Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов растительного происхождения 13-14
1.1. Антикоагулянтная активность фукоиданов. Взаимосвязь между структурой и проявляемой фармакологической активностью 15-29
1.2. Антикоагулянтная активность галактоманнанов 30-33
1.3.Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов животного происхождения 33-37
1.4. Антикоагулянтная активность гликозаминогликанов 33-37
1.5. Антикоагулянтная активность сульфата хитозана 37-43
1.6. Нейтрализация антикоагулянтной активности 43-48
Глава II. Материалы и методы исследования 49-60
Собственные исследования
Глава III. Антикоагулянтная активность нативных и модифицированных фукоиданов из бурых морских водорослей 61 -67
3.1. Антикоагулянтная активность in vitro/in vivo и комплексообразование с сульфатом протамина нативных и частично гидролизованных фукоиданов из Fucus evanescens и Laminarга cichorioides 61-67
3.2. Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов из Fucus evanescens и Lammaria cichorioides сульфатом протамина в тесте АЧТВ 67-71
3.3. Влияние нативного и дезацетилированного образцов фукоиданов из Fucus evanescens на агрегационную способность тромбоцитов 71-73
3.4. Фармакодинамические параметры фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides при внутривенном введении крысам 74-75
3.5. Фармакодинамические параметры фукоидана из Fucus evanescens при внутривенном введении кроликам 75-78
3.6. Активность протеина С в плазме кроликов после внутривенного введения фукоидана из Fucus evanescens 78-79
3.7. Влияние на амидолитическую активность плазмина в плазме кроликов после внутривенного введения фукоидана из Fucus evanescens 79-80
3.8. Антитромботическая активность фукоидана из Fucus evanescens 80-82
3.9. Геморрагическая активность фукоидана из Fucus evanescens 82
3.10. Сравнение антикоагулянти ой активности in vitro и комплексообразования с сульфатом протамина химически модифицированных и нативных фукоиданов из Fucus evanescens 83-92
3.11. Влияние нативных образцов фукоиданов FeF и FeFl из Fucus evanescens на агрегационную функцию тромбоцитов in vitro 92-95
3.12. Антикоагулянтная активность гидролизованных и хроматографически выделенных фракций фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina 95-107
3.13. Антикоагулянтная активность фукоиданов из водорослей Fucus evanescens, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Costaria Costata 107-119
3.14.Комплексообразование при биоспецифическом электрофорезе 120-123
Глава IV. Антикоагулянтная активность галактоманнанов
4.1. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатированных производных галактоманнана из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub in vitro 124-132
4.2. Антикоагулянтная активность галактоманнана-НБОзНа из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub. in vitro 132-134
4.3. Влияние ГМ-HSOsNa на агрегационную способность тромбоцитов 134-135
4.4. Фармакодинамические параметры и антитромботическая активность галактоманнана-HSC Na из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub 135-138
4.5. Антикоагулянтная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан 138-146
Заключение 147-161
Выводы 162-164
Список литературы 165-198
- Антикоагулянтная активность фукоиданов. Взаимосвязь между структурой и проявляемой фармакологической активностью
- Нейтрализация антикоагулянтной активности
- Антикоагулянтная активность гидролизованных и хроматографически выделенных фракций фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina
- Антикоагулянтная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время для предотвращения и лечения тромбоэмболических осложнений широко используемыми в клинической практике препаратами являются нефракционированный гепарин, низкомолекулярпые гепарины, а также антагонисты витамина К (Haas S. 2009; Liodakis Е. и соавт. 2009; Laskin С.А. и соавт. 2009). Однако, эти вещества обладают рядом побочных эффектов, такими как непредсказуемость (в случае нефракционированного гепарина), кровотечения, развитие тромбоцитопении, остеопороза и др (Liodakis Е. и соавт. 2009; Sugimoto Т., Matsuo Т., Wanaka К. 2009; Le Templier G., Rodger М.А. 2008; Guermazi S., EIloumi-ZghaL Н., Ben Hassine L 2007; Rajgopal R и соавт. 2008 ). В связи с этим значимым и перспективным является поиск фармакологических средств для профилактики и лечения тромбозов на основе антикоагулянтов прямого типа действия из ряда новых полусинтетических и природных сульфатированных полисахаридов.
Сульфатированные полисахариды проявляют разные виды фармакологической
активности, такие как антикоагулянтная, антитромботическая, противовирусная,
радиопротекторная, противоязвенная (Hayashi К., Nakano Т., Hashimoto М. 2008; Chen
J.H. и соавт. 2009; Medeiros V.P. и соавт. 2008; Alekseyenko T.V. и соавт. 2007; Kiphuth I.C.
