Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в области синтеза лекарственных веществ, растения остаются важным источником для получения медицинских препаратов. Более 1/3, применяемых в современной медицине лекарственных препаратов, вырабатывается из растительного сырья. В последние годы значительно возросла популярность фитотерапии в связи с такими преимуществами как низкая частота побочных эффектов, малая токсичность, высокая эффективность, доступность и др. В связи с этим возникает вопрос о расширении растительной лекарственной сырьевой базы для производства фитопрепапратов и введения в медицинскую практику тех источников биологически активных веществ, которые относятся к определенным частям растений, на сегодня неизученных и неиспользуемых в медицинской практике.
Первоцвет лекарственный с давних пор находит широкое применение в народной и практической медицине в виде отваров и настоев. Первоцвет входит в состав комбинированных препаратов: примотуссин, экспектизат, мелрозум, синупрет, гербион, пекторал и др. Однако, химический состав первоцвета изучен недостаточно и не решен вопрос относительно более эффективного сырья – листья, или корневища с корнями. По мнению одних авторов корневище с корнями первоцвета содержат сапонины, гликозиды, примверин и примулаверин, витамины С, каротин. В цветках - сапонины, флавоноиды. По мнению других авторов в первоцвете содержится аскорбиновая кислота, каротин, сапонины; в подземных органах – сапонины, флавоноиды, каротиноиды, эфирное масло.
Недостаточная изученность химического состава не позволяет окончательно решить вопрос, что более рационально использовать в качестве сырья – листья или корневища с корнями. Одни страны используют в качестве сырья листья, другие - корневища с корнями.
Центр стандартизации лекарственных средств ФГУ НЦЭ СМП обратился к нам с просьбой разработать нормативный документ на листья первоцвета. Для решения этого вопроса необходимо провести исследование химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета.
Все изложенное выше позволяет заключить, что сравнительное исследование химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета является актуальной проблемой.
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета, разработка методов контроля качества и стандартизации основных действующих веществ с использованием физических, химических и физико-химических методов анализа.
Постановка задач и выбор средств для их решения
Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить литературу по фармакогностическим признакам, фармакологии, химическому составу, методам анализа основных действующих веществ листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета.
2. Исследовать качественный и количественный состав углеводов в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета.
3. Исследовать качественный и количественный аминокислотный состав первоцвета.
4. Разработать методики идентификации и количественного определения дубильных веществ в изучаемом сырье
5. Подобрать условия и разработать методики идентификации и количественного определения флавоноидов и изучить содержание их в сырье первоцвета.
6. Разработать методики качественного и количественного определения сапонинов и изучить сравнительное их содержание в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета.
7. Определить количество аскорбиновой кислоты в сырье первоцвета.
8. Исследовать анатомо-диагностические признаки цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета.
9. Разработать показатели качества корневищ с корнями и травы первоцвета с целью создания нормативной документации
Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведением экспериментальных исследований.
Научная новизна результатов исследования. Впервые с помощью метода ВЭЖХ из цветков и листьев первоцвета выделено 9 флавоноидных соединений, с помощью масс спектрометрии установлено их химическое строение:
4 флавоноида производных кверцетина:
1). - Кверцетин– 3 – О – – D – глюкопиранозид 3 – О – – D – глюкопиранозид кверцетина; 2). – Кверцетин – 3 – О – – L – маннопиранозил – (1 6) - – D – глюкопиранозид; 3). - Кверцетин – 3 – О – – L – маннопиранозил – (1 6) - маннопиранозил - (1-6) - – D – глюкопиранозид; 4). - Кверцетин – 3 – О – {6 – О - [3 – (2,4 - диметоксифенил) – 2 - бутеноил] - – L – маннопиранозил – (1 6) - – D – глюкопиранозид}
5 флавоноидных слединений производных кемпферола:
1).– Кемпферол – 3 – О – – D – глюкопиранозид, 3 О – – D – глюкопиранозид кемпферола; 2). – Кемпферол – 3 – О – – L – маннопиранозил – (1 6) – – D– глюкопиранозид; 3).– Кемпферол – 3– О– – L– рамнопиранозил– (1 6) – – D– глюкопиранозид; 4).– Кемпферол– 3– О– – L– маннопиранозил– (1 6) – – L – маннопиранозил – (1 6) – – D – глюкопиранозид; 5). – Кемпферол – 3 – О – {6 – О – [3 – (4 – (2 – гидроксиэтокси) – 3 – метоксифенил) – 2 – пропеноил] – – L – рамнопиранозил – (1 6) – – D – глюкопиранозид}
В листьях содержатся все 9 флавоноидных соединений, в цветках 5 флавоноидных соединений. В корневищах с корнями первоцвета флавоноидные соединения отсутствуют.
