Высокоэффективная жидкостная хроматография в оценке биотрансформации лекарственных средств (фармакогенетика и фармакокинетика) Раменская Галина Владиславовна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Литературный обзор 13

1.1. Особенности метаболизма лекарственных средств 13

1.1.1. Общие сведения о метаболизме лекарственных средств 13

1.1.2. Генетический полиморфизм ферментов метаболизма 21

1.1.3. Микросомальные ферменты метаболизма лекарственных средств 23

1.1.4. Индукторы и ингибиторы микросомального окисления 29

1.1.5. Подсемейство цитохрома Р-450 CYPIID 32

1.1.6. Подсемейство цитохрома Р-450 CYPIIIA 35

1.2. Методы анализа лекарственных средств и их метаболитов.. 42

Выводы по главе 49

Экспериментальная часть 50

2.1. Материально-техническое обеспечение для ВЭЖХ-анализа лекарственных средств и их метаболитов 50

2.2. Характеристика испытуемых 54

2.3. Схема проведения генотипирования 59

2.4. Тактика фармакокинетического исследования метаболизма лекарственных средств 63

2.5. Процедура проведения MEGX-теста 69

2.6. Расчет фармакокинетических параметров и статистическая обработка полученных результатов 70

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 71

3.1. ВЭЖХ-анализ лекарственных средств и их метаболитов 71

3.1.1. Условия хроматографирования и количественное определение лекарственных средств и их метаболитов в растворах 71

3.1.2. Изолирование и количественное определение лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови 89

3.1.3. Методика ВЭЖХ-анализа для проведения MEGX-теста 105

Выводы по главе 112

3.2. Влияние различных факторов на активность CYP3A4 113

3.2.1. Изучение полиморфных маркеров гена CYP3A4 113

3.2.2. Результаты фенотипирования СYP3А4 114

3.2.3. Определение влияния флуконазола и карбамазепина на активность CYP3A4 116

3.2.4. Влияние флуконазола на фармакокинетику лекарственных средств, метаболизирующихся CYP3A4 123

3.2.5. Влияние времени суток на активность CYP3A4 165

3.2.6. Влияние различных патологических состояний на активность CYP3A4 168

Выводы по главе 173

3.3. Генотипирование и фенотипирование CYP2D6 174

3.3.1. Изучение полиморфных маркеров гена СYP2D6 174

3.3.2. Сопоставление полиморфизма CYP2D6 с фармакокинетикой амитриптилина 176

3.3.3. Сопоставление результатов гено- и фенотипирования CYP2D6 с клинической эффективностью метопролола 184

Выводы по главе 188

3.4. Изучение фармакокинетики метаболитов лекарственных средств в оценке их эффективности 189

Выводы по главе 194

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 195

Общие выводы 236

Практические рекомендации 238

Список литературы 240

Приложение 281

• Микросомальные ферменты метаболизма лекарственных средств
• Тактика фармакокинетического исследования метаболизма лекарственных средств
• Изолирование и количественное определение лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови
• Влияние различных патологических состояний на активность CYP3A4

Введение к работе

Актуальность проблемы. Метаболизм или биотрансформация лекарственных средств (ЛС) - понятие, отражающее химические изменения, которым подвергаются лекарственные вещества в организме. Чаще всего, результатом метаболизма ЛС является, с одной стороны, повышение растворимости в воде (повышение гидрофильности), что способствует их выведению из организма с мочой, а с другой - изменение фармакологической активности ЛС. Изменение фармакологической активности может приводить к образованию из фармакологически активного вещества фармакологически неактивного вещества, фармакологически активное вещество на первом этапе может превращаться в другое фармакологически активное вещество, а неактивные фармакологические ЛС (пролекарства) превращаться в организме в активные соединения [29,228,356].

Интенсивность метаболизма конкретного ЛС зависит как от свойств самого вещества, так и от индивидуальных особенностей организма (скорость печеночного кровотока, активность ферментов и другие) и является основным фактором, определяющим уровень концентрации ЛС в плазме крови и длительность его пребывания в нем [8,12,29]. Таким образом, индивидуализация фармакотерапии, заключающаяся в поддержании концентрации ЛС в пределах терапевтического диапазона, должна включать определение интенсивности процессов биотрансформации данного ЛС у конкретного пациента.

В системе биотрансформации (метаболизма) ксенобиотиков большое значение имеет микросомальная окислительная система цитохрома Р-450, которая насчитывает более 100 различных изоферментов. Чрезмерная активность определенного изофермента будет определять отсутствие эффективности от приема соответствующего ЛС в связи с его быстрым разрушением, а сниженная активность будет вызывать развитие побочных эффек- тов. Активность ферментов генетически детерминирована и может быть оценена непрямым способом на основе анализа структуры ДНК. Однако, не всегда отсутствие или наличие полиморфизма ген, кодирующих выработку фермента, коррелирует с клинической эффективностью ЛС, метабо-лизирующегося данным ферментом. В этом случае определение концентрации ЛС в крови пациента лучше информирует о возможном побочном эффекте или недостаточной эффективности, хотя при этом может и не объяснять причину этого явления [66,72,90].

Таким образом, при индивидуализации фармакотерапии важно проведение как генотипирования, так и фенотипирования. Проведение гено-типирования осуществляется с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и, с одной стороны, имеет ряд плюсов (возможность получения информации путем анализа всего одной пробы, не требует введения фармакологически активного вещества), но, с другой стороны, данный метод позволяет оценивать лишь наследственные изменения функциональной активности фермента без учета влияния эндогенных факторов. Фено-типирование связано с определением концентрации ЛС и его основного метаболита в плазме крови, поэтому для его проведения необходимо иметь высокочувствительный метод их совместного определения в биологических жидкостях. С учетом всех плюсов и минусов различных методов анализа ЛС в биологических жидкостях наибольшее распространение получил метод ВЭЖХ. Все вышесказанное определяет необходимость комплексного подхода к оценке активности системы биотрансформации ЛС и разработке методов ее оценки.

Цель исследования: теоретическое и экспериментальное обоснование принципов методологического подхода к оценке системы биотрансформации лекарственных средств с использованием метода высокоэффек- тивной жидкостной хроматографии для рационального применения лекарственных средств.

Задачи исследования: установить закономерности хроматографического поведения нифеди-пина, верапамила, ловастатина, метопролола, амитриптилина, налтрексона, лидокаина и их метаболитов и разработать оптимизированные по хроматографическим параметрам методики их количественного определения в плазме крови методом ВЭЖХ; изучить фармакокинетику указанных лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови у различных групп пациентов; изучить хроматографическое поведение метаболита лидокаина - MEGX, предложить условия его определения в плазме крови методом ВЭЖХ для проведения MEGX-теста; оценить с помощью MEGX-теста влияние различных факторов (времени суток, совместного приема нескольких лекарственных средств, патологических состояний) на активность CYP3A4; ' подобрать лекарственные средства-маркеры для оценки активности CYP3A4 и CYP2D6 и провести фенотипирование указанных изоферментов; провести генотипирование CYP3A4 и CYP2D6 методом ПЦР у пациентов московской популяции; провести сопоставление результатов фено- и генотипирования CYP3A4 и CYP2D6 с клинической эффективностью лекарственных средств, ме-таболизирующихся данными изоферментами; изучить фармакокинетику налтрексона и его метаболита после введения новой лекарственной формы.

Научная новизна: Определены оптимальные хроматографические условия эффективного разделения нифедипина, верапамила, ловастатина, метопролола, амитриптилина, налтрексона и их основных метаболитов методом ВЭЖХ. Подобраны оптимальные условия выделения исследуемых соединений из плазмы крови. Разработаны методики их количественного определения в плазме крови, отличающиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью.

Показано, что определение динамики концентрации лекарственного средства и его метаболита характеризует индивидуальные особенности их фармакокинетики у конкретного пациента на всех этапах пребывания ЛС в организме.

С помощью MEGX-теста показано влияние времени суток, лекарственных веществ и патологических состояний на активность CYP3A4, что отражается на динамике концентрации лекарственных средств и их метаболитов, метаболизирующихся данным изоферментом.

Изучено распределение полиморфных аллелей ген, кодирующих выработку изоферментов CYP3A4 и CYP2D6 в выборке лиц московской популяции.

Подобраны маркерные препараты для определения активности CYP3A4 и CYP2D6. Проведено сопоставление фенотипирования и генотипирования указанных изоферментов с клинической эффективностью ЛС, метаболизирующихся данными изоферментами.

Впервые изучены временные параметры проявления ингибирующего и индуцирующего влияния флуконазола и карбамазепина на CYP3A4.

На примере изучения налтрексона в новой пролонгированной форме показана возможность использования динамики концентрации метаболита ЛС для контроля за его эффективностью. концентрацией их метаболитов, достоверно информирует о снижении или увеличении активности указанных изоферментов.

На основании использования комплексного подхода к оценке биотрансформации лекарственных средств внесен ряд рекомендаций по проведению исследований по биоэквивалентности лекарственных средств.

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической химии и кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ММА имени И.М.Сеченова, а также на кафедрах фармацевтической химии, экспериментальной и клинической фармакологии медицинских и фармацевтических высших учебных заведений (Дальневосточного государственного медицинского университета, Рязанского государственного медицинского университета, Сибирского государственного медицинского университета и других).

Материалы диссертационного исследования использованы при подготовке: ФСП на «Продетоксон, таблетки для имплантации»; «Методических рекомендаций по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов» МЗ РФ; методических рекомендаций «Изучение метаболизма лидокаина для оценки функции печени в клинике внутренних болезней (MEGX-тест)»; методических рекомендаций «Изучение метаболизма ЛС»; учебных пособий для студентов медицинских вузов «Клиническая фармакология блокаторов медленных кальциевых каналов» и «Клиническая фармакология бета-адреноблокаторов».