и осавг. 2009; Li N. и соавт. 2005). В качестве ангитромботических средств, кроме
нефракционированного гепарина в настоящее время используется ряд низкомолекулярных
гепаринов со средним распределением молекулярных масс от 4 до 7 кДа и отношением
активностей против тромбина и фактора Ха (аІІа/аХа) от 1,5 до 5. Интенсивно
используются в разработках по изысканию антитромботических средств и другие
представители основных классов гликозаминогликанов. Отмечена корреляция между
структурой и антикоагулянтной/антитромботической активностями
нефракционированного, низкомолекулярных гепаринов и сульфатов гепарана, дерматана, хондроитина, которые выделяют из тканей млекопитающих (Olauser B.F., Pereira M.S., Monteiro R.Q. 2008; Osborne S.A. и соавт. 2008; Bethea H.N. и соавт. 2008; Korir A.K., Larive C.K. 2009). Значительный интерес представляют сульфатированные полисахариды из бурых, красных и зеленых морских водорослей (фукоиданы, каррагинаны) и беспозвоночных (фуканы). Эти сульфатированные полисахариды ингибируют активность тромбина, факторов 1Ха и Ха посредством активации плазменных ингибиторов сериновых протеиназ свертывающей системы крови - антитромбина III и кофактора гепарина П. При значительной молекулярной массе (80-100 кДа) удельная анти-Па активность у отдельных
фукоиданов достигает 130 ЕД/мг (Nishino Т. и соавт. 1994; Jenniskens G.J. и соавт. 2000). Антитромботический эффект фукоиданов усиливается за счет высвобождения из эндотелия сосудов ингибитора пути тканевого фактора (Boisson-Vidal С. и соавт. 2008; Giraux J.L. и соавт. 1998). Кроме того, такие природные полимеры как хитозан, галактоманнан сульфатируют для придания им антикоагулянтных свойств.
Цель исследования - исследование связи между структурами и механизмами антикоагулянтного действия нативньгх и химически модифицированных фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Costaria Costata, а также сульфатированного галактоманнана [СГМ, ММ=127 кДа и степень сульфатирования (СС)=1,46] из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.).
Задачи исследования:
1. Исследование влияния сульфатированных полисахаридов растительного
происхождения [фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens,
Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica,
Costaria Costata], а также СГМ (MM=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis
tetragonoloba (L.)) и полисахаридных ионных комплексов (ПИК) на свертывающую
систему крови человека in vitro:
- оценка влияния на разные этапы свертывания крови;
- определение ингибиторной активности сульфатированных полисахаридов по
отношению к тромбину и активированному фактору Ха;
2. Исследование влияния сульфатированных полисахаридов на свертывающую систему
крови in vivo:
оценка фармакодинамических параметров сульфатированных полисахаридов при внутривенном введении кроликам, крысам;
оценка антитромботической активности сульфатированных полисахаридов при экспериментальном венозном тромбозе у крыс;
изучение влияния на содержание уровня плазминогена и протеина С в плазме экспериментальных животных;
- оценка геморрагической активности сульфатированных полисахаридов;
3. Поиск веществ-антидотов для нейтрализации антитромбиновой активности
сульфатированных полисахаридов;
4. Фиксирование комплексов между полианионами сульфатированными полисахаридами
и поликатионом антидотом - сульфатом протамина с
помощью биоспецифичного электрофореза;
5. Нейтрализация антитромбиновой активности образцов фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides сульфатом протамина в тесте АЧТВ.
Практическая значимость работы
Ввиду того, что используемые в настоящее время антикоагулянтные средства обладают рядом побочных эффектов (тромбоцитопения, геморрагический эффект, остеопороз, неэффективность при врожденной или приобретенной недостаточности антитромбина III, неспособность ингибировать тромбин, связанный с фибрином и др.), поиск фармакологических средств для профилактики и лечения тромбозов является значимым и перспективным.
Установлены некоторые моменты механизма действия фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Costaria Costata, СГМ (MM=127 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub и ПИК на свертывающую систему крови in vitro I in vivo и выбраны наиболее активные вещества для дальнейшего исследования.
Положения, выносимые на защиту:
Антикоагулянтная активность фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Costaria Costata и СГМ (MM=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) зависит от молекулярной массы, моносахаридного состава и степени сульфатирования.
Внутривенное введение фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) кроликам и крысам приводит к возрастанию антикоагулянтной активности плазмы с увеличением дозы.
Антитромботическая активность фукоидана из Fucus evanescens на модели венозного стаза увеличивается при внутривенном введении крысам в диапазоне доз 2,5-10 мг/кг. При внутривенном введении СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) 100% ннгибирование роста тромба достигается при дозе 3 мг/кг.
Электрофоретическая подвижность (размеры пиков преципитации с сульфатом протамина) фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria
cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Costaria Costata и СГМ (MM=127 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) в агарозном геле с сульфатом протамина положительно коррелирует с антикоагулянтной активностью исследуемых образцов.
Сульфат протамина нейтрализует антитромбиновую активность фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides.
Фукоидан из бурой морской водоросли Fucus evanescens и СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) в конечных концентрациях от 0,1 до 0,5 мг/мл ингибируют агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ.
Показана связь между химическим строением компонентов и проявляемой антикоагулянтной активностью ПИК, состоящих из "+" галактозилированного хитозана, "-" сульфатированного галактоманнана и "+" и "-" N-сукцинилхитозана в разных весовых сочетаниях
Апробация диссертации
Основные результаты и положения диссертации были представлены на Всесоюзных и Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях: III съезд фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; III Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа, 2008; «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; IX Международная конференция «Современные тенденции в исследованиях и использовании хитина и хитозана», Ставрополь, 2008; 31 Конгресс Федерации Европейских биохимических обществ, Афины, Греция, 2008; IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009.
Апробация диссертации проведена на заседании проблемной комиссии «Патология гемостаза» (протокол №9 от 24.06.2009).
Публикации: по теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из
введения, главы «Материалы и методы», 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 295 источников, из них 26 отечественных, 269 зарубежных. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 36 рисунками.
