Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Химический состав и применение в медицине лиственничной губки (обзор литературы)
1.1 Трутовые грибы. Симбиоз растений и грибов 13
1.2 Фармакогностические отличия трутовых грибов 14
1.3 Лиственничная губка (первые упоминания) 17
1.4 Описание, географическое распространение и химический состав лиственничной губки
1.5 Применение лиственничной губки в народной и традиционной медицине 20
1.6 Перспективы использования грибов класса Basidiomycetes 3
1.7 Методы выделения основных биологически активных веществ лиственничной губки
1.7.1 Анализ агарициновой кислоты 31
1.7.2 Методы получения и исследования липидов З 3
1.7.3 Методы анализа полисахаридов 3 6
1.8 Способы идентификации и установление строения биологически
активных веществ 37
Заключение по обзору литературы 40
Экспериментальная часть 41
Объекты и методы исследования 42
ГЛАВА 2 Анатомо-морфологическая идентификация и изучение химического состава лиственничной губки
2.1 Анатомо-морфологическая идентификация сырья лиственничной губки
2.2 Числовые показатели сырья лиственничной губки 54
2.3 Элементный состав лиственничной губки 56
2.4 Изучение химического состава лиственничной губки 59
2.4.1 Получение и разделение липидной фракции из лиственничной губки 59
2.5 Выделение, идентификация и количественное определение агарициновои кислоты, содержащейся в лиственничной губке 61
2.5.1 Способ получения агарициновои кислоты из лиственничной губки 61
2.5.2 Разработка методик идентификации агарициновои кислоты 63
2.5.3 Разработка методик количественного определения агарициновои кислоты 78
2.5.4 Валидация методики количественного определения агарициновои кислоты 86
Выводы по главе 2 94
Глава 3 Выделение, идентификация и количественное определение других БАВ лиственничной губки 95
3.1 Идентификация и количественное определение высших жирных кислот из смолистой фракции лиственничной губки 95
3.2 Получение и идентификация глюкозамина 99
3.3 Получение и идентификация полисахаридов 102
3.4 Изучение сроков годности сырья лиственничной губки
Выводы по главе 3 112
Глава 4 Изучение фармакологической и микробиологической активности агарициновои кислоты и суммарного извлечения из лиственничной губки
4.1 Получение суммарного извлечения из лиственничной губки 113
4.2 Определение острой токсичности агарициновои кислоты 114
4.3 Определение острой токсичности спиртового извлечения из лиственничной губки 116
4.4 Микробиологическое исследование агарициновои кислоты и суммарного извлечения из лиственничной губки 117
4.5 Фармакологическое изучение суммарного извлечения из 126
лиственничной губки
4.5.1 Изучение желчегонной активности 127
4.5.2 Изучение гастропротективного действия 130
4.5.3 Изучение гипогликемической активности 134
Выводы по главе 4 138
Общие выводы 139
Список литературы
- Фармакогностические отличия трутовых грибов
- Числовые показатели сырья лиственничной губки
- Получение и идентификация полисахаридов
- Определение острой токсичности спиртового извлечения из лиственничной губки
Введение к работе
Актуальность темы. Природные биологически активные вещества играют важную роль в современной медицине, благодаря ряду преимуществ перед синтетическими. Как правило, они действуют мягче, проявляют меньше побочных действий. В последние годы наряду с растительными объектами ученые многих стран обратили внимание на грибы. К числу таких объектов относится лиственничная губка, которая является дереворазрушающим базидиомицетом. Лиственничная губка (трутовик лекарственный – Fomitopsis officinalis Will, Laricis fungus), находит широкое применение в народной медицине многих стран. Водные настои используют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, нарушении обмена веществ, при тромбозах, заболеваниях эндокринной системы. Выявлено также применение вытяжек из лиственничной губки в качестве противовоспалительного, кровоостанавливающего, гипогликемического и желчегонного средства. В научной литературе приводятся данные об иммуностимулирующем действии лиственничной губки, о применении её в качестве средства улучшающего деятельность кроветворной системы, а также как метаболического средства при злокачественных заболеваниях. По данным других ученых экстракт из лиственничной губки возможно использовать при некоторых вирусных заболеваниях и туберкулезе. Можно предположить, что фармакологическое действие лиственничной губки объясняется содержанием большого количества биологически активных веществ. В лиственничной губке обнаружены агарициновая кислота, тритерпены, аминокислоты, органические кислоты, смолистые вещества и др.