Личный вклад соискателя: основная часть исследований выполнена автором лично. Автором лично подобраны условия хроматографическо-го определения концентрации лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови, проведено определение концентрации лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови у различных групп испытуемых, проведен MEGX-тест, а также фенотипирование CYP3A4 и CYP2D6. Автором самостоятельно проведены статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Обследование испытуемых, назначение препаратов и отбор проб крови проводили на базе ГКБ № 23 им."Медсантруд" сотрудники и аспиранты кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ММА имени И.М.Сеченова (завкафедрой проф. Кукес В.Г.): к.м.н. Игонин А.А., к.м.н. Смолярчук Е.А., к.м.н. Кашаева О.В., к.м.н. Андреев Д.А., к.м.н. Сычев Д.А., Бердникова Н.Г., Савченко А.Ю. Работа с пациентами для изучения фармакокинетики новой лекарственной формы налтрексона проводилась к.м.н. Сулимовым Г.Ю. (Федеральный научно-методический центр терапии психических заболеваний МЗ РФ). Генотипи-рование осуществлялось совместно с лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП ТосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (зав.лабораторией, проф. Носиков В.В.; научный сотрудник лаборатории Игнатьев И.В.).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000г., 2001г., 2003г.); совместной научно-практической конференции ПЛ ЛС РАМН, ИКФ НЦ ЭГКЛС МЗ РФ, ГКБ №23 и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ММА имени И.М.Сеченова (Москва 2000г., 2001г., 2002г.); Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2000г.); VII world Conference on clinical Pharmacology and Therapeutics (Italy, Florence, 2000r.); II Российской конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2001г.); 5^th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics (Denmark, Odense, 2001г.); 2-ом Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной темой кафедры фармацевтической химии ММА имени И.М.Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (номер гос. регистрации - 01.200.110545.), а также плановой темой НИР ПЛ ЛС РАМН «Оптимизация фармакотерапии заболеваний внутренних органов посредством разработки рациональных методов контроля клинически значимых параметров фармакокинетики лекарственных средств» (номер гос. регистрации - 01.206.110468).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 327 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследования, их обсуждение, выводы и практические рекомендации. В работе содержится 48 таблиц и 66 рисунков и диаграмм. Список литературы включает 368 источников, из них 312 зарубежной литературы.

Основные положения, выносимые на защиту: методики количественного определения лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови методом ВЭЖХ; методика ВЭЖХ-анализа для проведения MEGX-теста; результаты оценки активности CYP3A4 под влиянием времени суток, лекарственных средств - индукторов и ингибиторов данного изофер-мента и патологических состояний с помощью MEGX-теста; данные фенотипирования и генотипирования CYP3A4 и CYP2D6, и их сопоставление с клинической эффективностью лекарственных средств, метаболизирующихся данными изоферментами; динамика концентрации налтрексона и его метаболита в плазме крови испытуемых после введения новой пролонгированной лекарственной формы.

1.1. Особенности метаболизма лекарственных средств

1.1.1. Общие сведения о метаболизме лекарственных средств

Человек ежедневно подвергается воздействию множества инородных химических веществ, называемых ксенобиотиками. Ксенобиотики попадают в организм человека через легкие, кожу и желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) в составе примесей воздуха, пищи, напитков, лекарственных средств (ЛС). Некоторые ксенобиотики не оказывают никакого воздействия на организм человека, но большинство могут вызывать биологические ответные реакции. Организм реагирует на ЛС, также как и на любой другой ксенобиотик. ЛС становятся объектами различных механизмов воздействия со стороны организма. Это, как правило, приводит к нейтрализации и элиминации (выведению) ЛС. Некоторые, легко растворимые в воде, ЛС элиминируются почками в неизмененном виде, другие предварительно подвергаются воздействию ферментов, изменяющих их химическое строение [98]. Таким образом, метаболизм или биотрансформация- это общее понятие, отражающее химические изменения, которым подвергаются ЛС в организме. Чаще всего результатом метаболизма ЛС является, с одной стороны, снижение растворимости в жирах (снижение липофильности) и повышение растворимости в воде (повышение гидрофильности), а с другой -изменение фармакологической активности ЛС [10,24,29]. Снижение липофильности и повышение гидрофильности ЛС. Небольшое число ЛС способно выводиться почками в неизмененном виде. Чаще всего эти средства представляют собой «малые молекулы» или они способны находиться в ионизированном состоянии при физиологических значениях рН. Большинство ЛС лишены таких физико-химических свойств. Фарма- кологически активные органические молекулы чаще липофильны и остаются неионизированными при физиологических значениях рН. Эти ЛС обычно связаны с белками плазмы, плохо фильтруются в почечных клубочках и одновременно легко реабсорбируются в почечных канальцах.

Система метаболизма или биотрансформации направлена на повышение растворимости молекулы ЛС (повышение гидрофильности), что способствует выведению его из организма с мочой. Иными словами, липо-фильные ЛС превращаются в гидрофильные и, следовательно, более легко выводимые соединения (рисунок 1) [24,29,35,57,357].

ВСАСЫВАНИЕ

МЕТАБОЛИЗМ ЭЛИМИНАЦИЯ

Фаза II Конъюгат ._| Конъюгат _,

Конъюгат -і

Липофильное. _^. Гидрофильное

Рисунок 1. Фазы метаболизма лекарственных средств

Изменение Фармакологической активности ЛС. Изменение фармакологи-ческой активности ЛС в результате метаболизма может проходить по следующим направлениям: фармакологически активное вещество превращается в фармакологиче ски неактивное (это характерно для большинства ЛС); фармакологически активное вещество на первом этапе превращается в другое фармакологически активное вещество (таблица 1) [35]. Неактивные ЛС, превращающиеся в организме в фармакологически ак тивные вещества называют пролекарствами (таблица 2) [29]. Одной из це лей создания пролекарств является улучшение фармакокинетических свойств, что ускоряет и увеличивает их всасывание. Так были разработаны сложные эфиры ампициллина - пивампицин, талампицин и бикампицин, которые, в отличие от ампициллина, практически полностью всасываются при приеме внутрь (98 - 99 %). В печени эти препараты подвергаются гид ролизу под действием ферментов карбоксиэстераз до ампициллина, кото рый и обладает антибактериальной активностью. Еще одним примером яв ляются ингибиторы АПФ, содержащие карбоксильную группу [287]. Так, фармакологически неактивный эналаприл, всасывается при приеме внутрь на 60 % и гидролизуется в печени под влиянием карбоксиэстераз до актив ного эналаприлата. Необходимо отметить, что сам эналаприлат при введе нии внутрь всасывается лишь на 10 %. Целью создания пролекарств явля ется также повышение безопасности ЛС. Например, сулиндак при приеме внутрь не раздражает слизистую желудка, так как не блокирует в ней син тез цитопротекторных простагландинов. Лишь в печени сулиндак гидроли зуется с образованием активного сульфида сулиндака. Еще одна цель соз дания пролекарств - повышение избирательности действия ЛС, что повы шает их эффективность и безопасность. Дофамин используется для усиле ния почечного кровотока при острой почечной недостаточности, однако, он влияет на миокард и сосуды. При этом повышается АД, возникают тахикардия, аритмии. Присоединение к дофамину остатка глутаминовой кислоты привело к созданию препарата глутамил-дофа. Глутамил-дофа гид-ролизуется до дофамина только в почках под влиянием глутамилтранспеп-тидазы и декарбоксилазы L-ароматических аминокислот, и, таким образом, практически не оказывает действие на центральную гемодинамику [12,37,61].

Таблица 1 Лекарственные средства, метаболиты которых сохраняют фармакологическую активность

Таблица 2

Лекарственные средства, являющиеся пролекарствами

Метаболизм большинства ЛС осуществляется в печени. ЛС, метабо-лизирующиеся в печени подразделяют на две подгруппы - препараты с высоким и низким печеночным клиренсом. Для ЛС первой подгруппы характерна высокая степень извлечения (экстракции) из крови, что обусловлено значительной активностью (емкостью) метаболизирующих их ферментных систем. Поскольку эти ЛС быстро и легко метаболизируются в печени, печеночный клиренс их определяется величиной и скоростью кровотока. Емкость ферментных систем для второй подгруппы ЛС относительно невелика, и, в результате, их печеночный клиренс зависит не от скорости печеночного кровотока, а от активности ферментов и степени связывания препаратов с белками крови [37]. При одинаковой емкости ферментных систем препараты значительно связанные с белками (дифенин, хинидин, тол-бутамид) будут иметь низкий клиренс, по сравнению со слабо связанными с белками препаратами (теофиллин, парацетамол). Емкость ферментных систем не является постоянной величиной. Например, она может умень- шаться при увеличении дозы ЛС (вследствие насыщения ферментов), что может привести к увеличению биодоступности препарата [33,37,167,168].

При пероральном приеме большинство ЛС абсорбируются в слизистой оболочке тонкого кишечника и через систему воротной вены поступают в печень, где подвергаются активному метаболизму еще до поступления в системное кровообращение (ЛС с высоким печеночным клиренсом до поступления в системное кровообращение подвергаются метаболизму в печени на 50-80 %). Это явление известно как пресистемная элиминация или эффект первого прохождения - "first-pass effect". В результате, эти ЛС имеют низкую биодоступность при приеме внутрь, при этом их абсорбция может составлять почти 100 %. К препаратам «первого прохождения» относятся: аминазин, альдостерон, ацетилсалициловая кислота, верапамил, гидралазин, изадрин, имипрамин, кортизон, лабетолол, лидокаин, морфин, метопролол, метилтестостерон, метоклопрамид, нортриптилин, окспрено-лол, органические нитраты, пропранолол, резерпин, салициламид, фенацетин, этмозин и другие [256,326,327,362]. Следует отметить, что незначительная биотрансформация ЛС происходит и в других органах (просвете и стенке кишечника, легких, плазме крови и др.). В целом, все эти реакции могут быть отнесены к одной из двух категорий реакций, обозначаемых как фаза метаболизма I и II (рисунок 1) [75,77].