Антикоагулянтная активность фукоиданов. Взаимосвязь между структурой и проявляемой фармакологической активностью
Среди СП, обладающих АК активностью, большой интерес представляют фукоиданы, которые выделяют из водорослей и морских беспозвоночных. Впервые фукоиданы выделили в 1913 году [153]. Многие годы фукоиданы использовали как потенциальный источник L-фукозы, хотя их АК активность была известна давно [132]. Эти полисахариды состоят главным образом из сульфатированной Z-фукозы, легко экстрагируются из клеточной стенки бурых водорослей горячей водой [221] или раствором кислоты [51],и могут достигать более 40% сухой массы выделенных клеточных стенок [114]. Фукоиданы бьши предложены как вариант, альтернативный НФГ. Будучи субстанциями растительного происхождения, они с меньшей вероятностью содержат инфекционные агенты типа вирусов или прионов. Подобно НФГ, фукоиданы обладают широким спектром фармакологических активностей - АК, AT, противовоспалительная, антикомплементарная; проявляют способность к усилению пролиферации и адгезии, устойчивость к вирусной инфекции (ингибируют репликацию вируса иммунодефицита человека, вируса герпеса, человеческого цитомегаловируса) [ПО, 52, 249, 54, 122, 278]. Так, например, Hayashi К и соавт. выделили фукоидан из бурой водоросли Undaria pinnatifida, оказывающий ингибиторный эффект in vitro на репликацию вируса герпеса I типа (HSV-1) [122].
Из водного экстракта бурой водоросли Stoechospermum marginatum выделили сульфатированный фукоидан, содержащий фракцию SmWE. С помощью анионообменной хроматографии получили сульфатированный фукоидан F3 с ММ 40 кДа. ЯМР спектроскопия и метилированный анализ показали, что полимер состоял из основной цепи (1— 4)- и (1— 3)-связанных-а- -фукопиранозньгх остатков, которые находились при С-2 и С-3, а фукозные остатки бьши наиболее сульфатированы при С-2 и/или С-4. SmWE и F3 являются селективными ингибиторами герпес вируса типа 1 и типа 2 в Vero клетках со значением антивирусной эффективной концентрации 50% (ЭК 50) в диапазоне 0,63-10,0 мкг/мл. Данные вещества являются высоко селективными благодаря отсутствию цитотоксичности. Антивирусная активность зависела от присутствия сульфатированньгх фукоиданов в течение периода абсорбции [28].
В работе [70] показали ингибирующий эффект фукоидана из бурой водоросли U. pinnatijida на инвазию мерозоитов малярийного плазмодия в эритроциты in vitro и in vivo.
Были изучены противоопухолевая и антиметастатическая активности фукоидана, выделенного из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens у мышей линии С57В1/6 с трансплантированной аденокарциномой легкого. После одиночного и повторного введения в дозе 10 мг/кг фукоидан из F. evanescens оказывал умеренный противоопухолевый и антиметастатический эффекты [33].
Medeiros V.P. и соавт. описали АК активность сульфатированного гетерофукоидана из бурой водоросли Lobophora variegate, состоящего из фукозы, галактозы и сульфата в молярных соотношениях 1:3:2. Кроме того, фукоидан из L. variegate проявлял видимую противовоспалительную активность, ингибируя миграцию лейкоцитов к месту повреждения [190].
Li N. и соавт. исследовали токсичность фукоидана из бурой водоросли Laminaria japonica на крысах линии Wistar после орального введения. При дозе 300 мг/кг не бьшо выявлено никаких значительных токсикологических изменений. Однако, при увеличении дозы от 900 до 2500 мг/кг веса время свертывания значительно удлинялось [174].
Таким образом, фукоиданы представляют собой биологически активные природные полимеры и перспективные соединения для разработки новых лекарственных препаратов АК, противовирусного, противоопухолевого, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия. Однако, взаимосвязь между структурой и биологической активностью фукоиданов еще не до конца разъяснена. Фукоиданы широко распространены среди бурых водорослей (Phaeophyceae), зеленых (Chlorophyceae) [183], красных (Rhodophyceae) [222] и золотых (Xanthophyceae), а также найдены в наземных растениях и водорослях пресных вод. Barroso Е.М. и соавт. выделили гетерофуканы А, В и С из бурой водоросли Spatoglossum schroederi (Dictyotaceae). Фукоидан А (21 кДа) состоит из Р (1-3) глюкуроновой кислоты. При внутривенном введении фукоидана А в дозе 20 мкг/г веса крысы получили зависимый от дозы АК эффект. AT активность фукана A in vivo была связана со стимулированием синтеза ГС эндотелиальными клетками, наподобие НФГ [43].
При исследовании фукоиданов водорослей всегда возникали вопросы, связанные с номенклатурой и чистотой. Фукоиданы представляют собой высоко сульфатированные, обычно разветвленные полисахариды, содержащие помимо фукозы, галактозу, маннозу, ксилозу, уроновые кислоты и иногда даже белки. Кроме того, их состав меняется в зависимости от вида водорослей, процесса экстракции [114], времени сбора и местных климатических условий [51, 274].
Первоначально фукоиданы определяли как гомофуканы [156, 263, 175]. По-видимому, наиболее целесообразно в соответствии с IUPAC называть сульфатированными фуканами полисахариды, основанные главным образом на сульфатированной фукозе, с менее чем 10% других моносахаридов. Этот термин был применен к сульфатированным фуканам морских беспозвоночных, тогда как термин «фукоидан» использовали для фуканов, экстрагированных из водорослей [233].