Все вышесказанное позволяет сделать выводы, что лиственничная губка является ценным природным сырьем.
Однако для его внедрения в медицинскую практику необходимо решить многие вопросы. Прежде всего, следует определить основные группы биологически активных веществ, по которым возможно проведение стандартизации как самого сырья, так и полученных из него суммарных фитопрепаратов. Необходимо оценить методом скрининга наиболее ценные аспекты фармакологического действия.
Решение указанных вопросов позволит дать конкретные рекомендации по исследованию и использованию лиственничной губки. Поэтому изучение химического состава и стандартизация сырья лиственничной губки является актуальной задачей фармацевтической науки и практики.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение химического состава лиственничной губки, идентификация и количественное определение основных групп БАВ, содержащихся в плодовом теле лиственничной губки, и их предварительные фармакологические исследования.
Основные задачи исследования:
1. Изучить химический состав плодового тела лиственничной губки: выделить и идентифицировать основные группы биологически активных веществ, содержащиеся в лиственничной губке.
2. Разработать методы выделения, идентификации и количественного определения агарициновой кислоты, содержащейся в лиственничной губке.
3. Провести фармакологические и микробиологические испытания агарициновой кислоты и суммарного спиртового извлечения из лиственничной губки.
Научная новизна.
Проведено исследование химического состава лиственничной губки. Установлено, что плодовое тело лиственничной губки содержит смолистые вещества (48,5%), в том числе высшие жирные кислоты: пальмитиновая (8,8 %), олеиновая (0,1%), линолевая (5,2%), линоленовая (20,3%), арахидоновая (8,7 %), бегеновая (6,3 %); агарициновую кислоту (9,5%); полисахариды (7%), в том числе пектины (18%) и гемицеллюлозу (14%) и глюкозамин (2,8%).
Показано, что лиственничная губка может быть новым источником агарициновой кислоты. Разработан метод выделения агарициновой кислоты из лиственничной губки. Химическая структура выделенной агарициновой кислоты исследована путем сравнения ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии с достоверным стандартным образцом агарициновой кислоты (SIGMA – ALDRICH» № 666-99-9). Идентичность выделенной агарициновой кислоты со стандартным образцом подтверждена так же по совпадению физико-химических характеристик: значения Rf при проведении метода тонкослойной хроматографии, температуры плавления.
Установлено, что для идентификации и количественного определения основных групп биологически активных веществ возможно использование фармакопейных методов анализа. Определение высших жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии, полисахаридов и глюкозамина – гравиметрическим методом.
Изучена острая токсичность агарициновой кислоты и спиртового извлечения из лиственничной губки. Проведены фармакологические и микробиологические испытания спиртового извлечения и агарициновой кислоты, выделенных из данного гриба.
Практическая значимость результатов исследования.
Разработана методика выделения и идентификации агарициновой кислоты из сырья лиственничной губки. Показано, что лиственничная губка может быть новым источником агарициновой кислоты. Результаты изучения химического состава лиственничной губки могут быть положены в основу нормативной документации на сырье. Разработаны методики идентификации и количественного определения основных биологических активных веществ лиственничной губки.
Внедрение результатов исследования в практику. Работа выполнялась по договору с ООО «Алтайвитамины» г. Бийск. Имеется акт внедрения на способ получения суммарного фитопрепарата из плодового тела лиственничной губки, и о его фармакологических свойствах.
На основании результатов исследования разработан и зарегистрирован патент Российской Федерации № 2330676 от 10 августа 2008 г. на способ получения агарициновой кислоты из лиственничной губки.
Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных научно-практических конференциях по фармации в г. Пятигорске, по фармакологии - в г. Москве, на конкурсах молодых ученых в г. Ростове - на - Дону, на международном съезде в г. Санкт-Петербурге, в центральной печати г. Воронеж. По материалам исследований опубликовано 6 работ, в том числе патент РФ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.200101060).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц, 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 177 источника, в том числе 11 иностранных.
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Обоснование значимости сырья лиственничной губки для её изучения.
-
Результаты исследования химического состава лиственничной губки.
-
Способ выделения агарициновой кислоты из лиственничной губки.
-
Методики идентификации и количественного определения агарициновой кислоты, выделенной из лиственничной губки.
-
Результаты качественного и количественного анализа основных БАВ: жирных кислот, полисахаридов и глюкозамина, содержащихся в плодовом теле лиственничной губки.
-
Результаты изучения острой токсичности агарициновой кислоты и спиртового извлечения из лиственничной губки.
-
Результаты фармакологических и микробиологических испытаний спиртового извлечения и агарициновой кислоты, выделенных из лиственничной губки.
Фармакогностические отличия трутовых грибов
Лечебные свойства лиственничной губки известны давно. Еще 1000 лет назад Ибн Сина довольно подробно описал фармакологические свойства этого гриба (Ибн Сина, кн. II, с. 673—674). Первое упоминание о грибах встречается и в трудах великого врача Древней Греции Гиппократа и относится оно к V веку до нашей эры.
В середине XVI века в 1578 году ученый Клизиус завершил работу над «Кодексом Клизиуса» - полном собрании грибов, в котором есть первое упоминания об агариках (трутовиках). В труде Персоона - "Синопсис" (книга микологов) появилось упоминание о лиственничном агарике: «Все трубчатые и пластинчатые грибы именуются агариковыми в честь трутовика — агарика - лиственного гриба».
Еще в самых первых трудах Самуила Ганемана в 1796 г., посвященных гомеопатии, упоминалась горькая драстическая лиственничная губка Boletus Laricis [6].
На протяжение тысячелетий агариковую губку в Европе считали "эликсиром жизни". По мнению ученых-историков, река Берда, текущая в Приазовье близь Бердянской косы, 2 000 лет назад называлась Агорой, ее жители кифы- кочевники -агарами. Это был воинственный народ. Но агары не только воевали, но и вели торговлю с чужеземными купцами. В числе прочих товаров из Агарии в Грецию и Италию ввозились на кораблях сотни пудов лиственничного трутовика - агарика. Историкам удалось выяснить, где агары собирали лиственничную губку - они привозили этот гриб из сибирской тайги [7]. Великий таджикский медик Ибн Сина довольно точно воспроизвел описание гриба, славившегося своими чудодейственными свойствами. Лиственничная губка была хорошо известна и русским лекарям. Агариком в России лечили ушибы, астму, туберкулез и желтуху. В стране, где люди еще не имели представления о вате, из лиственничной губки делали лепешки, которые вываривали в чистой воде, а затем расплющивали их, отбивая деревянными молотками. Затем лепешки расщепляли спицами на тонкие, мягкие, эластичные волокна. Получались легкие комки, которые легко впитывали кровь и способствовали быстрому заживлению поврежденных участков кожи.
Отправляясь в походы воины русской армии брали с собой трутовиковую вату, использовали ее для обработки ран, в качестве антисептического и кровоостанавливающего средства. Во время Великой Отечественной войны в госпиталях для скорейшего заживления ран тоже использовалась трутовиковая вата. Из лиственничной губки и других грибов-трутовиков делали порошкообразные детские присыпки [8].
Во всем мире было изучено множество видов базидиальных грибов с целью поиска одного, в котором есть в оптимальных соотношениях все основные компоненты, обеспечивающие различные фармакологические свойства. В России изучением базидиомицетов занимаются в Сибирском государственном технологическом университете, целью их исследований является изучение биологических свойств и разработка методов культивирования, мицелия базидиомицетов [9].