Реакции I фазы (несинтетические реакции). В процессе этих реакций, ЛС переходят в более полярные и более водорастворимые (гидрофильные) соединения, чем исходное вещество, за счет присоединения или освобождения активных функциональных групп (например, -ОН, -NH₂, -SH). Основными реакциями I фазы являются реакции окисления, а из реакций окисления наиболее распространенной является реакция гид-роксилирования - присоединение гидроксильного радикала (-ОН). Таким образом, можно считать, что в I фазу метаболизма происходит «взлом» молекулы ЛС (таблица 3) [24,70]. Катализаторами этих реакций являются ферменты, называемые оксидазами со смешанной функцией. Субстратная специфичность этих ферментов очень низка, поэтому они окисляют различные ЛС. К другим, менее частым реакциям I фазы, относятся процессы восстановления и гидролиза [24,29,273,274]. Реакции II фазы (синтетические реакции). Метаболиты ЛС, образующиеся в результате реакций I фазы, могут быть недостаточно полярными и поэтому не могут выводиться почками. В печени, путем конъюгации с различными эндогенными веществами, они превращаются в гидрофильные соединения (таблица 4) [24,97,121].

Следует отметить, что ЛС в процессе метаболизма может превращаться только за счет реакций I фазы, либо исключительно за счет реакций II фазы. Иногда часть ЛС метаболизируется путем реакций I фазы, а часть путем реакций II фазы. Кроме того, существует возможность последовательного участия реакций I и II фазы [35,37,125,126,147,149,150,161,172, 174, 186, 201,202,211,223,227,234,235,237,261,262,263,292,294,299,301, 302,304,325,331,332,334,339,340,341,349,363,364,365].

Таблица 3

Лекарственные средства - субстраты для реакций I фазы метаболизма

Цитохром Р-450-независимое окисление

Восстановление

Гидролиз

Таблица 4 Лекарственные средства - субстраты для реакций II фазы метаболизма

1.1.2. Генетический полиморфизм ферментов метаболизма

Принято считать, что существует выраженная индивидуальная вариабельность метаболизма ЛС. Одной из важнейших причин существования последней является генетический полиморфизм ферментов метаболизма (кроме того существует полиморфизм рецепторов) [37,42,61,85,90, 151,158,160,184,204,218,251,252,268,308,309,321,355]. Генетический поли- морфизм обусловлен мутациями в генах ферментов, метаболизирующих ЛС. Экспрессия мутантных генов приводит к изменению скорости метаболизма (замедление или ускорение) лекарственных средств. Большинство людей имеют нормальные гены ферментов метаболизма, однако в определенном проценте случаев распространены мутантные гены [169]. Генетический полиморфизм характерен как для ферментов I фазы метаболизма (изоферменты цитохрома Р-450, дигидропиримидин дигидрогеназа, бути-рилхолинэстераза), так и для ферментов II фазы (N-ацетилтрансфераза, тиопурин S-метилтрансфераза) [37,61,95,96,102,103,104,105,109,197,198, 199,206,213,233,238,269,310,350,351,355]. По мутации гена соответствующего гена фермента метаболизма выделяются следующие группы индивидуумов: "экстенсивные" (активные) метаболизаторы (extensive metabolism, ЕМ), имеющие нормальный ген того или иного фермента метаболизма. К активным метаболизаторам принадлежит большинство населения; "медленные" метаболизаторы (poor metabolism, РМ), имеющие мутации гена того или иного фермента метаболизма, которые приводят либо к синтезу «дефектного» фермента, либо к отсутствию синтеза фермента метаболизма, результатом чего является снижение ферментативной активности или даже ее отсутствие. У «медленных» метаболизаторов ЛС накапливается в организме в высоких концентрациях, что приводит к появлению выраженных побочных эффектов, вплоть до интоксикации. В связи с этим для «медленных» метаболизаторов должен быть осуществлен тщательный подбор дозы ЛС (доза должна быть меньшей, чем для активных метаболизаторов); "сверхактивные" или "быстрые" метаболизаторы (ultraextensive metabolism, UM) - лица, имеющие мутации гена того или иного фермента метаболизма, которые приводят к синтезу фермента, который обладает высо- кой метаболизирующей активностью. Следствием этого является недостаточная для достижения терапевтического эффекта концентрация препарата в крови. Для "сверхактивных" метаболизаторов доза ЛС должна быть выше, чем для активных метаболизаторов [37,206,355].

Распространенность "медленных" и "быстрых" метаболизаторов по отдельным ферментам метаболизма в различных популяциях (этнических группах) представлена в таблице 5 [58,59,64,140,176,207,225,241,243,255, 257,285,305,318,319,338,342,355]. "Медленных" и "быстрых" метаболизаторов выявляют по активности фермента метаболизма (фенотипирование ферментов метаболизма)', по идентификации мутантных аллелей, ответственных за изменение скорости метаболизма (генотжирование ферментов метаболизма)', либо путем сочетания методов фенотипирования и генотипирования [72,106,119,127,156, 179,206,209,219,220,226,231,264,281,311,335,336, 337,347,348,355,366].

1.1.3. Микросомальные ферменты метаболизма лекарственных средств

Многие ферменты, метаболизирующие ЛС, располагаются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭПР) печени и других тканей. При изоляции мембран ЭПР путем гомогенизации и фракционирования клетки они преобразуются в везикулы, называемые микросомами. Микросомы сохраняют большинство морфологических и функциональных характеристик интактных мембран ЭПР, включая свойство шероховатости или гладкости поверхности, соответственна у шероховатого (рибосомального) и гладкого (нерибосомального) ЭПР [37]. В то время как шероховатые микросомы в основном связаны с синтезом белка, гладкие - относительно богаты ферментами, ответственными за окислительный метаболизм лекар- ственных средств. В частности, они содержат важный класс ферментов, известный как оксидазы со смешанной функцией, или монооксигеназы [5,6,37,358].

Таблица 5 Распространенность "медленных" и "быстрых" метаболизатров по отдельным ферментам метаболизма в различных популяциях "Быстрые" метабо-лизаторы CYP2C19 "Медленные" мета-болизаторы

Тиопурин S-метилтрансфераза "Медленные" мета-болизаторы

Активность этих ферментов требует присутствия как восстанавливающего агента (НАДФ-Н), так и молекулярного кислорода. При типичной реакции расходуется (восстанавливается) одна молекула кислорода на молекулу субстрата, при этом один кислородный атом включается в продукт реакции, а другой образует молекулу воды [37,81]. В этом окислительно-восстановительном процессе ключевую роль играют два микросо-мальных фермента: флавопротеин НАДФ-Н-цитохром Р-450-редуктаза. Один моль этого фермента содержит по одному молю флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поскольку цитохром С может служить акцептором электрона, этот фермент часто обозначают как НАДФ-цитохром С-редуктазу\ ір^ртГ _% * "~^ ^f гемопротеин или цитохром Р-450 выполняет роль конечной оксидазы. В действительности микросомальная мембрана содержит множество форм этого гемопротеина, и эта множественность возрастает при повторном введении ксенобиотиков. Относительное изобилие цитохрома Р-450, по сравнению с редукіазой печени, делает процесс восстановления гема цитохрома Р-450 лимитирующей стадией в процессе окисления лекарств в печени.

Процесс микросомального окисления лекарств требует участия цитохрома Р-450, цитохрома Р-450-редуктазы, НАДФ-Н и молекулярного кислорода [128,232,233]. Упрощенная схема окислительного цикла представлена на рисунке 2 [24]. Окисленный (Fe³⁺) цитохром Р-450 соединяется с лекарственным субстратом с образованием бинарного комплекса. НАДФ-Н является донором электрона для флавопротеинредуктазы, которая, в свою очередь, восстанавливает окисленный комплекс цитохром Р-450-лекарство. Второй электрон переходит от НАДФ-Н через ту же флавопро-теинредуктазу, которая восстанавливает молекулярный кислород и формирует комплекс "активированный кислород"-цитохром Р-450-субстрат. Этот комплекс переносит "активированный" кислород на лекарственный субстрат с образованием окисленного продукта [24,29,233].

Цитохром Р-450, в литературе часто обозночаемый CYP, представляет собой группу ферментов, которые осуществляют не только метаболизм лекарственных средств и других ксенобиотиков, но и участвуют в синтезе стероидных гормонов, холестерина, желчных кислот, простаноидов (тром-боксана А₂, простациклина 1₂) [230,233,298]. Впервые цитохром Р-450 идентифицировали Klingenberg и Garfmcell в микросомах печени крысы в 1958 году.

Цитохром Р-450 является гемопротеином, то есть он содержит гем. Название цитохрома Р-450 связано с особыми свойствами этого гемопротеина. В восстановленной форме он связывает монооксид углерода с обра- зованием комплекса с максимальным поглощением света при длине волны 450 нм. Это свойство объясняется тем, что в геме цитохрома Р-450 железо связано не только с атомами азота четырех лигандов, образуя порфирино-вое кольцо, но и имеет пятый и шестой лиганд, сверху и снизу кольца гема, представляющие собой, атом азота гистидина и атом серы цистеина, входящих в состав полипептидной цепи белковой части цитохрома Р-450 [24, 233].

Наибольшее количество цитохрома Р-450 находится в гепатоцитах. Однако, цитохром Р-450 обнаруживается и в других органах: кишечнике, почках, легких, надпочечниках, головном мозге, коже, плаценте, миокарде [61,233]. Важнейшим свойством цитохрома Р-450 является способность метаболизировать практически все известные химические соединения [29]. Наиболее важной реакцией при этом является гидроксилирование. Как уже указывалось, цитохромы Р-450 еще называют монооксигеназами, так как они включают один атом кислорода в субстрат, окисляя его, а один в воду, в отличие от диоксигеназ, которые включают оба атома кислорода в субстрат [12].

Цитохром Р-450 имеет множество изоформ - изоферментов, которых на данный момент выделено более 1000. Изоферменты цитохрома Р-450, по классификации Nebert, принято разделять по близости аминокислотного состава на семейства, а последние, в свою очередь, на подсемейства [56,239,240,242]. Изоферменты цитохрома Р-450 с идентичностью аминокислотного состава более 40 % объединены в семейства, которых выделено 17.

Изоферменты цитохрома Р-450 с идентичностью аминокислотного состава более 55 % объединены в подсемейства, которых выделено 39 [356]. Семейства цитохромов Р-450 принято обозначать римскими цифрами, подсемейства - римскими цифрами и латинской буквой [88,239,240].