Однако, до сих пор не удается проследить, каким образом структура этих полимеров влияет на проявление ими фармакологических свойств, поскольку известны лишь единичные примеры фукоиданов водорослей с точно установленным строением [157, 221, 192]. Фукоиданам морских водорослей присуща сложная структура. Недавние исследования выявили последовательные повторяющиеся единицы в структуре гомофукоиданов различных видов. Было показано, что различные гомофукоиданы имеют большие соотношения а-(1— 3) и а-(1— 4) гликозндных связей с сульфатными группами при втором углеродном атоме за исключением других сульфатов, ацетильных групп или цепей в позициях 2, 3, 4, (5, 6). Более того, мало что известно о структурных особенностях гетерофукоиданов. Большинство трудностей в исследовании их структуры возникает в связи с тем, что они являются гетерогенными по своему составу, поэтому часто прибегают к ЯМР, который, несмотря на все свои достоинства, дает ограниченные данные и полное описание структуры данных полисахаридов остается проблематичным.
Percival и Ross описали фукоидан из бурой водоросли Fucus vesiculorus как полисахарид, состоящий из Z-фукозы с а-(1-2) гликозидными связями и сульфатными группами в положении 4. Эта модель фукоидана из F. vesiculorus была единственной структурной моделью для фукоидана более 40 лет [221]. В 1993 году Patankar M.S. и соавт. пересмотрели структуру фукоидана из F. vesiculorus [220]. Их модель отличалась главной гликозидной цепью: а-(1-3) вместо а-(1-2). Позиция сульфата находилась также в 4 положении. Недавние исследования выявили другой тип структуры для фукоидана из Ascophyllum nodosum [71, 83]. Этот фукоидан содержит большие соотношения а-(1-3) и а-(1-4) гликозидных связей [83]. Повторяющаяся структура сменяющих друг друга а (1— 3) и а (1— 4) гликозидных связей определена и для олигосахаридов (около 8-14 моносахаридных остатков), выделенных из фукоидана A Nodosum [72] (рис. 1 А)
Нейтрализация антикоагулянтной активности
Все антикоагулянты имеют побочные эффекты, так у 1 - 2% пациентов при лечении НФГ бывают серьезные осложнения, причем возможны даже опасные для жизни кровотечения [36, 85, 261]. Для нейтрализации АК активности НФГ используют поликатионы антидоты - ПС и полибрен [81, 176]. Поликатионы связывают отрицательно заряженный НФГ, формируя неактивные комплексы [81].
В основном для нейтрализации АК активности НФГ при операциях на сердце и у пациентов с кровотечениями, вызванными введением НФГ, используют ПС [169, 150, 152, 218]. Протамины - белки, относящиеся к простым основным протеинам клеточного ядра. Они состоят из аминокислот, построенных в линейные агрегаты, содержат большое количество аргинина (80%). ММ в пределах 2000-12000 Да [169]. ПС, полученный из спермы лосося, был первым антидотом НФГ [66, 68]. Однако, ПС индуцирует серьезные побочные эффекты, такие как анафилактический шок, значительное уменьшение кровяного давления, повышенное сердцебиение, остановку сердца [93, 215]. ПС демонстрирует высокую иммуногенность [169, 131]. У больных диабетом отмечают невосприимчивость к ПС. Это связано с наличием антител к ПС, вырабатываемых на препараты инсулина, содержащие ПС [160]. Кроме того, ПС создает множество перекрестных связей с белками плазмы [69, 60, 64, 87].
ПС влияет на функцию тромбоцитов [69], часто неэффективен при кровотечении у пациентов, принимающих препараты НМГ [195, 197].
В исследованиях Massonnet-Castel и соавт., при весовых отношениях протамин/гепарин более чем 5, ПС не нейтрализует полностью аХа активность НМГ [188, 229]. Объяснение эффекта может состоять в том, что молекулярное взаимодействие между ПС и НМГ изменяется в зависимости от вида НМГ. Эксперименты с ПС и поли-Ь-лизином показали, что степень сульфатирования НФГ важна для взаимодействия с СП [292, 144]. Меньшая плотность заряда сульфатов - основная причина того, что АК активность НМГ не полностью нейтрализуется ПС [79].
Некоторые авторы считают, что нейтрализация активности НФГ посредством ПС является результатом конкурентного связывания СП и ингибитора сериновых протеиназ белка AT III с НФГ. Вследствие большего сродства к НФГ сульфат протамина вытесняет AT III из комплекса гепарин-AT III, таким образом снижая АК активность НФГ [216].
Некоторые из синтетических полиаминовых кислот демонстрируют более широкий спектр нейтрализации АК активности НФГ, чем ПС [102]. Например, полибрен - синтетически полимеризованная четырехкомпонентная соль аммония [228, 22], в тестах свертывания крови в концентрации 7,9 мг/мл полностью нейтрализует АК активность НФГ в концентрации 1,2 ЕД/мл [139, 244]; по другим данным 0,75 мг полибрена снимают АК эффект 1 мг НФГ [22]. По данным ряда авторов, полибрен при наличии высокой активности обладает меньшим побочным действием, чем ПС, однако, при быстром введении может вызывать снижение артериального давления, возможна выработка антител на полибрен, отмечены случаи токсического влияния на почки [22]. Некоторые ученые сообщают, что полибрен более стабилен в плазме, чем ПС [22]. Однако, при назначении полибрена, как и ПС, нужен надежный контроль за его эффектом [22]. Несмотря на сообщения о лучших, по сравнению с ПС, показателях, никаких данных о широком и успешном применении полибрена на практике (в современной медицине) обнаружить не удалось.
