптоза характерна для аутоиммунных болезней, злокачественных опухолей, гемобластозов, аллергических заболеваний, лекарственной устойчивости к антибластомным препаратам (Ярилин А.А., 1996; Hannun, 1997). Усиление апоптоза регистрируют при ишемическом повреждении тканей, генерализованных бактериальных и вирусных инфекциях, иммунодефицитах, дефектах эмбрионального развития, нейродегенеративных заболеваниях, замедлении регенерации клеток, лучевой болезни, интоксикациях, глюкокортикостероидной терапии (Ярилин А.А., 1998). В связи с этим фармакологи и клиницисты считают приоритетным направлением изыскание соединений с регулирующим воздействием на ПКГ как среди новых химических веществ, так и известных лекарственных средств (Утешев Д.Б. и др., 1998; Schmitt, Lowe, 1999). Общая фармакология апоптоза становится областью пристального внимания (Ward et al., 1999), а понимание возможностей медикаментозного контроля апоптоза приобретает растущее значение для фармацевтической промышленности (Kinloch et al„ 1999).
Поиск регуляторов апоптоза имеет предпочтительные шансы на успех в тех фармакологических группах, представители которых обладают широким спектром биологических эффектов в различных тканях-мишенях. Пристальное внимание в этом аспекте привлекает лекарственный препарат ксимедон, принадлежащий к классу пиримидиновых производных.
Ксимедон (1,2-дигидро-4,6-диметил-М-(р-оксиэтил)-пиримидон-2), синтезированный в ИОФХ им. акад. А.Е. Арбузова КНЦ РАН (Резник B.C., Пашкуров Н.Г., 1966), является одним из наиболее простых негликозидных пиримидин-нуклеозидов. Ксимедон был выбран из ряда структурных аналогов и впервые фармакологически изучен как стимулятор регенерации И. В. Заиконниковой, Н.Г.
Абдрахмановой и СМ. Горбуновым (1979). С 1993 года препарат разрешен для промышленного производства и клинического применения в комплексной тера-пиии ожоговых больных (приказ МЗ РФ №287 от 07.12.93; регистрационное удостоверение № 93/287/7).
Обнаружены и исследованы различные фармакологические свойства кси-медона: радиопротекторное (Цибулькин А.П. и др., 1992), противовоспалительное (Цибулькин А.П. и др., 1993), противовирусное (Поздеев O.K., 1993), ангио-протекторное и антиатеросклеротическое (Ибрагимов О.Б. и др., 1996), антиагре-гационное (Цибулькин А.П. и др., 1996), антистрессорное и мембраностабилизи-рующее (Гараев Р.С. и др., 1997). Показана способность ксимедона стимулировать посттравматическую регенерацию периферического нерва (Рагинов И.С., 2000) и повышать эффективность противовирусной вакцинации (Ильясова Г.Ф., 2000). Установлен системный характер иммуномодулирующего действия ксимедона и раскрыты механизмы этого эффекта (Слабнов Ю.Д., 1998). Опыт использования ксимедона в клинической практике обощен Измайловым С.Г. и др. (2001).
Однако, несмотря на обилие экспериментальных и клинических результатов, не разработана интегральная концепция, обобщающая в единых рамках многообразие фармакологических эффектов ксимедона в контексте потенциальной апоптоз-регулирующей активности препарата. Расшифровка механизмов реализации последней имеет самостоятельное научное значение для фундаментальных представлений о регуляции апоптоза и роли пиримидиновых производных в ПКГ, а идентификация апоптоз-модулирующей активности ксимедона мо-^етч:лужить^босшованйем~етолотшическсто применения гюновым показаниям.
Цель исследования — определить основные механизмы апоптоз-регулирующей активности ксимедона.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние ксимедона на коэкспрессию человеческих белков
ингибиторов апоптоза BCL-2 и BAG-1.
2. Изучить действие ксимедона на трансмембранный потенциал митохонд
рий (Дут) в эффекторной стадии апоптоза.
-
Оценить способность ксимедона предотвращать потерю фосфатидилсериновои асимметрии клеточной мембраны в пост-митохондриальной стадии апоптоза.
-
Изучить влияние ксимедона на изменение проницаемости цитоплаз-матической мембраны в процессе программированной клеточной гибели.
-
Разработать цитофлуориметрический метод одновременного определения трансмембранного митохондриального потенциала (Д\ут) и фосфатидилсериновои асимметрии мембраны тромбоцитов человека в цельной крови ex vivo.