Изоферменты цитохрома Р-450 - представители различных семейств и подсемейств - отличаются субстратной специфичностью и регуляторами активности (ингибиторы и индукторы) [22,27,78,129,131,132,190,191]. В метаболизме ЛС принимают участие изоферменты семейств I, II и III. Наиболее важными для метаболизма ЛС и хорошо изученными изофермента-ми цитохрома Р-450 являются следующие: 1А1, 1А2, 2А6, 2В6, 2D6, 2С9, 2С19,2Е1, ЗА4 [3,37,84,136,137,138,154,208,278,283].

НАД»*

НАДФ-М (метшоамиимА)

А-ОН [амеятмыИ продукт)

Рисунок 2. Схема функционирования системы оксидаз со смешанной функцией

Каждый изофермент цитохрома Р-450 кодируется определенным геном [8,284]. Гены изоферментов цитохрома Р-450 находятся в разных хромосомах и занимают в них разные локусы. Локализация ген изофер- ментов цитохрома Р-450, участвующих в метаболизме ЛС, представлена в таблице 6 [239,240]. Сейчас известны S3 гена изоферментов цитохрома Р-450 и 24 псевдогена (дефектные гены, экспрессия которых не приводит к образованию функционирующего белка) [34,37].

Таблица 6 Локализация генов изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в метаболизме лекарственных средств

1.1.4. Индукторы и ингибиторы микросомального окисления

Индукция микросомальных ферментов. Под индукцией фермента понимают абсолютное увеличение его количества и активности вследствие воздействия определенного химического агента, в том числе и ЛС. Это сопровождается гипертрофией эндоплазматического ретикулума, в котором локализовано большинство метаболизирующих ферментов [20]. Индукции могут подвергаться как ферменты I фазы метаболизма (изоферменты цитохрома Р-450), так и ферменты II фазы (УДФ-глюкуронилтрансфераза и другие). Вещества, индуцирующие ферменты, не отличаются очевидным структурным сходством, но обладают некоторыми общими признаками: склонны растворяться в жирах, служат субстратами ферментов, которые они индуцируют; у них, как правило, длительный период полуэлиминации из плазмы. Индукция ведет к ускорению метаболизма и, как правило, к снижению фармакологической активности индуктора и совместно с ним вводимых ЛС [24,29,233]. Различные субстраты способны индуцировать изоферменты цитохрома Р-450 с неодинаковыми молекулярной массой, субстратной специфичностью, иммунохимическими и спектральными характеристиками. Кроме того, существуют значимые межиндивидуальные различия в интенсивности индукции ферментов метаболизма. Один и тот же индуктор может повышать активность фермента у различных индивидуумов в 15-100 раз [26,40]. К основным механизмам индукции изоферментов цитохрома Р-450 относятся:

1. непосредственное воздействие молекулы-индуктора на регуляторную область гена, что приводит к индукции фермента. Этот механизм наиболее характерен для аутоидукции, под которой понимается увеличение активности фермента, метаболизирующего ксенобиотик, под действием самого ксенобиотика. Аутоиндукцию рассматривают как адаптивный механизм, выработанный в процессе эволюции, для инактивации ксенобиотиков, в том числе растительного происхождения. Типичными аутоиндук-торами среди ЛС являются барбитураты (индукторы изоферментов цитохрома Р-450 ЗА4, 2С9) [1,43];

2. стабилизация молекулы изофермента вследствие образования комплекса с некоторыми ксенобиотиками (этанол, ацетон). Например, этанол индуцирует цитохром 2Е1 на всех этапах его образования от транскрипции до трансляции. Полагают, что стабилизирующий эффект этанола связан с его способностью активировать систему фосфолирирования в гепатоците через цАМФ. С этим же механизмом связывают процесс индукции цито- хрома 2Е1 при голодании и сахарном диабете. В данном случае в качестве идукторов цитохрома 2Е1 выступают кетоновые тела; 3. индукция изоферментов цитохрома Р-450 1А1, ЗА4, 2В6 опосредована взаимодействием молекулы индуктора со специфическими рецепторами, которые относятся к классу белков - регуляторов транскрипции [24, 29,35,233].

Ингибирование микоосомальных ферментов. Некоторые ЛС могут угнетать активность изоферментов цитохрома Р-450. Причем при снижении активности изоферментов цитохрома Р-450, метаболизирующих ЛС, возможно развитие побочных эффектов, связанных с длительной циркуляцией этих соединений в организме. ЛС ингибируют различные изоферменты цитохрома Р-450 и, поэтому, нарушают метаболизм только тех препаратов, которые превращаются этими изоферментами [29,73,214,236,244,276,306]. К основным механизмам ингибирования изоферментов цитохрома Р-450 относятся: некоторые препараты, обладающие высоким аффинитетом (сродством) к определенным изоферментам (верапамил, нифедипин, исрадипин, хини-дин), ингибируют метаболизм препаратов с более низким аффинитетом к этим изоферментам. Подобный механизм называется конкурентным метаболическим взаимодействием; связывание с геном, регулирующим синтез определенных изоферментов цитохрома Р-450 (циметидин, флуоксетин, омепразол); прямая инактивация изоферментов цитохрома Р-450 (гастоден). Угнетение взаимодействия цитохрома Р-450 с НАДФ-Н-цитохром Р-450 редукта-зой (флавоноиды) [13,24,29,35,146,153].

1.1.5. Подсемейство цитохрома Р-450 CYPIID

Подсемейство цитохрома Р-450 CYPIID включает 1 изофермент -2D6. Цитохром 2D6 представляет собой белок, состоящий из 497 аминокислотных остатков. Ген цитохрома 2D6 находится в 22 хромосоме, локу-се 22ql3.1. Цитохром 2D6 обнаружен, в основном, в печени. Цитохром 2D6 метаболизирует около 20 % всех известных лекарственных средств (таблица 7) [200,203], в том числе нейролептики, антидепрессанты, Р-адреноблокаторы. При этом атом азота субстрата взаимодействует с карбоксильной группой цитохрома 2D6. Для взаимодействия субстрата с ци-тохромом 2D6 расстояние между атомом азота субстрата и атомом кислорода карбоксильной группы должно составлять 5-7 А. Маркерными субстратами, используемыми для фенотипирования цитохрома 2D6 являются дебризохин, декстрометорфан и спартеин [67,69,74,76,159,206].

Цитохром 2D6, в отличие от других изоферментов цитохрома Р-450, не имеет индукторов. Ряд ЛС являются ингибиторами цитохрома 2D6. Наиболее мощным ингибитором цитохрома 2D6 является пароксетин. Совместное применение субстратов цитохрома 2D6 с ингибиторами цитохрома 2D6 приводит к угнетению метаболизма субстратов, следствием чего может быть возникновение побочных эффектов, связанных с применением препаратов - субстратов цитохрома 2D6, вплоть до интоксикации за счет замедления их клиренса [113,165,254].

Для цитохрома 2D6 генетический полиморфизм наиболее характерен [62,99,111,144,192,333]. Еще в 1977 году обратили внимание на различие гипотензивного эффекта у больных артериальной гипертензией, применявших дебризохин, препарат из группы а-адреноблокаторов [156]. Тогда же было сформулировано предположение о различии в скорости метаболизма (гидроксилирования) дебризохина у разных индивидуумов [216]. У "медленных" метаболизаторов дебризохина гипотензивный эффект этого препарата был наиболее выражен. Позднее было показано, что у "медленных" метаболизаторов дебризохина замедлен метаболизм и некоторых других ЛС, в том числе фенацетина, нортриптилина, фенформина, спар-теина, энкаинида, пропранолола, гуаноксана, амитриптилина. У "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6 наблюдается более выраженный р-адреноблокирующий эффект антиаритмика пропафенона [199].

Это связано с тем, что пропафенон метаболизируется до 5-гидроксипропафенона, который и обладает р-адреноблокирующим эффектом. 5-гидроксипропафенон метаболизируется цитохромом 2D6, поэтому у "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6 концентрация 5-гидроксипропафенона будет повышена [200].

Таблица 7

Субстраты и ингибиторы цитохрома 2D6

Дальнейшие генетические исследования показали, что "медленные" метаболизаторы по цитохрому 2D6 являются носителями мутантных аллелей гена цитохрома 2D6. Результатом этих мутаций является отсутствие синтеза цитохрома 2D6 (мутантная аллель CYP2D6*5), синтез дефектного белка не обладающего активностью (мутантные аллели CYP2D6*3A, CYP2D6+4A, CYP2D6UB, CYP2D6*4C, CYP2D64D, CYP2D6UK, CYP2D6UX2, CYP2D6*6A, CYP2D64B, CYP2D6*6C, CYP2D6*7, CYP2D6*8, CYP2D6*!!, CYP2D6*12, CYP2D6*14, CYP2D6*15, CYP2D6*19, CYP2D6*20), или синтез дефектного белка со сниженной активностью (мутантные аллели CYP2D6*9, CYP2D6*10A, CYP2D6*10B, CYP2D6*17, CYP2D6*18, CYP2D6*36) [289]. Все эти мутации наследуются по аутосомному рецессивному типу. 95 % всех "медленных" метаболиза-торов по цитохрому 2D6 являются носителями мутантных аллелей CYP2D6*3A, CYP2D6*4A, CYP2D6*5, остальные мутации играют меньшую роль [289]. Распространенность "медленных" метаболизаторов среди населения колеблется - от 1 % до 20 % (таблица 5) [37,239,240]. "Медленные" метаболизаторы по цитохрому 2D6 для предотвращения побочных эффектов и интоксикации требуют назначения препаратов-субстратов цитохрома 2D6 в меньших дозах. В качестве примера может служить метаболизм трициклического антидепрессанта имипрамина у "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6. Имипрамин сначала подвергается N-деметилированию за счет изофермента цитохрома Р-450 2С19 до активных метаболитов: дезипрамина и нортриптилина. Дезипрамин и нортриптилин, в свою очередь, метаболизируются путем 4-гидроксилирования до неактивных метаболитов с помощью изофермента цитохрома Р-450 2D6. Было показано, что у "медленных" метаболизаторов по изоферменту 2D6 почти всегда отмечаются такие выраженные побочные эффекты, как: гипотензия, седативный эффект, тремор, кардиотоксичность, что было связано с нали- чием высоких концентраций имипрамина, дезипрамина и нортриптилина у этих пациентов [146,355].