Основываясь на том, что для нейтрализации пентасахаридной последовательности НФГ не нужна вся молекула ПС, а только небольшой участок неповрежденной богатой аргинином последовательности; для электростатического взаимодействия достаточно низкомолекулярного ПС. Группа авторов проводит работы по созданию низкомолекулярных ПС. Ожидается, что низкомолекулярные ПС будут иметь менее выраженные побочные эффекты.
В. работе ChangL.C. и соавт. образцы низкомолекулярных ПС получали с помощью расщепления исходного протамина термолизином [66]. Эти исследования показали прямую зависимость степени нейтрализации АК активности НФГ от ММ протамина. Молекулы с ММ не ниже 1,1 кДа нейтрализуют АК активность НФГ. Однако, определить аминокислотную последовательность, которая нейтрализует АК активность НФГ, так и не удалось. Авторы полагают, что для полной нейтрализации АК активности НФГ потребуется б остатков аргинина [66]. Стратегии, направленные на предотвращение кровотечений во время операций на сердце, включают введение аналогов лизина, таких как эпсилон-аминокапроновой кислоты, транексамовой кислоты или апротинина [146,57].
Апротинин - ингибитор активности множества сериновых протеиназ, включая плазмин, трипсин, калликреин, химотрипсин, активированный протеин С и тромбин [57]. Апротинин является единственным препаратом, одобренный FDA (Federation drag administration), с целью уменьшения кровотечений при шунтировании коронарных артерий. Но при таких побочных эффектах, как почечная недостаточность, риск инфаркта миокарда, инсульт, энцефалопатии, использование апротинина зачастую считают неоправданным [170, 147].
ЭКА - синтетический антифибринолитик. который в основном используют для уменьшения кровотечений при і трансплантации печени. Эффект основан на образовании обратимого комплекса с плазминогеном и плазмином, что приводит к ингибированию протеолитической активности плазмина. Для уменьшения послеоперационной потери крови эффективно использование апротинина в низких дозах. По сравнению с апротинином, ЭКА демонстрирует значительно больший риск послеоперационных кровотечений. При введении ЭКА отмечают побочные эффекты, такие как: ухудшение функции печени, аритмия, тромбоэмболии [245].
Фактор тромбоцитов 4, гепарин-связывающий белок (ММ=29000 Да), обнаружен в а-гранулах тромбоцитов [106]. Рекомбинантный фактор тромбоцитов 4 быстро и эффективно снимает АК активность НФГ, при этом никаких серьезных побочных эффектов не наблюдается [88].
Наряду с используемыми в настоящий момент антидотами АК активности НФГ, проводят исследования по изысканию новых веществ, способных нейтрализовать АК активность НФГ. В исследованиях Barbara P. Schick и соавт. пептиды, содержащие гепарин связывающие последовательности, показывают высокое сродство к некоторым НМГ [243]. Данные пептиды нейтрализуют аХа активность НФГ, НМГ (Lovenox и Orgaran) in vitro и НМГ (Lovenox) in vivo. Эти пептиды эффективны и для нейтрализации антитромбиновой активности НФГ и могут являться перспективными кандидатами для вытеснения ПС. [137, 276]. Авторы считают, что эти пептиды могут заменить ПС при операциях по аортокоронарному шунтированию и при некоторых других хирургических вмешательствах [135].
Антикоагулянтная активность гидролизованных и хроматографически выделенных фракций фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina
Исследовали связь между контролируемым изменением структуры образцов фукоидана из водорослей Laminaria saccharina и проявляемой ими АК активностью. Для деполимеризации нативного фукоидана, с целью получения образцов с меньшей ММ, использовали ферментный препарат - экстракт из гепатопанкреаса камчатского краба. По концентрациям полученных образцов фукоиданов, при которых время свертывания плазмы в тесте активированного частичного тромбопластшювого времени увеличивается в два раза. гидролизованные образцы эффективнее нативного и контрольных влияли на внутренний путь свертывания крови. Лучше исходного активность фактора Ха снижал гидролизованный образец 3. Отсутствие связи между эффективными концентрациями фукоиданов и их антитромбиновой активностью по гепарину свидетельствует о разных механизмах влияния этих веществ на внутренний путь свертывающей системы крови. Такая же закономерность отмечена и при определении способности фукоиданов ингибировать амидолитическую активность тромбина и фактора Ха. Различия в эффективных концентрациях фукоиданов в коагулологических (где присутствуют плазменные ингибиторы антитромбин и кофактор гепарина II) и амидолитических (присутствует только антитромбин) тестах свидетельствуют о том, что для проявления АК активности фукоиданам из L. saccharina необходим кофактор гепарина П. Наряду с ферментативным расщеплением фукоидана из водоросли Laminaria saccharina (-26) была проведена анионообменная хроматография этого полисахарида. В результате были получены фракции F-43 и F-44, соответственно. Препараты F-26 и F-44 состоят преимущественно из остатков фукозы и сульфата, в то время как фракция F-43 обогащена нефукозными моносахаридными фрагментами (в основном, галактозой и уроновымн кислотами). Снижение специфической активности нативного фукоидапа, измеренной амидолитически, в сравнении с измеренной коагулологически, свидетельствует том, что этот полисахарид осуществляет АК активность посредством плазменных ингибиторов сериновых протеиназ - антитромбина и кофактора гепарина II. Образец F 44 (сера 36,7) имеет равные специфические антитромбиновые активности, измеренные в коагулологическом и амидолитическом методах, что, вероятно, связано с его способностью ингибировать тромбин посредством только антитромбина. Отсутствие уроновых кислот и Man не влияет на ингибирование тромбина. Образец F 43 во всех использованных тестах продемонстрировал снижение АК активности, в некоторых случаях на два порядка. Таким образом, фракция нативного фукоидана, обогащенная нефукозными моносахаридными фрагментами, имеет низкую АК активность. При определении специфической АК активности образцов фукоиданов в коагулологических и амидолитических тестах следует оценивать антикоагулянтное действие по эффективным концентрациям, а не по стандартам гепаринов.С использованием методов современной синтетической химии углеводов впервые синтезированы фрагменты фукоиданов заданного строения.