Целью настоящего исследования явилось изучение химического состава лиственничной губки (плодового тела трутовика лекарственного), собранной в Алтайском крае, которая так же относится к базидиомицетам. 1.4 Описание, географическое распространение и химический состав лиственничной губки
Трутовик лекарственный (лиственничная губка, агарик) - Fomitopsis officinalis Will (Laricis fungus, Agaricus Albus, s. Boletus Laricis), семейство трутовиковые - Polyporaceae, род фомитопсис — Fomitopsis, класс базидиомицеты - Basidiomycetes, порядок афиллофоровые - Aphyllophorales, отдел эумикота (настоящие грибы) - Mycota, Fungi, под царство микобионта - Mycobionta [10].
Описание. Гриб, паразитирующий на стволах лиственниц (Pinus Larix, Larix Europaea) очень редко - на кедрах, пихтах и соснах. Состоит из мицелия, пронизывающего древесину, и плодового тела. Последнее копытообразное или удлиненное, почти цилиндрической формы, величиной 20—30 см, твердое плодовое тело многолетнее - (до 75 лет), 30 см в высоту, иногда достигают 40 см в диаметре и более килограмма весом. Белая поверхность плодового тела шероховатая, часто бугристая, покрыта тонкой твердой растрескивающейся коркой; края тупые, закругленные; ткань мягковата, со временем твердеет. Снизу шляпки гриба имеются слои трубочек, нарастающие ежегодно на 5-Ю см.
Географическое распространение. Ареал его совпадает с таковым лиственниц, то есть занимает всю лесную зону Сибири и доходит через Урал до Онежского озера: европейская часть России (Пермская, Свердловская и Кировская области), Сибирь и Дальний Восток. А так же в Европе (Альпы) и в Северной Америке. Наибольшие запасы лиственничной губки находятся в Восточной Сибири [11].
Используемые органы: плодовое тело, которое собирают весной и в первой половине лета, очищается от бурой твердой кожицы, высушивается на солнце и выколачивается молотом, после чего плодовое тело представляет собой бледновато-желтую, губчато - волокнистую массу, состоящую из смолистой, крупной войлочной ткани; вкус ее сначала сладковатый, потом - сильно - горький. Используют под названием Agaricus albus. Живет этот трутовик до 75 лет и достигает веса до 10 кг. Лечебными считаются не источенные насекомыми экземпляры, у которых под верхним желтым слоем несколько срезов имеют белую окраску [12].
Химический состав лиственничной губки в точности не выяснен. Обработкой эфиром Fleury (1870) выделил из нее аморфную красно-бурую смолу (57%) и агарициновую кислоту, кристаллизующуюся в виде пучка игл. Исследователь Jahns в 1883 г горячим спиртом извлек из лиственничной губки следующие биологически активные вещества: 16-18 % агарициновой кислоты в виде кристаллов без запаха и вкуса; 3-5% индифферентного кристаллизующего вещества, принадлежащего, по-видимому, к спиртам; 3-4% белого аморфного вещества, которое выделяется из растворов в виде студня, и 25-31% красной, аморфной, смолистой, горькой на вкус массы, носящей характер кислоты и, по-видимому, заключающей в себе составную часть лиственничной губки, действующей как слабительное.
Позже было установлено, что этот вид трутовых грибов является источником протеинов, витаминов, минералов, полисахаридов, тритерпеноидов, эргостеринов. Плодовое тело гриба содержит: до 18 % агарициновой кислоты (агарицин) С22Н40О7; эбуриколовую кислоту (С31Н50О3), фумаровую, рициноловую, лимонную и яблочную кислоты; более 30 % смол; жирное масло, фитостерин, глюкозу и маннит [10, 11, 13].
Числовые показатели сырья лиственничной губки
Объектом исследования была лиственничная губка, собранная на территории Алтайского края в период с 2004 по 2009 гг. Сырье собирали в условиях естественных фитоценозов, удаленных от промышленных предприятий и крупных автомагистралей. Заготовку и сушку сырья проводили согласно общепринятых правил.
Трутовик лекарственный (лиственничная губка, агарик) — Fomitopsis officinalis Will (Laricis fungus, Agaricus Albus, s. Boletus Laricis) семейства трутовиковых — Polyporaceae, класса базидиомицетов — Basidiomycetes [86, 87].