У "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6 менее выражен аналитический эффект кодеина. Этот феномен объясняется снижением Одеметилирования кодеина, при котором образуется морфин. Кроме того, имеются данные о том, что у "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6 чаще развиваются некоторые злокачественные новообразования: рак мочевого пузыря, желудка, глотки, легких (в особенности у курильщиков), первичный рак печени [192]. Предполагают, что причиной более частого возникновения рака легкого у курящих "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6, является их неспособность метаболизировать никотин. Кроме "медленных" метаболизаторов по цитохрому 2D6, существуют и "быстрые" метаболизаторы (таблица 5). "Быстрые" метаболизаторы являются носителями мутантных аллелей CYP2D6*2A, CYP2D6*35X2. Эти мутации наследуются по аутосомному рецессивному типу. У "быстрых" метаболизаторов по цитохрому 2D6 при применении препаратов-субстратов цитохрома 2D6 отмечается снижение их терапевтической эффективности, поэтому «быстрым» метаболизаторам требуется назначение препарата в больших дозах [356].

1.1.6. Подсемейство цитохрома Р-450 CYPIIIA

Подсемейство цитохрома Р-450 CYPIIIA включает 4 изофермента: ЗАЗ, ЗА4, ЗА5 и ЗА7. Цитохромы подсемейства ША составляют 30 % всех цитохромов печени и 70 % всех цитохромов стенки ЖКТ. При этом в печени преимущественно локализован цитохром ЗА4, в стенки желудка и кишечника цитохромы ЗАЗ и ЗА5. Цитохром ЗА7 определяется только в плодной печени. Из изоферментов подсемейства IIIA наиболее важную роль в метаболизме ЛС играет изофермент ЗА4 [61,112,133,233,353,354].

Цитохром ЗА4 представляет собой белок, состоящий из 502 аминокислотных остатков. Ген цитохрома ЗА4 находится в 7 хромосоме, локусе 7q22.1. Изофермент ЗА4 метаболизирует около 60 % всех известных ЛС (таблица 8), в том числе, блокаторы медленных кальциевых каналов, мак-ролидные антибиотики [100,134,164,182,188,193,196,222,233,246,247,253, 265,271,272,277,290,320,355,356,361]. Изофермент ЗА4 катализирует реакцию 6-Р-гидроксилирования эндогенных стероидов, в том числе, тестостерона, прогестерона, кортизола. Маркерными субстратами для определения активности цитохрома ЗА4 являются дапсон, эритромицин, нифедипин, лидокаин, тестостерон, кортизол [4,80,87,116,117,120,177,178,221].

Известно несколько лекарственных тестов для оценки активности CYP3A4. Среди них особое место занимает MEGX-mecm, так как определение активности цитохрома ЗА4 по метаболиту лидокаина моноэтилгли-цинксилидиду (MEGX) является наиболее чувствительным и специфичным тестом, кроме того данный тест характеризует функциональное состояние печени при острых и хронических ее заболеваниях, а так же при некоторых других заболеваниях [60,143,180,194,195,217,248,249,250,270, 279,291,295,297,300,316,328,329,343,344,345,368].

Лидокаин относится к веществам со средним уровнем экстракции, поэтому концентрация его метаболита (MEGX) зависит от печеночного кровотока и состояния гепатоцитов [157]. Нарушение печеночного кровотока и патология гепатоцитов приводят к значительному снижению MEGX в плазме. Таким образом, MEGX характеризует метаболическую функцию печени и стадию патологии печени при различных заболеваниях. Например, такие жизнеугрожающие осложнения цирроза печени, как кровотечение из варикозных вен пищевода, печеночная энцефалопатия и спонтан- ный бактериальный перитонит развиваются при исходном уровне MEGX ниже 20 мкг/л. Кроме того, динамика MEGX-теста может отражать асим-птоматическое прогрессирование первичного биллиарного цирроза в то время, когда стандартные биохимические тесты (трансаминазы, щелочная фосфатаза, биллирубин и т.д.) оказываются не чувствительными в данной ситуации. Мониторинг функции печени с помощью MEGX-теста у пациентов, перенесших трансплантацию печени, позволяет заблаговременно определить признаки реакции отторжения. Значение MEGX менее 25 мкг/л в первые 36 часов после операции ассоциируется с высоким риском смертности [68,173,229,293]. При циррозе печени концентрация MEGX коррелирует с прогнозом заболевания [228].

Метаболизм лидокаина протекает в гепатоцитах, где через оксида-тивное N-деэтилирование системой печеночных цитохромов Р-450 ЗА4 образуется моноэтилглицинксилидид (MEGX) (рисунок 3).

СНз-СНз CHj-СНз Cytochrome Р-450

6^і СНз-СНз NADPH+H+02 NADP+H20 CHj—С^

СНз Лидокаин

СНз *-( V- N-C- _„Ч ^н

Другие метаболиты

Рисунок 3. Метаболизм лидокаина

К факторам, влияющим на результаты теста, относятся: пол (у мужчин MEGX образуется более интенсивно, чем у женщин), возраст (с возрастом образование MEGX снижается), сопутствующая терапия ЛС, изменяющими активность цитохрома ЗА4 (ингибиторы и индукторы) [217,250]. ^ - »!»»% ^ **& "> &'_K $ к

На рисунке 4 представлены усредненные значения, отражающие концентрацию MEGX после внутривенной инъекции лидокаина (1 мг/кг) у здоровых испытуемых (п=16) и пациентов с циррозом печени (п=12). У здоровых испытуемых максимальная концентрация MEGX устанавливалась через 15 минут после введения лидокаина, сохранялась до 120 минут после введения и затем начинала снижаться. У пациентов с циррозом печени время достижения максимальной концентрации MEGX существенно увеличилось, при этом концентрация MEGX коррелирует с прогнозом заболевания [248].

На кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им.Сеченова получены данные, показывающие, что значение MEGX менее 30 мкг/л свидетельствует о тяжелом состоянии больных пневмонией, соответствующей критериям сепсиса [30,63]. При этом, увеличение результатов, полученных при динамическом мониторинге за концентрацией MEGX, свыше 40 мкг/л может быть следствием эффективной терапии и улучшения состояния пациентов.

Время, мин

Рисунок 4. Динамика концентрации MEGX после в/в введения лидокаина (1 мг/кг) у здоровых испытуемых (А) и пациентов с циррозом печени (В) і Цитохром ЗА4 является весьма индуцибельным цитохромом. Индук- *. торами цитохрома ЗА4 могут быть разные ЛС (таблица 8), в том числе, глюкокортикостероиды [122,175,185,233]. Индукция цитохрома ЗА4 осуществляется через специализированный ядерный рецептор - «прегнан-Х-рецептор» (PXR) - белок из класса регуляторов транскрипции: индуктор проникает в ядро клетки, соединяется с PXR-рецептором, образованный комплекс связывается со специфическим участком гена цитохрома ЗА4 и стимулирует его экспрессию [118,346,356]. Ингибиторами цитохрома Р-450 являются не только ЛС, но и сок грейпфрута (за счет нирегинина) [65, 91,92,124,166,183,210,258,266,286,296,330,360]. Совместное применение субстратов цитохрома ЗА4 с ингибиторами цитохрома ЗА4 приводит к угнетению метаболизма субстратов, следствием чего может быть возникновение побочных эффектов препаратов - субстратов цитохрома ЗА4, вплоть до интоксикации за счет замедления их клиренса [40,83,89,93,212]. Так, стакан сока грейпфрута замедляет клиренс нифедипина, принятого внутрь, в 2 раза [37]. Причем было показано, что сок грейпфрута ингибирует цитохром ЗА4 преимущественно в энтероцп^ч, так как он не влияет на клиренс препаратов - субстратов цитохрома ЗА4 (нифедипин, фелодипин, ве-рапамил, этинилэстрадиол, циклоспорин А) при их внутривенном введении [210]. Ингибиторами цитохрома ЗА4 являются макролидные антибиотики. Однако, макролиды отличаются по способности ингибировать цитохром ЗА4: сильные ингибиторы цитохрома ЗА4 (1 группа) - эритромицин и тролеандомицин; умеренные ингибиторы цитохрома ЗА4 (2 группа) -кларитромицин; макролиды, не ингибирующие цитохром ЗА4 (3 группа) -азитромицин и диритромицин [37,260]. Например, совместное применение макролидов 1 и 2 группы с антигистаминными препаратами (астемизол и терфенадин) в 10% случаев приводит к кардиотоксичности, проявляющейся удлинением интервала QT [152].

Существует предположение о том, что причиной вариабильности метаболизма цитохрома ЗА4, является нарушение экспрессии факторов транскрипции гена цитохрома ЗА4 [56,114,142,148,163,181,187]. Генетические исследования позволили идентифицировать несколько мутаций в промоторной зоне гена цитохрома ЗА4 (таблица 9) [66,107,108,110,224, 275,280,288,307,352].

Цитохром ЗА5. В последнее время появились данные о существенной роли в метаболизме ЛС другого изофермента подсемейства IIIА цитохрома ЗА5. Цитохром ЗА5 представляет собой белок, состоящий из 502 аминокислотных остатков. По аминокислотной последовательности цитохром ЗА5 идентичен цитохрому ЗА4 на 85%. Ген цитохрома ЗА5 находится в 7 хромосоме, локусе 7q22.1. Доказано, что часть ЛС, традиционно рассматривающихся как субстраты цитохрома ЗА4, также метаболизируется цито-хромом ЗА5. Следует отметить, что индукторы и ингибиторы цитохрома ЗА4 обладают подобным же действием и в отношении цитохрома ЗА5.