Для определения АК активности получили образцы фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina: 1-исходный фукоидан; 2-гидролизованный фукоидан 1мМ соль (контроль для 3); 3- гидролизованный фукоидан 1мМ соль; 4- гидролизованный фукоидан ЮмМ соль (контроль для 5); 5- гидролизованный фукоидан ЮмМ соль; 6- гидролизованный фукоидан 1мМ соль. В тесте активированного частичного тромбопластинового времени все образцы фукоиданов в конечных концентрациях 0,26 - 2,6 мкг/мл удлиняли время появления фибринового сгустка плазмы крови человека (рис.16).
При максимальной концентрации фукоиданов в плазме время свертывания составило 47 - 72,2 сек (в контроле - 32,15±0,22). Концентрациии фукоиданов, при которых время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2АЧТВ), в сравнении с контрольным, составили для: 1 - 3,5±0,1 мкг/мл; 2 - 4,85±0,3 мкг/мл; 3 - 2,4±0,1 мкг/мл; 4 - б,1±0,2 мкг/мл; 5 - 3,72±0,2 мкг/мл; 6 - 2,45±0,1 мкг/мл (Таблица 1). Для нефракционированного гепарина, выбранного в качестве стандарта, подобная величина составила 0,5±0,01 мкг/мл. Антитромбиновые активности (alia) фукоиданов, рассчитанные по гепарину (21,2 - 31,8 ЕД/мг), незначительно отличались от alia активности исходного образца (30,0±0,4 ЕД/мг) и в некоторых случаях коррелировали с величиной 2АЧТВ.
Используя тест РеаКлот определяли влияния фукоиданов на активность фактора Ха по времени появления сгустка плазмы. Все образцы фукоиданов в конечных концентрациях 0,34 - 8.3 мкг/мл удлиняли время появления сгустка плазмы человека (рис 17).
При максимальной концентрации фукоиданов в плазме время свертывания составило 40,5 - 42,4 сек (в контроле - 21,1±0,4 сек). Концентрации фукоиданов, при которых время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2РеаКлот), в сравнении с контрольным, составили для: 1 - 8,2±0,5 мкг/мл; 2 - 8,4±0,4 мкг/мл; 3 - 4,9±0,2 мкг/мл; 4 - 8,3±0,3 мкг/мл; 5 - 8,3±0,4 мкг/мл; б - 7,8±0,4 мкг/мл (табл. 20). Для низкомолекулярного гепарина, выбранного в качестве стандарта, эта величина составила 0,4±0,02 мкг/мл. Способность фукоиданов ингибировать фактор Ха выражали в анти-фактор Ха активности (аХа). Рассчитанные по гепарину аХа активности фукоиданов составили 9,8 - 15,9 ЕД/мг. Антифактор Ха активность образца 3 (15,9±1,2 ЕД/мг) достоверно увеличивалась в 1,7 раза, в сравнении с аХа активностью исходного фукоидаиа (9.6±0,9ЕД/мг).
Способность исследуемых образцов фукоиданов ингибировать активность тромбина и фактора Ха определяли в амидолитических тестах с использованием хромогенных субстратов S 2238/S 2222 и антитромбина человека (рис.18 и рис 19). Образцы 1-5 в концентрациях 0,01 - 95 мкг/мл снижали скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата, образец 6 действовал подобным образов в концентрациях 0,095 — 95 мкг/мл (рис 21).
Способность ингибировать активность тромбина достоверно, в сравнении с исходным и контрольным, возрастала только у образца 3. При этом, концентрации 1С 50 составили 0,04± 0,005; 0,15±0,01 и 0,025 ± 0,002 мкг/мл. соответственно. Эффективная концентрация наиболее активного гидролизованного образца превышала 1С 50 для стандарта гепарина в 5 раз. Однако, антитромбиновые активности образцов, рассчитанные по стандарту гепарина, не демонстрировали увеличения способности ингибировать тромбин (8,8 - 66,6 ЕД/мг), в сравнении с исходным (68±5,5 ЕД/мг).
Ингибирование амидолитическои активности фактора Ха выражено у всех образцов в малой степени (рис 18).