Гимениальный гриб, паразитирующий на стволах лиственниц (Pinus Larix, Larix Europaea). Состоит из мицелия, пронизывающего древесину, и плодового тела. Плодовое тело лиственничной губки копытообразное, удлиненное, почти цилиндрической формы, величиной 20—30 см, многолетнее, 30 см в высоту и более килограмма массой. Поверхность плодового тела белого цвета, с коричнево-бурыми зонами, шероховатая, покрыта тонкой твердой растрескивающейся коркой; края тупые, закругленные; внутренняя ткань тела мягкая, со временем твердеет. Снизу шляпки гриба имеются слои трубочек - гименофор. Полости трубочек выстланы спороносным слоем, на спороносцах которого развивается по 4 эллипсоидальные гладкие, бесцветные споры.
Фармакогностическая характеристика трутовика лекарственного: базидиомы многолетние, сидячие, одиночные, копытообразные или вытянутые вверх, почти цилиндрические, толстые, плотные и твёрдые, с возрастом ломкие, 3-10 х 5-20 х 4-40 см. Поверхность базидиомы шероховатая, концентрически-бороздчатая, с тонкой, сильно растрескивающейся коркой. Край тупой, закругленный, одного цвета с верхней поверхностью. Ткань крошащаяся и рыхлая, лёгкая, белая или желтоватая, горькая, с мучнистым запахом. Трубочки слоистые, одного цвета с тканью, 0,5-1,0 см длиной в каждом слое. Поверхность гименофора белая до буроватой. Поры округлые до угловатых, сначала с цельными, со временем становящимися разорванными краями, в среднем 3 -5 на 1 мм (иногда до 1 мм в диаметре) [88, 89].
Микроскопия. Один из основных анатомо-морфологических признаков лиственничной губки - это дгшитическая гифальная система. Генеративные гифы тонкостенные, гиалиновые, с перегородками и пряжками, слабо ветвящиеся, 2-4 мкм в диаметре. Скелетные гифы волнистые, длинные, толстостенные до сплошных, 2,5 -5,0 мкм в диаметре. В ткани имеются также сосудовидные, тонкостенные, часто извитые или ветвящиеся гифы с простыми перегородками, 6-13 мкм в диаметре, с сильно цианофильными стенками: Склереиды (сильно вздутые, толстостенные участки склеретных гиф) до 20 мкм в диаметре. Цистид и других стерильных элементов гимения нет. Базидии булавовидные, 4-х споровые, 20-25 х 6-8 мкм. Споры эллипсоидальные до яйцевидных, у основания приостренные, гиалиновые, изредка слегка желтоватые, 4,5 -6,5 х 3-4 мкм. Проведенное анатомо-морфологическое исследование может быть использовано для идентификации сырья плодового тела лиственничной губки.
Микроскопический и гистохимический анализ сырья лиственничной губки Целью микроскопического анализа явилось установление подлинности цельного и измельченного сырья лиственничной губки по микроскопическим диагностическим признакам. Микроскопический анализ заключался в выявлении характерных диагностических признаков, по которым изучаемое сырье лиственничной губки можно отличить от других видов базидиальных грибов. С помощью микроскопического анализа в совокупности с другими методами (макроскопическим, химическим, хроматографическим) можно достоверно установить подлинность объекта исследования. Подготовка образца для микроскопического анализа. Анализ плодового тела лиственничной губки начинали с внешнего осмотра, который проводили визуально или с помощью лупы (х 10) при дневном освещении. Затем готовили микропрепарат, рассматривали ,под микроскопом и определяли диагностические признаки. Микроскопические признаки определяли на поперечных и продольных срезах предварительно размягченного сырья в спирто-водно-глицериновой смеси или после просветления в 3% растворе натрия гидроксида. Рисунок 1 - Плодовое тело лиственничной губки Fomitopsis officinalis (Vill.)