Активность цитохрома ЗА5 у различных индивидуумов колеблется более, чем в 30 раз [259]. В последнее время предполагается генетическая основа данного полиморфизма активности. Уже идентифицированы мутации гена цитохрома ЗА5, ответственные за низкую активность цитохрома ЗА5. Это точечные мутации, представляющие собой замену одного нук-леотида другим (single nucleotide polimorphism- полиморфизм одного нук-леотида). Носители этих мутаций синтезируют более короткий и менее активный фермент и, таким образом, являются "медленными" метаболизато-рами [189]. Предполагают, что хорошо известная внутривидовая вариабельность в активности цитохрома ЗА4 обусловлена именно генетическим полиморфизмом цитохрома ЗА5 так как, как указывалось выше, многие субстраты цитохрома ЗА4 также метаболизируются цитохромом ЗА5. Однако, этот вопрос требует дальнейшего изучения [189,259,359,367].

Таблица 8

Субстраты, индукторы и ингибиторы цитохрома ЗА4

Таблица 9 Аллели гена цитохрома ЗА4

1.2. Методы анализа лекарственных средств и их метаболитов

Требования, предъявляемые к методам количественного определения ЛС в биологических жидкостях с учетом специфики анализа отличаются от требований при определении ЛС в субстанциях и лекарственных формах. Используемый метод должен иметь высокую чувствительность, возможность работы с малыми объемами проб, большую специфичность и избирательность, отличаться надежностью и воспроизводимостью, универсальностью (пригодностью для анализа различных ЛС), большой производительностью и возможностью автоматизации процесса анализа.

Основное требование - чувствительность, связанное с небольшими количествами определяемых ЛС в биологических жидкостях. Метод должен быть настолько чувствительным, чтобы он позволял достоверно и точно определять в 10 раз меньшее количество, чем среднее количество вещества, всасывающееся после приема однократной дозы. Вместе с тем, метод должен быть достаточно специфичным, чтобы определять неизменившуюся часть лекарственного вещества в присутствии его метаболитов и эндогенных соединений [2].

Перечисленным требованиям отвечают, в основном, физико-химические методы анализа. Классические химические методы анализа, рекомендованные Государственной Фармакопеей для количественного определения ЛС в лекарственных формах (гравиметрические и титриметри-ческие) из-за низкой чувствительности для этой цели малопригодны. Так, в настоящее время, широко титриметрическим методом пользуются только для определения в плазме крови аскорбиновой кислоты [6,11].

Сравнительно редко используют фотоколориметрию. Этот метод применяют когда нужно определить большие концентрации вещества или сумму веществ. Недостаток использования фотоколориметрических методик заключается в сравнительно невысокой их точности. Сравнительно невысокая чувствительность спектрофотометрических методик (от 1 мкг/мл до 1 мг/мл) также ограничивает применение данного метода. По сравнению с УФ-спектрофотометрией чувствительность флуориметрического анализа значительно выше (около 0,01 мкг/мл). Недостатком метода является необходимость тщательной очистки испытуемых веществ, так как флуоресцировать могут многие вещества, содержащиеся в биологических жидкостях [2, 312]. Перечисленные методы отличаются большей эффективностью, если их применяют в сочетании с хроматографическими методами.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) отличается простотой выполнения. Сочетание с денситометрией позволяет увеличить чувствительность до 10~⁷, а при использовании специальных пластинок для высокоэффектив- ной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) чувствительность достигает КГ⁹.

Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) позволяет определять микрограммовые и нанограммовые количества ЛС. Метод ГЖХ обладает высокой разрешающей способностью, скоростью, точностью, эффективностью, наличием как специфических, так и универсальных детекторов. ГЖХ на капиллярных колонках является единственным методом определения содержания остаточных токсичны^ растворителей в субстанциях и лекарственных формах.

Способность большинства ЛС поглощать в УФ-диапазоне, термолабильность некоторых из них или необходимость получения более летучих производных - все это делает более пригодным для фармакокинетических исследований метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Чувствительность ВЭЖХ определяется используемым прибором (оборудованием, детектором), а также свойствами анализируемого объекта и может достигать 10"⁹. Благодаря большому количеству различных колонок, метод обладает высокой селективностью и разделительной способностью. Это обусловило широкое внедрение метода в практику фармакокинетических исследований, в том числе и для оценки активности изофер-ментов цитохрома Р-450 [49,79,82,141,245,282,303].

Одним из современных методов анализа является хромато-масс-спектрометрия, в котором масс-спектрометр используется как высокочувствительный детектор к газовому хроматографу (ГХ/МС - метод). Основное достоинство - чрезвычайно высокая чувствительнось, достигающая нескольких пикограммов (10"¹²).

В настоящее время активно развивается новый эффективный метод количественного определения - капиллярный электрофорез (КЭФ). КЭФ объединяет различные электрофоретические и хроматографические про- цессы в единый метод разделения, позволяющий за несколько минут провести воспроизводимые разделения с высоким разрешением при чувствительности до атоммольного уровня (10¹⁸). КЭФ прост в обслуживании и легко управляется. Важным фактором при проведении анализа данным методом является поддержание постоянства температуры в системе разделения, так как малейшее ее колебание приводит к резкому изменению времени удерживания веществ вследствие изменения вязкости буфера, рН, сопротивления в капилляре.

Для анализа малых концентраций ЛС и их метаболитов в биологических жидкостях широко применяются иммунохимические методы, которые отличаются высокой чувствительностью, специфичностью, простотой исполнения, позволяют одновременно анализировать большое число проб, не требуют дополнительной или специальной очистки пробы или концентрирования и поэтому очень удобны. В основе этих методов лежит специфическая реакция антител с молекулами определяемого вещества (гапте-ном). С целью детектирования результатов реакции один из компонентов реакции метят специальной меткой. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее детектирования существуют различные виды им-мунохимического анализа (таблица 10) [14,123].

Из перечисленных методов широкое распространение в анализе ЛС в биологических жидкостях получили ИФА и ПФИА.

В иммуноферментных методах для детектирования реакции "антиген - антитело" в качестве метки используют ферменты. Как правило, они представляют собой различные оксидазы, способные окислять специальное химическое вещество - хромогенный субстрат с образованием окрашенных продуктов. Полученная окраска регистрируется визуально и с помощью спектральных методов [14].

Таблица 10Виды иммунохимического анализа

По технике выполнения различают два типа ИФА: гомогенный (все компоненты реакции - антитела, определяемое вещество, меченое определяемое вещество (конъюгат), хромогенный субстрат - находятся в одном агрегатном состоянии - растворе) и гетерогенный (антитело иммобилизуется на каком-либо твердом носителе, например полистерольных планшетах, пробирках, бусах ). В гомогенном ИФА в качестве метки используют ферменты: лизоцим, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа. В гетерогенном методе в качестве метки наиболее часто используют ферменты: пероксидаза, |3-галактозидаза, алколин-фосфатаза, реже - ацетил-холинэстераза, глюкоамилаза и глюкозооксидаза.

Гомогенный ИФА более экспрессный, время проведения анализа занимает от 1 до 30 минут, включая обработку результатов. Предел обнаружения составляет от 10"⁴ до 10^б г/мл. Недостатком гомогенного анализа является достаточно высокий фон.

Гетерогенные методы характеризуются высокой чувствительностью (10 - 10" г/мл), но более длительным временем проведения анализа (от 2 до 4 часов).

Наиболее чувствительным и удобным среди иммунологических методов количественного определения ЛС в биожидкостях является ПФИА. ПФИА - гомогенный метод иммуноанализа, основанный на конкуренции меченного флюоресцеином антигена (трассера) с немеченным антигеном (в исследуемом образце) за связывание со специфическими антителами. Этот метод объединяет конкурентное связывание белков с поляризацией флюоресценции, давая прямое измерение без необходимости процедуры разделения [94,297].

ПФИА имеет ряд преимуществ перед ИФА: большую точность, стабильность метки, меньшую подверженность влиянию температуры и рН среды, а также быстроту и простоту проведения анализа.

Каждый из перечисленных методов количественного определения обладает рядом преимуществ и недостатков, которые и определяют показания к их применению (таблица 11). В каждом случае выбор зависит от целей и задач исследования.

С учетом всех (+) и (-), а также целей исследования и доступности вспомогательных материалов и реактивов в настоящее время для изучения фармакокинетики ЛС и их метаболитов наибольшее распространение получил метод ВЭЖХ [31,38,44,130,139,215,322].

Таблица 11

Преимущества и недостатки описываемых методов

Выводы по главе.

На метаболизм лекарственных средств, а следовательно и концентрацию их в плазме крови, оказывают влияние различные факторы, среди которых важное место занимают: генетический полиморфизм ферментов метаболизма, функциональное состояние печени, взаимодействие ЛС.

В свете новых знаний о влиянии генетического полиморфизма ферментов метаболизма, а также других факторов на фармакологические эффекты ЛС все большее значение при оптимизации фармакотерапии приобретают различные методы оценки функционального состояния ферментов метаболизма у конкретного пациента. Среди них выделяют метод генотипирования, способный определять генетически детерминированную активность ферментов исходя из структуры ДНК (с использованием ПЦР), и метод фенотипирования, оценивающий активность ферментов при помощи лекарственных тестов (с использованием различных физико-химических методов анализа ЛС, основным из которых является ВЭЖХ).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Микросомальные ферменты метаболизма лекарственных средств

Активность этих ферментов требует присутствия как восстанавливающего агента (НАДФ-Н), так и молекулярного кислорода. При типичной реакции расходуется (восстанавливается) одна молекула кислорода на молекулу субстрата, при этом один кислородный атом включается в продукт реакции, а другой образует молекулу воды [37,81]. В этом окислительно-восстановительном процессе ключевую роль играют два микросо-мальных фермента: флавопротеин НАДФ-Н-цитохром Р-450-редуктаза. Один моль этого фермента содержит по одному молю флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поскольку цитохром С может служить акцептором электрона, этот фермент часто обозначают как НАДФ-цитохром С-редуктазу\ гемопротеин или цитохром Р-450 выполняет роль конечной оксидазы. В действительности микросомальная мембрана содержит множество форм этого гемопротеина, и эта множественность возрастает при повторном введении ксенобиотиков. Относительное изобилие цитохрома Р-450, по сравнению с редукіазой печени, делает процесс восстановления гема цитохрома Р-450 лимитирующей стадией в процессе окисления лекарств в печени.