Концентрация 1С 50 для наиболее активного образца 6 составила 100±19 мкг/мл, в 1000 раз превышая 1С 50 для стандарта гепарина (табл 15). При расчете аХа по стандарту гепарина, достоверно в сравнении с контрольным (2,7±0,04 ЕД/мг), возрастала способность ингибировать активность фактора Ха только у образца 3 (12,7±0,07 ЕД/мг).
Таким образом, по концентрациям исследованных фукоиданов, при которых время свертывания плазмы в тестах увеличивается в два раза, гидролизованные образцы эффективнее исходного и контрольных влияли на внутренний путь свертывания. Лучше исходного активность фактора Ха снижал образец 3. Отсутствие связи между эффективными концентрациями фукоиданов и их антитромбиновой активностью по гепарину свидетельствует о разных механизмах влияния этих веществ на внутренний путь свертывающей системы крови. Такая же закономерность отмечена и при определении способности фукоиданов ингибировать амидолитическую активность тромбина и фактора Ха. Различия в эффективных концентрациях фукоиданов в коагулологических (где присутствуют плазменные ингибиторы антитромбин и кофактор гепарина II) и амидолитических (присутствует только антитромбин) тестах свидетельствует о том, что для проявления антикоагулянтной активности фукоиданов из L. saccharina необходим кофактор гепарина II. В заключении данной главы необходимо отметить, что при определении специфической АК активности образцов фукоиданов в коагулологических и амидолитических тестах следует сравнивать действие по эффективным концентрациям, а пе по стандартам гепаринов.
Антикоагулянтная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан
Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [214], в них встраивают функциональные группы, объединяют (коньюгируют) с молекулами других полисахаридов [96]. Структура макромолекулы СП играет важную роль при проявлении АК активности. Так, под действием хитозана, модифицированного аргинином (коньюгат хитозан-аргинин), происходят конформационные изменения молекулы тромбина [180]. Известно, что г Г,0-кватернизировашіьіе и N-ацильные (пропаноил-, гексаноил) производные сульфата хитозана обладают повышенной АК активностью [134]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный (при добавлении HSO3" групп) наблюдали снижение адгезии тромбоцитов и возрастание биосовместимости с кровью, причем эффект положительно коррелировал с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [239].
Нами было проведено исследование величин АК активности in vitro образцов ПИК, компонентами которых служили галактозилированный хитозан, N-сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан в разных весовых сочетаниях.
ПИК в конечных концентрациях от 12,4 до 62,4 мкг/мл удлиняли время свертывания плазмы кроликов в тесте АЧТВ с 14,5±0,2 сек в контроле до 41,2 - 85,0 сек (рис. 1А).
Концентрации ПИК, при которых время свертывания плазмы в тесте АЧТВ удлинялось в два раза (2АЧТВ), составили 7,4 - 41,0 мкг/мл (табл. 1). Индивидуальный сульфат галактоманнана (образец 1) имел для 2АЧТВ концентрацию 9,0±0.6 мкг/мл и антитромбиновую активность 33±5 ЕД/мг. Наименьшие эффективные концентрации (7,4±0,5 и 7,5±0,3 мкг/мл) демонстрировали 3 и 4 образцы с соотношениями А:Бі:В = 1:3,3:1,7 и 1:4:2; alia активности для этих образцов были также максимальны и составили 52,8±3,5 и 51±4 ЕД/мг (табл.1). И только образец 2, в котором отсутствовал компонент В показал эффективную концентрацию в 4,6 раз большую и в 2,5 раза меньшую alia активность, чем образец 1 (индивидуальный сульфат галактоманнана). С увеличением процентной доли Бі антитромбиновая активность образцов возрастала (г = 0,79; р 0,05). Между alia активностью и процентными долями других составляющих комплексов отмечали слабую положительную связь.
ПИК в конечных концентрациях от 1,1 до 8,0 мкг/мл удлиняли время свертывания плазмы кроликов в тесге РеаКлот (определение ингибнторной активности в отношении фактора свертывания крови Ха по образованию фибринового сгустка плазмы) с 18,6±0,3 сек в контроле до 45,7- 56,3 сек (рпс 1Б). Конечные концентрации ПИК, при которых время свертывания плазмы в тесте РеаКлот удлинялось в два раза (2РеаКлот), составили 4,1 — 6,9 мкг/мл (табл. 1). Достоверных различий между концентрациями 2РеаКлот и аХа активностями образцов 3,4,5,6 и 1 (индивидуальный сульфат галактоманнана) не обнаружено. Образец 2 продемонстрировал увеличение концентрации 2РеаКлот в 2 раза и снижение аХа активности в 3 раза в сравнении с образцом 1.
Таким образом, в комплексах ГМ - HSO3 " (СЗ 1,46) с галактозилированным хитозаном (С3=0,10; СД=0,79) - NH3 + и хитозан-сукцинил - СОО " (СЗ - 0,80) с увеличением доли первого от 50% до 67% антитромбиновая активность (рассчитанная по стандарту НФГ) возрастала в 1,6 раза в сравнении с исходным сульфатом галактоманнана. Добавление к ГМ — HSO3 " компонентов А и В не приводило к изменению эффективной концентрации 2РеаКлот с плазмой кроликов или аХа активности (по стандарту НФГ). Кроме этого, отсутствие в комплексах компонента В [хитозан-сукцинил - СОО " (СЗ = 0,8)] приводило как к росту эффективных концентраций 2АЧТВ/2РеаКлот, так и к снижению alia и аХа активностей. Последнее подтверждается литературными данными об АА хитозан-аргинила [180].