Цельное сырье. Куски плодового тела лиственничной губки различной формы -размером до 20 см, очищенные от коры и смол лиственницы. Твердое плодовое тело древесного гриба многолетнее, сидячее, имеет копытообразную форму без ножки 30 см в высоту, иногда достигает 40 см в диаметре и более килограмма весом. Плодовое тело по форме латерально - (боковое) прикрепленное. Диаметр плодового тела колеблется в зависимости от погоды и состояния субстрата от 5 до 25 см, а масса от 0,5 до 3 кг. Поверхность плодового тела гриба морщинисто - борозчатая. Окраска верхней части тела гриба темно-коричнево-серая с тонкой растрескивающейся коркой, нижней поверхности - глинистого цвета. Ткань гриба плотная, твердая. Цвет ткани плодового тела на разрезе - кремовый, внутренний слой - от светло-желтого до молочного, с мелкими прожилками (рисунок 1). Консистенция плодового тела волокнистая. Запах сладко-приторный. Вкус водного извлечения горько-сладкий [88].
Измельченное сырье. Кусочки сырья, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Наружная поверхность базидиомы шероховатая, концентрически-бороздчатая, с бледными, беловатыми, желтыми и коричнево-бурыми зонами, иногда шишковатая, с тонкой, сильно растрескивающейся коркой. Край тупой, закругленный, одного цвета с верхней поверхностью. Внутренняя поверхность представлена мягковатой тканью в свежем состоянии, позднее твердеющая, крошащаяся и рыхлая, лёгкая (рисунок 2, А). Цвет белый или желтоватый. Запах мучнисто - сладковатый. Вкус водного извлечения горько-сладкий.
Сухое плодовое тело лиственничной губки перед работой размягчали с помощью кипячения, затем готовили давленый препарат.
Микроскопия. Испытание проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» [95, 96].
Цельное сырье. На поперечном срезе плодового тела лиственничной губки виден трубчатый гименофор, который ежегодно нарастает, проявляя слоистую структуру. Гименофор часто бывает желтоватого цвета, а при высушивании изменяется до коричневого. По форме гименофор трубчатый, состоит из длинных трубочек, плотно сросшихся боками (рисунок 2, Б). Трубочки слоистые, одного цвета с тканью, 0,5-1,3 см длиной в каждом слое. Поверхность гименофора белая до буроватой. Поры округлые до угловатых, сначала с цельными, со временем становящимися разорванными краями, в среднем 3 -5 на 1 мм (иногда до 1 мм в диаметре).
Получение и идентификация полисахаридов
По литературным данным известно, что в лиственничной губке содержатся различные виды полисахаридов. Из водной фракции лиственничной губки получали различные фракции полисахаридов [129].
Методика: 2,0 г измельченного сырья лиственничной губки заливали 30 мл воды очищенной и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Извлечение фильтровали и с фильтратом проводили следующие качественные реакции [130, 131]: 1) Реакция со спиртом этиловым. К 5 мл извлечения прибавляли 10 мл 95% спирта этилового. Наблюдали образование осадка. 2) Реакция с ацетоном. К 5 мл извлечения прибавляли 10 мл ацетона. Наблюдали образование аморфного осадка. Качественные реакции показали наличие полисахаридов в плодовом теле лиственничной губки. 102 Выделение и количественное определение полисахаридных фракций Нами была использована методика выделения различных групп полисахаридов, предложенная Кочетковым Н.К. и М. Sinner. Обезжиренную фракцию лиственничной губки исследовали на присутствие различных групп полисахаридов.
Методика: сухое сырье лиственничной губки (плодовое тело трутовика лекарственного) предварительно обрабатывали смесью растворителей (95% спирт этиловый - хлороформ, 2:1) для удаления пигментов, липидов и других веществ неуглеводного характера.
Для получения водорастворимых полисахаридов (ВРПС) использовали воздушно - сухой шрот сырья после экстракции неуглеводных компонентов. Около 20г (точная навеска) воздушно - сухого шрота заливали 50 мл воды очищенной трехкратно экстрагировали на водяной бане при 70С и постоянном перемешивании в течение 2-х часов. Полученные водные извлечения фильтровали, объединяли, сгущали и осаждали двойным объемом 96% спирта этилового, охлаждали при температуре 5С в течение 3-х часов. Раствор с выпавшим осадком центрифугировали с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 мин. Осадок промывали спиртом этиловым 96%, затем сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С, и взвешивали, получали ВРПС - фракция 1. Надосадочную жидкость упаривали при 50С до исчезновения следов спирта, затем высушивали до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С и взвешивали, получали порошок ВРПС - фракция 2.