Процесс микросомального окисления лекарств требует участия цитохрома Р-450, цитохрома Р-450-редуктазы, НАДФ-Н и молекулярного кислорода [128,232,233]. Упрощенная схема окислительного цикла представлена на рисунке 2 [24]. Окисленный (Fe3+) цитохром Р-450 соединяется с лекарственным субстратом с образованием бинарного комплекса. НАДФ-Н является донором электрона для флавопротеинредуктазы, которая, в свою очередь, восстанавливает окисленный комплекс цитохром Р-450-лекарство. Второй электрон переходит от НАДФ-Н через ту же флавопро-теинредуктазу, которая восстанавливает молекулярный кислород и формирует комплекс "активированный кислород"-цитохром Р-450-субстрат. Этот комплекс переносит "активированный" кислород на лекарственный субстрат с образованием окисленного продукта [24,29,233].

Цитохром Р-450, в литературе часто обозночаемый CYP, представляет собой группу ферментов, которые осуществляют не только метаболизм лекарственных средств и других ксенобиотиков, но и участвуют в синтезе стероидных гормонов, холестерина, желчных кислот, простаноидов (тром-боксана А2, простациклина 12) [230,233,298]. Впервые цитохром Р-450 идентифицировали Klingenberg и Garfmcell в микросомах печени крысы в 1958 году.

Цитохром Р-450 является гемопротеином, то есть он содержит гем. Название цитохрома Р-450 связано с особыми свойствами этого гемопротеина. В восстановленной форме он связывает монооксид углерода с образованием комплекса с максимальным поглощением света при длине волны 450 нм. Это свойство объясняется тем, что в геме цитохрома Р-450 железо связано не только с атомами азота четырех лигандов, образуя порфирино-вое кольцо, но и имеет пятый и шестой лиганд, сверху и снизу кольца гема, представляющие собой, атом азота гистидина и атом серы цистеина, входящих в состав полипептидной цепи белковой части цитохрома Р-450 [24, 233].

Наибольшее количество цитохрома Р-450 находится в гепатоцитах. Однако, цитохром Р-450 обнаруживается и в других органах: кишечнике, почках, легких, надпочечниках, головном мозге, коже, плаценте, миокарде [61,233]. Важнейшим свойством цитохрома Р-450 является способность метаболизировать практически все известные химические соединения [29]. Наиболее важной реакцией при этом является гидроксилирование. Как уже указывалось, цитохромы Р-450 еще называют монооксигеназами, так как они включают один атом кислорода в субстрат, окисляя его, а один в воду, в отличие от диоксигеназ, которые включают оба атома кислорода в субстрат [12].

Цитохром Р-450 имеет множество изоформ - изоферментов, которых на данный момент выделено более 1000. Изоферменты цитохрома Р-450, по классификации Nebert, принято разделять по близости аминокислотного состава на семейства, а последние, в свою очередь, на подсемейства [56,239,240,242]. Изоферменты цитохрома Р-450 с идентичностью аминокислотного состава более 40 % объединены в семейства, которых выделено 17.

Изоферменты цитохрома Р-450 с идентичностью аминокислотного состава более 55 % объединены в подсемейства, которых выделено 39 [356]. Семейства цитохромов Р-450 принято обозначать римскими цифрами, подсемейства - римскими цифрами и латинской буквой [88,239,240].

Изоферменты цитохрома Р-450 - представители различных семейств и подсемейств - отличаются субстратной специфичностью и регуляторами активности (ингибиторы и индукторы) [22,27,78,129,131,132,190,191]. В метаболизме ЛС принимают участие изоферменты семейств I, II и III. Наиболее важными для метаболизма ЛС и хорошо изученными изофермента-ми цитохрома Р-450 являются следующие: 1А1, 1А2, 2А6, 2В6, 2D6, 2С9, 2С19,2Е1, ЗА4 [3,37,84,136,137,138,154,208,278,283].

Тактика фармакокинетического исследования метаболизма лекарственных средств

Фенотипирование CYP3A4 Фенотипирование изофермента Р-450 ЗА4 проводили на пациентах, участвующих в генотипировании CYP3A4, используя в качестве маркерного препарата нифедипин (фирмы «Polfa», Польша). Прием препарата осуществлялся в 900. Забор проб крови проводили через кубитальный катетер до и через 0.33, 0.67, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6,9 часов после однократного перораль-ного приема 10 мг нифедипина. Пробы центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, плазму крови переносили в пластиковые пробирки и замораживали при -35С до анализа. Концентрацию нифедипина и его метаболита определяли методом ВЭЖХ (раздел 3.1). Все операции по отбору проб и их анализу проводили в затемненном помещении (в связи с разложением нифедипина на свету).

Изучение влияния флуконазола и карбамазепина на активность CYP ЗА4 Определение степени ингибирования CYP3A4 флуконазолом и степени индуцирования CYP3A4 карбамазепином проводили на 30 испытуемых, которые методом рандомизации были разделены на три группы: 1 группа (10 человек) - принимали в течение 5 дней флуконазол (150 мг в день, препарат Дифлюкан фирмы «Pfizer», Франция); 2 группа (10 человек) - принимали в течение 5 дней карбамазепин (100 мг в день, препарат Карбамазепин Никомед «Nycomed», Дания); 3 группа (10 человек), контрольная - не принимали указанных лекарственных средств. Группы были сопоставимы по возрасту, антропометрическим данным и клиническому состоянию. В 1 -й день исследования перед первым приемом проводили исходный MEGX-тест (раздел 2.5). Затем MEGX-тест проводили ежедневно в 800 (перед приемом очередной дозы лекарственного средства для 1 и 2 групп). После отмены флуконазола и карбамазепина продолжали проводить MEGX-тест до достижения исходных значений MEGX.

Изучение влияния флуконазола на фармакокинетику лекарственных средств, метаболизирующихся CYP3A4 Для изучения влияния флуконазола на фармакокинетику лекарственных средств, метаболизирующихся с помощью CYP3A4 было взято три выборки пациентов, получавших по показаниям изучаемые лекарственные средства: н - для изучения влияния флуконазола на фармакокинетику нифедипина; в - на фармакокинетику верапамила; л - на фармакокинетику ловастатина. Каждая выборка состояла их двух групп: I группа - пациенты с грибковым поражением слизистой (вагинальный кандидоз); II группа -пациенты без грибковых поражений. Таким образом, были сформированы следующие группы: 1н и Ин; 1в и Ив; 1л и Пл.

Исследование начинали в 700. Всем пациентом проводили MEGX-тест (раздел 2.5). В 800 у пациентов отбирали пробу крови и затем пациенты получали соответствующий лекарственный препарат: пациенты 1н и Нн групп получали 10 мг нифедипина (Нифедипин фирмы «Polfa», Польша); пациенты 1в и Ив групп получали 240 мг верапамила (Изоптин SR 240 фирмы «Knoll», Германия); пациенты 1л и Ил групп получали 80 мг ловастатина (Мевакор фирмы «MSD», Нидерланды). После приема препарата производили отбор проб крови через определенные промежутки времени: для нифедипина - через 0.33, 0.67, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6 и 9 часов после приема, для верапамила - через 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 часа после приема, для ловастатина - через 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 часов после приема. Далее пациенты в течение 7 дней получали лечение в виде нифедипина 10 мг 3 раза в сутки, верапамила 240 мг 1 раз в сутки или ловастатина 80 мг 1 раз в сутки соответственно.

На седьмой день перед приемом очередной дозы соответствующего препарата проводили отбор пробы крови для определения минимальной равновесной концентрации (Css тіп7дн) нифедипина, верапамила и ловастатина соответственно, а также MEGX-тест. Далее, после принятия очередной дозы препарата, отбирали еще одну пробу крови через 1,5 часа для нифедипина, 4 часа для верапамила и ловастатина для определения максимальной равновесной концентрации (Css тах7дн) каждого лекарственного средства соответственно. Затем пациентам Ін, 1в и 1л групп был назначен флуконазол в дозе 150 мг ежедневно (Дифлюкан фирмы «Pfizer», Франция), который они получали в течение 7 дней одновременно с нифедипи-ном, верапамилом или ловастатином в прежней дозировке. Пациенты Пн, Ив и Ил групп не получали флуконазол, а продолжали прием нифедипина, верапамила и ловастатина по прежней схеме.

Через 7 дней (на 14-й день всего исследования) у всех пациентов были определены Css тіп14дн и Css тах4дн нифедипина, верапамила и ловастатина по схеме аналогичной 7-му дню, а также проведен MEGX-тест. Утренний прием препаратов осуществлялся не менее, чем через 12 часов после последнего приема пищи, а завтрак испытуемые получали через 3 часа после приема препарата. Регулярно оценивалось общее состояние больных.

Все пробы крови для определения концентрации нифедипина, верапамила, ловастатина и их метаболитов отбирали в гепаринизированные центрифужные пробирки в объеме 5-7 мл и центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Плазму переносили в пластиковые пробирки, замораживали и хранили до анализа при температуре -35С. В связи с чувствительностью нифедипина к свету все процедуры отбора проб и их обработки проводили в затемненном помещении. Концентрацию изучаемых лекарственных средств и их метаболитов определяли методом ВЭЖХ (раздел 3.1).

Изучение влияния времени суток на активность CYP3A4 Исследование проводили на 18 испытуемых. В 800 натощак испытуемым проводили MEGX-тест (раздел 2.5). Через сутки MEGX-тест повторяли в 20 . Вечером тест проводили через 6 часов после последнего приема пищи.

Изучение влияния патологических состояний на активность CYP3A4 Пациентам с ХСН (11 человек) перед началом исследования проводили MEGX-тест (раздел 2.5) Затем пациентам была назначена традиционная терапия, включающая петлевые диуретики. Через 7 дней лечения констатировали улучшение состояния и уменьшение отеков. После уменьшения отеков (на 7 день лечения) повторно проводили MEGX-тест.