ПИК в конечных концентрациях от 1,0 до 18,0 мкг/мл удлиняли время свертывания плазмы человека в тесте АЧТВ, с 33,1±0,5 сек в контроле до 61,2 - 79,3 сек (рис 2А). Концентрации 2АЧТВ для ПИК составили 3,5- 16,5 мкг /мл (табл. 2). Наименьшую концентрацию (9,7±0,8 мкг/мл) демонстрировал образец 11 [компонент Б2-индивидуальный сульфат галактоманнана с С3=0,60, табл 1]. Добавление компонентов А и В приводило к достоверному росту концентраций 2АЧТВ в 1,7 - 1,9 раз и к достоверному снижению alia активности в 2 раза. В интервале процентной доли компонента Бг в комплексах от 48 - 67 % антитромбиновая активность не менялась.
ПИК в конечных концентрациях от 2,7 до 68,0 мкг/мл удлиняли время свертывания плазмы человека в тесте РеаКлот, с 20,5± 0,3 сек в контроле до 48,9- 73,1 сек (рис 2Б). Концентрации 2РеаКлот ПИК составили 18,5 - 44,0 мкг/мл (табл.1). Наименьшие эффективные концентрации (18,5±0,6 и 19,0±1,0 мкг/мл) демонстрировали образцы 11 и 66. В образце 66 доля Бг составила 48% (наименьшая среди исследованных). Эффективные концентрации образцов 33, 44 и 55 превышали исходную в 1,3 - 2,3 раза. Активности против фактора Ха (аХа) для образцов 11-66 совпали. Таким образом, использование в ионных комплексах ГМ - HSO3" (СЗ = 0,6), в сравнении с ГМ - HSO3 " (СЗ = 1,46), приводит к росту концентраций 2АЧТВ/2РеаКлот и к снижению alla/aXa активностей. Известно, что АА полисахаридов возрастает с увеличением СС [214].
Различия в эффективных концентрациях и специфических активностях при измерениях в плазме кроликов и человека для образцов 1 (2АЧТВ: 9,0+0,6 и 3,5+0,4 мкг/мл; 2РеаКлот: 4,5±0,2 и 6,0+0,5 мкг/мл; alia - 33±5 и 48,5±3,2 ЕД/мг; аХа - 11,4±0,3 и 8,9±0,4 ЕД/мг ) и 3 (2АЧТВ: 7,4±0,5 и 5,7±0,4 мкг/мл; 2РеаКлот: 4,1±0,2 и 9,0+0,7 мкг/мл; alia - 52,8±3,5 и 32,9±1,5 ЕД/мг; аХа - 10,8±2,0 и 3,3±0,4 ЕД/мг) можно объяснить видовой специфичностью (для эффективных концентраций) и разной чувствительностью плазмы разных объектов к НФГ, выбранному в качестве стандарта (для специфических активностей). Антикоагулянтная активность образцов 1 и 3, содержащих ГМ - HSO3 " с Бі (СЗ = 1,46), была выше (СС=1,46), чем у образцов, имеющих в своем составе Бг (С3=0,6).
Таким образом, полисахаридные ионные комплексы, состоящие из ГМ - IISO3" (СЗ = 1,46 и 0,6), галактозилированного хитозана (С3=0.10; СД-0.79) — NH3 + и хитозан-сукцшшла - СОО (С3=0,8) в разных весовых сочетаниях демонстрировали антикоагулянтную активность in vitro.
В комплексах ГМ - HSO3" (СЗ 1,46) с галактозилированным хитозаном (С3=0,10; СД-0,79)- NH3 + и хитозан-сукцинилом - СОО-(СЗ = 0,80) с увеличением доли первого до 67% антитромбиновая активность (рассчитанная по стандарту НФГ) возрастала в 1,6 раза в сравнении с чистым сульфатом галактоманнана.
Добавление к ГМ - HSO3" (СЗ 1,46) галактозилированного хитозана (С3=0.10; СД=0,79)-гШз и хитозан-сукцинил — СОО - (СЗ = 0,80) не приводило к изменению эффективной концентрации 2РеаКлот с плазмой кроликов и аХа активности (по стандарту НФГ).
![Фармакологическая активность местных гемостатических средств в эксперименте и у пациентов с наружными посттравматическими кровотечениями на догоспитальном этапе [Электронный ресурс]](/i/i/4298/177943.png "Фармакологическая активность местных гемостатических средств в эксперименте и у пациентов с наружными посттравматическими кровотечениями на догоспитальном этапе [Электронный ресурс] Киреев Александр Николаевич")
![Фармакологическая коррекция функциональной активности нейтрофилов в условиях влияния магнитных полей повышенной напряженности [Электронный ресурс]](/i/i/4406/188443.png "Фармакологическая коррекция функциональной активности нейтрофилов в условиях влияния магнитных полей повышенной напряженности [Электронный ресурс] Разинькова Наталья Сергеевна")
![Влияние растительных сборов с противовоспалительной активностью на процессы свободно-радикального окисления [Электронный ресурс]](/i/i/4506/196564.png "Влияние растительных сборов с противовоспалительной активностью на процессы свободно-радикального окисления [Электронный ресурс] Замятина Светлана Владимировна")