-
Исследовать влияние ксимедона на трансмембранный митохондриаль-ный потенциал (Аут) и экспрессию фосфатидилсерина при конститутивной апоптоз-подобной гибели тромбоцитов человека in vitro.
-
Изучить влияние ксимедона на трансмембранный потенциал клеток прокариот (. coli), испытывающих дефицит питательного субстрата.
-
Охарактеризовать влияние ксимедона на активность полифункционального фермента ДНК-топоизомеразы I, участвующего в репликации, транскрипции, репарации ДНК и апоптозе.
-
В тест-системах различного уровня организации (про- и эукариоты) исследовать ксимедон на наличие генопротекторных свойств, составляющих предпосылку апоптоз-ингибирующей активности.
10. Осуществить пилотную клиническую оценку ксимедона при состояниях,
характеризующихся повышенным уровнем индукции повреждений ДНК (хрониче
ский остеомиелит) и ускорением темпов программированной клеточной гибели
(дистанционная у-терапия).
Научная новизна. Впервые на основании комплексного исследования апоптоз-регулирующей и антимутагенной активности негликозидного аналога пи-римидин-нуклеозидов препарата ксимедона установлена его антиапоптогенная активность в CD4+ Т клетках Jurkat и рабдомиобластах человека и раскрыты следующие механизмы этого эффекта: стимуляция коэкспрессии белков репрес-соров апоптоза BCL-2 и BAG-1; торможение падения трансмембранного митохондриального потенциала; поддержание фосфатидилсериновои асимметрии клеточной мембраны; ограничение роста проницаемости цитоплазматической мембраны.
Впервые показана избирательность антиапоптогенного действия ксимедо-на в отношении различных индукторов программированной клеточной гибели.
Разработан оригинальный цитофлуориметрический метод одновременного определения трансмембранного митохондриального потенциала (Дут) и фосфа-тидилсериновой асимметрии мембраны тромбоцитов человека в цельной крови ex vivo; впервые обнаружено, что при конститутивной каспаз-независимой апоп-тоз-подобной гибели тромбоцитов in vitro падение трансмембранного митохондриального потенциала предшествует потере фосфатидилсериновой асимметрии мембраны.
Установлен протекторный эффект ксимедона при изучении действия препарата на трансмембранный потенциал (Ду) в клетках coll, испытывающих дефицит питательного субстрата.
Впервые показано, что цитомегаловирус стимулирует митохондриально-зависимую программированную гибель рабдомиобластов человека in vitro, а кси-медон ограничивает этот процесс.
Впервые предложен фармакологический способ стимуляции коэкспрессии апоптоз-ингибирующих белков BCL-2 и BAG-1 в клетках человека транскрипци-онно-активным лекарственным препаратом ксимедон.
Научно-практическая значимость. Выявлены и экспериментально обоснованы новые показания к назначению ксимедона: 1) профилактика и/или торможение апоптоза при заболеваниях, сопровождающихся ускорением темпов ВС1.-2/ВАЗ-1/Дут-зависимой ПКГ; 2) защита от повреждающих эффектов эндо- и экзомутагенов, дефицит репарации ДНК.
В пилотных клинических исследованиях доказана генопротекторная активность ксимедона и его способность ограничивать повреждающие эффекты индукторов апоптоза (у-облучение) и мутагенов (кластогенные факторы сыворотки больных с хроническим гнойным воспалением).
Предложена схема скрининга фармакологических ингибиторов апоптоза с учетом их антимутагенной/ДНК-протекторной активности.
Дано предварительное экспериментальное обоснование для испытаний ксимедона в биотехнологическом производстве для замедления апоптоза и повышения производительности культур клеток-продуцентов.
Раскрытие клеточно-молекулярных механизмов антиапоптогенного и гено-протекторного действия ксимедона позволило сформулировать обобщающую концепцию, интегрирующую в единых рамках обнаруженные ранее гетерогенные фармакологические эффекты препарата и экспериментально обосновать расширение показаний к его применению.
Положения, выносимые на защиту:
-
Лекарственный препарат ксимедон способен ингибировать программированную гибель клеток человека.
-
Механизмы антиапоптогеннного эффекта ксимедона опосредованы:
стимуляцией коэкспрессии белков ингибиторов апоптоза BCL-2 и BAG-1;
торможением перехода проницаемости митохондрий;
поддержанием фосфатидилсериновой асимметрии клеточной мембраны;
- ограничением роста проницаемости цитоплазматической мембраны на дис-
тальных этапах апоптотического каскада;
- стимуляцией активности фермента ДНК топоизомеразы I.