10 пациентам с тяжелым приступом бронхиальной астмы проводили MEGX-тест (раздел 2.5). В процессе проводимой терапии после улучшения и стабилизации состояния также проводили MEGX-тест (на 7 сутки лечения).

Изолирование и количественное определение лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови

При подборе условий изолирования определяемых соединений из плазмы крови нами были использованы различные значения рН при которых осуществляли изолирование, а также органические экстрагенты (гексан, этилацетат, диэтиловый эфир, хлороформ, дихлорметан и другие). Кроме жидкостной экстракции мы использовали твердо-фазную экстракцию на патронах Oasis МАХ и Sep-Pak С18, фирмы «Waters». После серии испытаний нами были признаны оптимальными следующие условия экстракции.

К 1 мл плазмы добавляли 200 мкл 1М NaOH и 4 мл смеси хлороформ-гексан (3:7). Смесь экстрагировали в завинчивающихся пробирках 10 минут. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 минут при 3000 об/мин). Пробы замораживали в течение 15 минут при -35С, затем органическую фазу количественно переносили в конические колбы и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37С. Сухой остаток растворяли в 120 мкл подвижной фазы. Аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа. Верапамил и его метаболит.

К 1 мл плазмы добавляли 100 мкл 2М NaOH и 5 мл гептана. После экстрагирования в течение 10 минут пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин, затем органический слой количественно переносили в чистые пробирки, добавляли 130 мкл 10% H2SO4, встряхивали на vortex в течение 1 минуты, центрифугировали 4 минуты при 3000 об/мин и аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

Выделение ловастатина и его метаболита из плазмы крови проводили методом твердо-фазной экстракции с помощью патронов Sep-Pak С18, фирмы «Waters». Перед анализом патроны промывали 1 мл метанола и 1 мл фосфатного буфера рН 7,2. Затем к 1 мл плазмы добавляли 1 мл фосфатного буфера рН 7,2. Смесь пропускали через патроны, которые затем дважды промывали по 1 мл фосфатного буфера и дважды по 1 мл смеси метанол/фосфатный буфер рН 7,2 в соотношении 20:80. Далее пропускали 250 мкл элюента и 100 мкл наносили на колонку хроматографа. Метопролол и его метаболит.

К 1 мл плазмы добавляли 150 мкл 1М NaOH и 5 мл смеси диэтиловый эфир : хлороформ (4:1). После экстрагирования в течение 10 минут пробы центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин, затем органический слой количественно переносили в чистые пробирки, добавляли 150 мкл 10% H2SO4, встряхивали на vortex в течение 1 минуты и аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа. Амитриптилин.

К 2 мл плазмы добавляли 2 мл 1 М NaOH, перемешивали на vortex 5 секунд. Затем добавляли 5 мл смеси гексан : изоамиловый спирт (99:1), экстрагировали в течение 10 минут и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Органический слой переносили в чистые пробирки, добавляли 200 мкл 0,05 % о-фосфорной кислоты, встряхивали на vortex 2 минуты, центрифугировали 2 мин при 3000 об/мин. Аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа. Налтрексон и его метаболит.

Выделение налтрексона и его метаболита из плазмы крови проводили методом твердо-фазной экстракции с помощью патронов Oasis МАХ, фирмы «Waters». Перед анализом патроны промывали 1 мл метанола и 1 мл дистиллированной воды. Затем 1 мл плазмы пропускали через патроны, которые затем промывали 1 мл 5 % раствора метанола в 2 % NH4OH и 1 мл 20 % раствора метанола в 2 % NH4OH. Далее пропускали 500 мкл 25 % раствора метанола в 2 % СН3СООН, который собирали в колбы для упаривания, нагревали 45 минут при 70С и аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

На рисунках 18-23 представлены образцы хроматограмм определяемых соединений в плазме крови. В таблице 17 указаны характеристики определения изучаемых соединений в плазме крови. Эффективность экстракции определяли по отношению площади (высоты) пика определяемого вещества в плазме крови к площади (высоте) пика данного вещества в стандартном растворе. Предел детектирования устанавливали как минимальное количество обнаруживаемое на хроматограмме, предел определения - как количество вещества, площадь пика которого в пять раз превышала уровень "шумов" (базовой линии). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по площади (высоте) пиков. С этой целью к "чистой" плазме добавляли стандартные растворы (Г) лекарственного средства и его метаболита в количествах, соответствующих калибровочному диапазону, встряхивали на vortex 5 секунд и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Далее проводили процедуру экстракции как описано выше.

Влияние различных патологических состояний на активность CYP3A4

Проведение любых фармакокинетических исследований начинается с разработки метода анализа лекарственного средства в исследуемой биологической жидкости. Это достаточно сложная задача, так как помимо того, что определяемые концентрации, как правило, очень малы, в пробе присутствуют эндогенные соединения, мешающие определению. Поэтому, хотя на многие соединения есть методики анализа, описанные в соответствующих нормативных документах на лекарственное средство, для анализа данного средства в биологических жидкостях они не подходят. Некоторые методики анализа публикуются в журнальных статьях и других изданиях. В этом случае аналитику, чаще всего, приходится сталкиваться с отсутствием описанной аппаратуры, реактивов или иногда плохой воспроизводимостью результатов, а также высокой себестоимостью анализа.

Одной из задач нашего исследования являлась разработка методик анализа лекарственных средств и их метаболитов с помощью наиболее распространенного для данных целей метода ВЭЖХ, которые могли бы быть легко воспроизводимы, доступны для проведения в лабораториях научно-исследовательских институтов и клиниках, занимающихся фармакокинетическими анализами. Обоснованием выбора метода анализа послужило его широкое распространение в фармакокинетических исследованиях, обусловленное сочетанием таких характеристик, как высокая чувствительность, селективность и универсальность [44,79]. Метод ВЭЖХ включен в виде общих статей или их разделов в Фармакопею США, Британскую Фармакопею, Международную Фармакопею, Государственную Фармакопею СССР IX издания [11,324].

Разработанные нами методики количественного определения нифедипина, верапамила, ловастатина, метопролола, амитриптилина, налтрексона и их основных метаболитов в плазме крови были охарактеризованы в соответствии с общепринятыми требованиями к валида-ции методов количественного определения. Нами определялись такие параметры, как селективность и специфичность метода, линейность и стабильность результатов и другие. Хроматопрафические характеристики рассчитывали в соответствии с рекомендациями USP24.

Следует отметить, что некоторые метаболиты могут встречаться как примеси в лекарственном средстве. Так, например, определяемый нами метаболит - димеїил 2,6-диметил-4-(2-нитрофенил)пиридин-3,5-дикарбоксилат является нормируемой примесью в нифедипине. Для его определения в Британской фармакопее 2001 используется метод ВЭЖХ, но с другими хроматографическими условиями. Поэтому разработанные нами методики могут быть рекомендованы и для оценки качества изучаемых лекарственных средств по показателям «подлинность», «содержание примесей», «количественное определение», «однородность дозирования», «растворение».

С этой целью сначала нами было изучено хроматографическое поведение изучаемых соединений в водно-органических растворах и рассчитаны метрологические характеристики количественного определения анализируемых лекарственных средств и их метаболитов в растворах, а затем разработаны методики их определения в плазме крови, поскольку эффективность экстракции препарата из биологических жидкостей и подбор условий разделения на хроматографической колонке проводятся в сравнении с анализом стандартных растворов определяемых веществ.

Разработка методики количественного определения любого лекарственного средства методом ВЭЖХ включает в себя: - выбор типа детектора и условий детектирования; - подбор хроматографической колонки и условий разделения на ней; - выбор метода количественного анализа. Спектрофотометрические детекторы, получившие наиболее широкое распространение, позволяют с высокой чувствительностью обнаруживать вещества, поглощающие свет в области от 190 до 600 нм, и обладают достаточной стабильностью по отношению к изменениям скорости потока элюента и температуры. Широкий диапазон измерений даёт возможность определять как большие, так и следовые количества препаратов. УФ-спектрофотометрические детекторы позволяют проводить измерения либо в максимуме полосы поглощения, либо при длине волны, обеспечивающей максимальную селективность. В нашей работе мы использовали УФ-спектрофотометрический детектор с переменной длиной волны Gilson. Для повышения предела обнаружения, в случаях когда концентрация лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови менее 10 нг/мл или вещество плохо поглощает в УФ-свете, необходимо использование флюориметрического типа детектора, который, в связи с вышесказанным, был выбран нами для определения метопролола, вера-памила и их метаболитов. В работе использовали флюориметрический детектор «Shimadzu» [11,49].

Похожие диссертации на Высокоэффективная жидкостная хроматография в оценке биотрансформации лекарственных средств (фармакогенетика и фармакокинетика)

Разработка экспресс-метода фармакологической и токсикологической оценки индивидуальных лекарственных средств и комплексных препаратов (составов) на одноклеточном организме Paramecium caudatumДассайе, Чандрадутт Радж

Совершенствование методов стандартизации и оценки качества лекарственных средств группы нестероидных противовоспалительных средств (на примере диклофенака натрия)Карманова Татьяна Михайловна

Сравнительный анализ методических подходов к оценке биодоступности лекарственных средств (на примере фторхинолонов и бифоназола)Иветт, Камаль Захер Салиб

Сравнительная оценка методов контроля качества лекарственных средств - блокаторов h2-гистаминовых рецепторовСтепанова Елена Викторовна

Оценка эквивалентности in vitro воспроизведенных нестероидных противовоспалительных средств II класса биофармацевтической классификационной системыКулинич Юлия Игоревна

Разработка флуориметрических методик оценки качества кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в лекарственных средствахТаубэ, Александра Альбертовна

Разработка стандартного образца полисахаридного состава для оценки качества липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевиц и лекарственных средств на их основеКриштанова Надежда Александровна

Разработка флуориметричеcких методик оценки качества кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в субстанциях и лекарственных средствахТаубэ Александра Альбертовна

Количественная оценка лекарственных препаратов производных хинуклидина методом экстракционного титрованияЭвич, Нина Ивановна

Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]Коновалов Андрей Александрович