Из шрота, оставшегося после получения ВРПС, выделяли пектиновые вещества -ПВ (протопектин - нерастворимый в воде пектин). Экстракцию сырья проводили 0,5% раствором аммония оксалата по 50мл трехкратно на водяной бане при 70С по 2 часа. Извлечение фильтровали и ПВ осаждали однократным объемом спирта этилового 96%. Раствор центрифугировали с частотой1 вращения 5000 об/мин в течение 10 мин.
Полученный осадок промывали спиртом этиловым 96%, сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С и взвешивали - фракция 3.
Из шрота, оставшегося после выделения ПВ, выделяли гемицеллюлозу (ГЦ). Экстракцию проводил 5% раствором натрия гидроксида в течение 5 часов при комнатной температуре. Извлечение фильтровали через тройной слой марли, доводили до рН 4,5 уксусной кислотой ледяной. Осадок ГЦ Ai отделяли центрифугированием, сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С и взвешивали — фракция 4. Надосадочную жидкость упаривали до 30 мл, и получали осадок ГЦ А2 добавлением трехкратного объема спирта этилового 96% , осадок сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С, взвешивали - фракция 5.
Остаток сырья после выделения ГЦ А подвергали экстракции 10% раствором натрия гидроксида в течение 2-х часов при комнатной температуре. Извлечение фильтровали через тройной слой марли, доводили до рН 4,5 уксусной кислотой ледяной. Осадок ГЦ Бг отделяли центрифугированием, сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С, взвешивали - фракция 6.
К надосадочной жидкости добавляли трехкратный объем спирта этилового 96%, получали осадок ГЦ Б2, который сушили до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С, взвешивали - фракция 7.
Оставшийся шрот сырья обрабатывали 72% кислотой серной, оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Затем добавляли воду очищенную в соотношении 1:15 и проводили гидролиз в течение 5 часов на кипящей водяной бане. Остаток сырья после гидролиза фильтровали через стеклянный фильтр, высушивали до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50С и взвешивали, получали лигнин и минеральные вещества - фракция 8 .
Определение острой токсичности спиртового извлечения из лиственничной губки
Как видно из табл.30, количество жёлчи у крыс в группе, получавшей циквалон, достоверно увеличивалось (относительно контрольной группы животных) начиная с третьего часа эксперимента. Далее до окончания опыта достоверность различий между этими группами сохранялась. Соответственно количество выделенной жёлчи в группе с циквалоном и контрольной на 1-й час составляло 0,32±0,02 и 0,30±0,03; на 2-й час-0,58±0,04 и 0,52±0,03 (Р 0,05); на 3-й час-1,36±0,05 и 0,97±0,04 (Р 0,05);на 4-й час-1,54±0,06 и 1,34±0,06 (Р 0,05); на 5-й час 1,76±0,05 и 1,52±0,06 (Р 0,05).
В группе, получавшей суммарное извлечение в дозе 40 мг/кг уже через два часа после начала эксперимента наблюдалось достоверное увеличение жёлчеотделения относительно контроля. Соответственно количество выделенной жёлчи в группе с суммарным извлечением и контрольной группе к 1-ому часу составляло 0,33±0,05 и 0,30±0,03 (Р 0,05); на 2-й час-0,67±0,05 и 0,52±0,03 (Р 0,05); на 3-й час-1,51±0,07и 0,97±0,04 (Р 0,05);на 4-й час-1,68±0,07и 1,34±0,06 (Р 0,05); на 5-й час 1,85±0,06 и 1,52±0,06мл(Р 0,05).