Методом ВЭЖХ установлено, что свободные сахара содержатся только в цветках и представлены фруктозой, глюкозой и сахарозой. Общая сумма их составляет 9,24 % в расчете на абсолютно сухое сырье. Связанные сахара представлены арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой. В корневищах с корнями связанных сахаров - 8,5 %, в цветках – 6,5 %, в листьях – 4,0 % в расчете на абсолютно сухое сырье.
С помощью аминокислотного анализатора в листьях и корневищах с корнями первоцвета установлено содержание 19 аминокислот одинакового состава. В цветках содержится 18 аминокислот того же состава, что и в листьях, но при этом отсутствует цистеин.
Методом спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом определено количественное содержание флавоноидов в сырье первоцвета. Установлено суммарное содержание флавоноидов в цветках- 4,15– 4,67 %, в листьях- 1,02 – 1,57 %, в корневищах с корнями флавоноиды отсутствуют.
С использованием спектрофотометрического и хроматографического методов анализа определены факторы оптимизации процесса экстракции сапонинов из сырья первоцвета, обоснованы способов очистки извлечений, особенности протекания реакции эсцина и сапонинов с кислотой серной концентрированной, разработана методика количественного определения сапонинов в цветках, листьях и корневищах с корнями. С помощью разработанной методики определено содержание сапонинов в цветках 1,14– 1,74 %, в листьях 2,39– 3,68 %, в корневищах с корнями 8,96 – 16,52 %.
Исходя из особенностей поведения аскорбиновой кислоты количественное определение её проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе высокого давления, укомплектованного системой градиентной подачи элюента с компьютерной системой сбора и обработки данных при условиях:
- колонка 250*4,6 мм, сорбент Kromosil 100 -5C18 c размером частиц 5 мкм; - температура термостата 38 0С; - длина волны 280 нм; - подвижная фаза: ацетонитрил (А)/ 0,01 % раствор фосфорной кислоты (В); - режим элюирования: скорость элюирования 1 мкл/мин; время регистрации 5 мин.
Установлено содержание аскорбиновой кислоты в цветках 26,4-60,5 мг/%, в листьях 21,9-40,1 мг/%. В корневищах с корнями аскорбиновая кислота практически отсутствует.
Установлены морфолого - анатомические признаки цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета. Проведено исследование анатомического строения цветков, листьев и корневищ с корнями, выделены анатомо - диагностические признаки всех видов сырья первоцвета.
Научно-практическая значимость результатов исследования полученных результатов состоит в установлении диагностических признаков анатомического строения сырья первоцвета лекарственного цельного и измельченного. Выявлены диагностически значимые признаки при идентификации цветков, листьев и корневищ с корнями. На основании данных проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения сапонинов в цветках, листьях и корневищах с корнями. Исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья были использованы при разработки ФС на корневища и корни первоцвета для Государственной фармакопеи XII издания. Показано, что наиболее перспективным сырьем являются не листья, а трава первоцвета. На защиту выносятся:
Результаты исследований качественного состава и количественного определения углеводов в сырье первоцвета;
Данные по аминокислотному составу листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета;
Методики идентификации и количественного определения дубильных веществ в изучаемом сырье
Результаты выделения методом ВЭЖХ и установления химического состава флавоноидных соединения цветков и листьев первоцвета;
Методики идентификации и количественного определения флавоноидов в цветках и листьях первоцвета;
Методики идентификации и количественного определения сапонинов в цветках, листьях и корневищах с корнями первоцвета и результаты по количественному определению аскорбиновой кислоты в цветках и листьях.
Результаты по изучению диагностических признаков анатомического строения цветков. Листьев и корневищ с корнями и выявлению диагностически значимых признаков для идентификации сырья первоцвета.
Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на Научно-практической конференции «Стандартизация готовых лекарственных средств», Москва, 27.05.2011 г; XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Москва, 23-27 апреля 2012 года
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в постановке целей и задач настоящего исследования, их реализации, анализе и обобщение данных, изложении полученных результатов в виде научных публикаций. Автором лично произведен обзор литературы по данной теме, сделан научно-обоснованный выбор применяемых в работе методик идентификации и количественного определения присутствующих в сырье веществ. Разработана нормативно-техническая документация: проект ФСП на «Первоцвета лекарственного корневища с корнями» и «Первоцвета лекарственного трава».
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3, 5 и 6.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в НИИ Фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России в соответствии с тематикой и планом «Разработка научных основ технологии, стандартизации, организации производства и фармакоэкономики лекарственных средств». Номер регистрации: 01.2.009.07145.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 научных статьи в ведущих изданиях, входящих в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 182 странице машинописного текста, содержит 29 таблиц и 66 рисунков.