-
Антиапоптогенный эффект ксимедона проявляется в ядросодержащих клетках различной гистогенетической принадлежности, но отсутствует в безъядерных тромбоцитах.
-
Антиапоптогенное действие ксимедона избирательно в отношении индуктора программированной клеточной гибели: ксимедон защищает клетки от апоптоза, вызванного дефицитом сывороточных факторов роста, ингибитором ДНК топоизомеразы I камптотецином и цитомегаловирусом человека, но не предотвращает Раз/С095-сгимулированныйапоптоз.
5. Ксимедон обладает генопротекторным/антимутагенным эффектом, который
сопряжен с антиапоптогенным действием препарата.
Внедрение результатов исследования. Использованные методы трехцветного цитофлуориметрического анализа программированной клеточной гибели лимфоидных популяций и тромбоцитов внедрены в клинико-лабораторную практику Республиканской клинической больницы №2 МЗ РТ и Института медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта.
Результаты исследования используются в преподавании соответствующих разделов студенческого практикума «Клиническая иммунология» в Институте медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта, на кафедре фармакологии КГМУ и кафедре микробиологии КГУ.
Апробация работы. Положения диссертации доложены и обсуждены на Международной конференции «Нейро-иммунные взаимодействия и окружающая среда», Санкт-Петербург, 1995; серии научных семинаров Института медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта, 1999; заседании научного общества фармакологов РТ, 2000, 4-ом Конгрессе РААКИ, Москва, 2001; Четвертой (1998) и Пятой (2000) международных школах иммунологии, Пущино; IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Москва, 2001; 18 Конгрессе Немецкого общества иммунологов, Галле, 2002.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 научных работ.
Работа выполнена: Основной экспериментальный материал получен в период с 1990 под 2001 гг. во время учебы и работы на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета; на кафедре фармакологии КГМУ; в лаборатории генетической токсикологии кафедры микробиологии Казанского государственного университета; в институте медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта, клиника Шарите, ФРГ; в Республиканском медицинском диагностическом центре МЗ РТ и в РЦПБ СПИД МЗ РТ. Клинические серии исследований выполнены на кафедре общей хирургии КГМУ в сотрудничестве с доц. В.Ю. Терещенко и к.м.н. К.В. Малышевым и в КОЦ МЗ РТ в сотрудничестве с д.м.н. А.В. Гилевым и д.м.н. Ю.Д. Слабновым (РКБ2 МЗ РТ).
Автор выражает искреннюю признательность коллективам указанных учреждений и особо благодарит ученых, под влиянием которых сформировалось его научное мировоззрение: доцента И.Е. Черепневу (КГУ), профессора И.А. ^^дещовуЧКГМУ)г^рофессораН/1оргггРаймайгг(йнститут медицинской микрб7 биологии и иммунологии, Университет Ульма, ФРГ) и доктора медицины Флориа-на Керна (институт медицинской иммунологии, Берлинский университет им. Гумбольдта, клиника Шарите, ФРГ).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (65 отечественных и 283 иностранных источника). Работа объемом 240 страниц включает 28 таблиц и иллюстрирована 15 рисунками.
![Фармакологическая активность местных гемостатических средств в эксперименте и у пациентов с наружными посттравматическими кровотечениями на догоспитальном этапе [Электронный ресурс]](/i/i/4298/177943.png "Фармакологическая активность местных гемостатических средств в эксперименте и у пациентов с наружными посттравматическими кровотечениями на догоспитальном этапе [Электронный ресурс] Киреев Александр Николаевич")
![Фармакологическая коррекция функциональной активности нейтрофилов в условиях влияния магнитных полей повышенной напряженности [Электронный ресурс]](/i/i/4406/188443.png "Фармакологическая коррекция функциональной активности нейтрофилов в условиях влияния магнитных полей повышенной напряженности [Электронный ресурс] Разинькова Наталья Сергеевна")
![Влияние растительных сборов с противовоспалительной активностью на процессы свободно-радикального окисления [Электронный ресурс]](/i/i/4506/196564.png "Влияние растительных сборов с противовоспалительной активностью на процессы свободно-радикального окисления [Электронный ресурс] Замятина Светлана Владимировна")