В группе животных, получавших суммарное извлечение в дозе 40 мг/кг по отношению к группе, получавшей циквалон, наблюдалась более выраженная тенденция к увеличению жёлчевыделения. Причем достоверные различия между показателями в этих группах наблюдались уже к третьему часу от начала эксперимента. Соответственно количество выделенной жёлчи в группе с суммарным извлечением и группе с циквалоном на 1-й час составляло 0,33±0,05и 0,32±0,02 (Р, 0,05); на 2-й час-0,67±0,05 и 0,58±0,04 (Р, 0,05); на 3-й час-1,51±0,07 и 1,36±0,05 (Р] 0,05);на 4-й час-1,68±0,07 и 1,54±0,06 (Р, 0,05); на 5-й час 1,85±0,06 и 1,76±0,05 мл (Рі 0,05).
Таким образом, суммарное извлечение из лиственничной губки в дозе 40 мг/кг массы животных оказывает желчегонное действие, достоверно превышающее действие циквалона в дозе 30 мг/кг.
Язвенное поражение желудка остается важной медицинской и социально-экономической проблемой современного общества. В настоящее время произошло признанное разграничение понятий: язвенная болезнь как общее заболевание с локальным морфологичесішм выражением (язва) в желудке и 12-перстной кишке, и симптоматические гастродуоденальные язвы. Они возникают как один из вторичных симптомов различных заболеваний, осложняя их, или в результате острых экстремальных ситуаций. Предложено большое количество теорий ульцерогенеза, наиболее признанными из которых являются сосудистая, гормональная, неврогенная. В настоящее время язвенную болезнь рассматривают как заболевание, в большинстве случаев вызванное Helicobacter pylori.
В народной медицине лиственничная губка используется в виде отвара при заболеваниях желудочно-кишечного тракта: при гастрите, диспепсии, плохом пищеварении, как противовоспалительное и кровоостанавливающее средство. При изучении химического состава биологически активных веществ лиственничной губки выявлено наличие следующих соединений: полисахаридов, смолистых и дубильных веществ, а так же агарициновой и других кислот.
Целью данной части работы явилось изучение гастропротективных свойств суммарного извлечения из лиственничной губки на геликобактерподобной модели язвообразования.
Эксперименты проводили- на крысах-самках массой 240-250г. За одни сутки до проведения исследования животных лишали доступа к пище без ограничения. потребления-воды. Опытным,животным интрагастрально с помощью зонда вводили 1 мл раствора аммония гидроксида, в диапазоне концентраций от 100 до 600ммоль/л. Контрольной группе вводили дистиллированную воду в адекватных объемах. Через 1 час после введения раствора аммония гидроксида крыс декапитировали, желудки извлекали, разрезали по продольной оси и промывали физиологическим раствором. Размеры язвенных поражений СОЖ (слизистой оболочки желудка) измеряли при помощи линейки под бинокулярной лупой при 10 кратном увеличении. Для количественного описания степени поражения СОЖ определяли количество эрозий на одно животное и общую площадь поражения в мм /животное.
Опыты показали, что наиболее яркое повреждение желудка наблюдается при концентрации аммония гидроксида 300 ммоль/л. Дальнейшее повышение концентрации приводило к тотальному геморрагическому поражению слизистой оболочки желудка, при которой оценка гастропротекторных свойств изучаемых веществ была невозможна. Концентрации аммония гидроксида ниже 300 ммоль/л давала более слабо выраженное повреждение. Поэтому за критерий оптимальной дозы нами была выбрана концентрация аммония гидроксида составляющая 300 ммоль/л.
В предварительных опытах на ограниченном числе животных (по 2 особи в группе) нами были проведены скрининговые эксперименты с целью выявления оптимальной дозы суммарного извлечения из лиственничной губки для данной модели язвенного поражения. Изучали дозы со следующим шагом: 10-30-60-120 мг/кг массы животных. Плато действия наступало при дозе 60 мг/кг массы. Дальнейшее увеличение дозы не приводило к усилению гастропротективной активности. Суммарное извлечение из лиственничной губки вводили в дозе 60 мг/кг перорально через зонд в течение 5 дней до введения аммония гидроксида (100, 300 и 600 ммоль/л).
